張 帥，李 敏，閆 帥，朱江峰，徐姍楠，陳作志

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部外海漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海 201306；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（廣州），廣東廣州 511548）

多鱗四指馬鲅Eleutheronema rhadinum 和四指馬鲅E.tetradactylum 均隸屬于馬鲅科Polynemidae 四指馬鲅屬Eleutheronema。2002 年，MOTOMURA,et al[1]根據(jù)胸鰭鰭膜顏色、有孔側(cè)線鱗數(shù)和側(cè)線上下鱗數(shù)等形態(tài)特征，將多鱗四指馬鲅從四指馬鲅中分離出來，定為另一個有效種。多鱗四指馬鲅是東亞特有種，主要分布于中國的東海和南海，越南北部和日本南部偶有發(fā)現(xiàn)；四指馬鲅的分布范圍廣，涵蓋印度洋的波斯灣到西太平洋的巴布亞新幾內(nèi)亞和澳大利亞北部[1-3]。

多鱗四指馬鲅和四指馬鲅均為近海中上層魚類，生長速度快，一齡魚叉長即可達(dá)30 cm[1,4]。兩者均因其肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，是十分名貴的經(jīng)濟(jì)魚類。與其他馬鲅科魚類似，均為雌雄同體雄性先熟[2]。多鱗四指馬鲅為與四指馬鲅的生態(tài)學(xué)特征也基本相似，喜棲息于底質(zhì)為沙底的近岸淺灘和渾濁水域，很少進(jìn)入較深的海洋中[2,4]。多鱗四指馬鲅主要依賴于野外捕撈，而四指馬鲅已實(shí)現(xiàn)人工化養(yǎng)殖。

目前，關(guān)于多鱗四指馬鲅的研究主要集中于分類學(xué)[1-2]、生物學(xué)[5-6]、魚類浮游生物[7-8]和種群遺傳結(jié)構(gòu)[9-12]等。然而關(guān)于其種群遺傳結(jié)構(gòu)尚無定論且均為單一分子標(biāo)記，如楊陽等[10]基于AFLP 技術(shù)發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅不同地理群體存在一定的遺傳分化，而鄧春興[11]基于COI 的研究發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅為單一種群結(jié)構(gòu)。因此，本文結(jié)合常用的線粒體分子標(biāo)記COI 和進(jìn)化速率最快的線粒體分子標(biāo)記D-loop，以東海和南海的多鱗四指馬鲅以及南海的四指馬鲅作為研究對象，探究兩者的種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，驗(yàn)證COI 和Dloop 用于區(qū)分這2 種魚的可行性，以期為這2 種漁業(yè)資源的保護(hù)和利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

樣本從當(dāng)?shù)貪O民或市場購買，冷凍寄回實(shí)驗(yàn)室（廣州），-20 ℃保存。采集時間為2019 年秋季（9 月至12月），共采集多鱗四指馬鲅85 尾。采樣點(diǎn)包括東海的福州（FZ）和泉州（QZ），以及南海的珠海（ZH），同時在徐聞（XW）采集未知來源的野生四指馬鲅30 尾，具體采樣信息如圖1 和表1。

表1 多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的采樣信息及遺傳多樣性指數(shù)Tab.1 Sampling information and genetic diversity parameters of E.rhadinum and E.tetradactylum

圖1 多鱗四指馬鲅與四指馬鲅采樣點(diǎn)Fig.1 Sampling sites of E.rhadinum and E.tetradactylum in south China

1.2 線粒體標(biāo)記的獲取

剪取魚體背部肌肉組織15～30 mg，采用海洋動物組織基因組DNA 提取試劑盒（天根）提取總DNA，-40 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

參考四指馬鲅線粒體基因全序列（GenBank 登錄號：NC＿021620.1），設(shè)計并篩選出擴(kuò)增2 種目標(biāo)魚類線粒體COI 和D-loop 基因序列的引物。線粒體COI 序列的擴(kuò)增引物為ERCO1385-F：5′-GTTATCGTTACCGCACAT-3′和ERCO1385-R：5′-GTCAGCATTCGGATTTGG-3′。PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL，依照KOD FX 酶（Toyobo，廣州）的使用說明確定各組分的濃度。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性2 min；98 ℃，變性10 s，48 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸84 s，35 個循環(huán)；68 ℃，延伸7 min。線粒體D-loop 序列的擴(kuò)增引物為ERCR942-F：5′-TGTAAACCGGTTGTCGGAGG-3′和ERCR942-R：5′-GACCAAGCCTTTGTGCTTGC-3′。PCR 反應(yīng)體系同線粒體COI 序列的反應(yīng)體系。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，預(yù)變性2 min；98 ℃，變性10 s，55 ℃，退火30 s，68 ℃，延伸56 s，35 個循環(huán)；68 ℃，延伸7 min。

PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送華大基因進(jìn)行雙向測序，測序引物同擴(kuò)增引物。

1.3 數(shù)據(jù)分析

獲得2 種線粒體標(biāo)記序列后，采用軟件SeqMan 拼接正反序列，根據(jù)峰圖進(jìn)行人工校正。采用軟件BioEdit 3.3[13]編排序列，并進(jìn)行格式轉(zhuǎn)換。采用軟件MEGA 6.0[14]對序列進(jìn)行多重排列比對，參數(shù)設(shè)置為程序默認(rèn)值，手動去除序列首尾使得序列長度均一。為分析徐聞采集的四指馬鲅的來源，從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載馬來西亞海域四指馬鲅COI 序列進(jìn)行分析，序列登記號為MG81629-MG81638。

采用軟件MEGA 6.0 基于最大似然法篩選出最適模型和Gamma（G）值，線粒體COI 標(biāo)記篩選結(jié)果為Kimura 2-parameter 模型（K2），線粒體D-loop 標(biāo)記篩選結(jié)果為Tamura 3-parameter（TN92，G=0.33）；分別采用最佳模型，基于鄰接法構(gòu)建單倍型系統(tǒng)進(jìn)化樹，可靠性經(jīng)500 次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)；基于相應(yīng)模型計算物種間的平均遺傳距離。采用軟件DnaSP 5.10[15]對不同地理群體進(jìn)行分組，并采用軟件Arlequin 3.5[16]計算不同地理群體的遺傳多樣性指數(shù)，包括單倍型數(shù)、多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)、單倍型多樣性和核苷酸多樣性等。采用軟件PopART 1.7[17]構(gòu)建單倍型中間網(wǎng)絡(luò)連接圖[18]，并手動調(diào)整單倍型相對位置。

采用軟件Arlequin 3.5 進(jìn)行分子方差分析（AMOVA），檢測群體變異水平與不同組間的差異顯著性；遺傳結(jié)構(gòu)協(xié)方差的顯著性通過10 000 次重復(fù)抽樣來檢驗(yàn)，并計算兩兩群體間的遺傳分化系數(shù)（FST）；采用Exact test分析種群分化程度，通過抽樣來檢驗(yàn)顯著性（10 000 次重復(fù)和100 000 馬爾科夫鏈步驟）；采用TAJIMA′s[19]的D 檢驗(yàn)和FU′s[20]的Fs 檢驗(yàn)來檢測種群進(jìn)化是否遵循中性理論；采用核苷酸錯配分布分析判斷群體是否存在時空擴(kuò)張。

通過T=t*代時公式來估算群體擴(kuò)張時間，代時參照四指馬鲅[2]，取2 年，t 為擴(kuò)張以來所經(jīng)歷的代數(shù)。代數(shù)通過公式t=τ/2u 計算，其中τ 為擴(kuò)張時間參數(shù)，由軟件Arlequin 計算獲得，u 為序列的突變速率（u=2 μk，μ 表示每個核苷酸位點(diǎn)的突變速率，k 表示目的片段長度），COI 和D-loop 核苷酸突變速率分別取每百萬年1%～3%[21]和5%～20%[22]。

2 結(jié)果

2.1 序列特征

多鱗四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列擴(kuò)增長度分別為1 289 bp 和795 bp，樣本量分別為73 尾和85 尾。四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列擴(kuò)增長度分別為1 289 bp 和890 bp，樣本量均為30 尾。在多鱗四指馬鲅中，COI 序列共檢測到多態(tài)性位點(diǎn)32 個，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)30 個，顛換位點(diǎn)2 個，D-loop 序列共檢測到多態(tài)性位點(diǎn)176 個，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)159 個，顛換位點(diǎn)18 個以及20 個缺失突變。在四指馬鲅中，COI 序列共檢測到多態(tài)性位點(diǎn)16 個，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)14 個，顛換位點(diǎn)2 個，D-loop 序列共檢測到多態(tài)性位點(diǎn)76 個，轉(zhuǎn)換位點(diǎn)61個，顛換位點(diǎn)3 個以及14 個缺失突變。

所得序列的平均堿基組成均呈反G 偏移，如多鱗四指馬鲅COI 和D-loop 序列的堿基G 含量分別為20.7%和14.8%，四指馬鲅COI 和D-loop 序列的堿基G 含量分別為20.0%和13.8%，該現(xiàn)象符合大多數(shù)脊椎動物線粒體DNA 的特征。

2.2 遺傳多樣性

由表1 可知，所有多鱗四指馬鲅COI 和D-loop 序列的單倍型數(shù)分別為28 個和73 個，個體特異單倍型數(shù)分別為20 個（占比71.4%）和65 個（占比89%）。四指馬鲅COI 和D-loop 序列的單倍型數(shù)分別為15 個和29 個，個體特異單倍型數(shù)分別為11 個（占比73.3%）和29 個（占比96.7%）。

由表1 可知，多鱗四指馬鲅2 個線粒體標(biāo)記均呈現(xiàn)高的單倍型多樣性（COI：0.894;D-loop：0.994）和較低的核苷酸多樣性（COI：0.002;D-loop：0.041）。四指馬鲅2 個線粒體標(biāo)記也均呈現(xiàn)高的單倍型多樣性（COI：0.901;D-loop：0.998）和較低的核苷酸多樣性（COI：0.002;D-loop：0.012）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和種群遺傳結(jié)構(gòu)

由多鱗四指馬鲅COI 序列的單倍型網(wǎng)絡(luò)連接圖（圖2-A）和系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，多鱗四指馬鲅不同地理群體的單倍型交錯在一起，呈星狀發(fā)射結(jié)構(gòu)，沒有明顯的譜系分化?；贒-loop 序列與COI 序列的研究結(jié)果基本一致（圖2-B 和圖3）。但D-loop 序列結(jié)果可能由于單倍型多樣性高，分布較為分散，星狀發(fā)射結(jié)構(gòu)不明顯。以上結(jié)果說明中國東海和南海的多鱗四指馬鲅為單一種群遺傳結(jié)構(gòu)。

圖2 基于多鱗四指馬鲅線粒體COI 和D-loop 序列的單倍型中間網(wǎng)絡(luò)連接圖Fig.2 Haplotype median-joining network for E.rhadinum based on mtDNA COI（A）and D-loop（B）gene sequences

通過種間遺傳距離可知，多鱗四指馬鲅和徐聞未知來源四指馬鲅具有較大的遺傳差異（COI,0.071;Dloop,0.501），其中D-loop 序列的遺傳差異明顯高于COI 序列。結(jié)合多鱗四指馬鲅和徐聞未知來源四指馬鲅的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可知，多鱗四指馬鲅與四指馬鲅可明顯分為2 支，且遺傳分化顯著（表2），說明本研究設(shè)計的2 種線粒體標(biāo)記可用于區(qū)分這兩個近緣物種。

同時，結(jié)合馬來西亞四指馬鲅樣本COI 序列的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）可以發(fā)現(xiàn)，徐聞未知來源的四指馬鲅樣本與馬來西亞樣本完全聚合在一支，說明該未知來源樣本與馬來西亞群體的親緣關(guān)系近。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的多鱗四指馬鲅和四指馬鲅線粒體D-loop（上）和COI（下）序列的單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Neighbour-joining tree for mtDNA COI and D-loop haplotypes of E.rhadinum and E.tetradactylum

由表2 可知，多鱗四指馬鲅COI 標(biāo)記的3 個地理群體間均無顯著遺傳分化（P＞0.05），兩兩群體的遺傳分化系數(shù)在-0.027 51～-0.008 97 之間；D-loop 標(biāo)記的3 個地理群體間也均無顯著遺傳差異（P＞0.05），兩兩群體的遺傳分化系數(shù)在-0.030 14～-0.017 06 之間。以上結(jié)果表明中國沿海的多鱗四指馬鲅為單一種群遺傳結(jié)構(gòu)。

表2 多鱗四指馬鲅兩兩地理群體間及與四指馬鲅的遺傳分化系數(shù)（FST）Tab.2 Pairwise genetic distance（FST）among geographical populations of E.rhadinum and compared with E.tetradactylum

中國南海和東海多鱗四指馬鲅分子方差分析結(jié)果顯示（表3），該物種的遺傳變異（COI，102.83%；D-loop，103.1%）均來自種群內(nèi)，且組間、組內(nèi)和種群內(nèi)遺傳分化均不顯著（P＞0.05）。表明中國南海和東海的群體為隨機(jī)交配群體。

表3 多鱗四指馬鲅不同地理群體遺傳變異的分子方差分析Tab.3 Analysis of molecular variance of geographical populations of E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

2.4 群體歷史動態(tài)

多鱗四指馬鲅COI 序列和D-loop 序列的核苷酸錯配分布和中性檢驗(yàn)結(jié)果如表4 所示，可知中國沿海群體的核苷酸錯配分布符合快速擴(kuò)張模型和空間擴(kuò)散模型的假設(shè)（P＞0.05）。由中性檢驗(yàn)結(jié)果可知，TAJIMA’s D值均為負(fù)值，僅福州具有顯著性（COI，P＜0.05），F(xiàn)U’s Fs 值均為負(fù)值，且都具有顯著性（P＜0.05）。

表4 多鱗四指馬鲅核苷酸錯配分布的參數(shù)估計值和中性檢驗(yàn)的統(tǒng)計值Tab.4 Mismatch distribution parameter estimates and neutrality tests statistics for E.rhadinum based on mtDNA COI and D-loop gene sequences

由2 種序列的核苷酸錯配分布圖（圖4）可知，COI 序列的錯配分布圖在單個群體中以及所有群體中均為單峰型，但D-loop 序列的錯配分布圖均具一明顯的較高單峰，同時有2～3 個小峰。

圖4 基于線粒體COI（A～D）和D-loop（E～H）序列的多鱗四指馬鲅核苷酸錯配分布圖Fig.4 The observed pairwise differences and the expected mismatch distributions under the sudden expansion model and the spatial expansion model for the mtDNA COI（A-D）and D-loop（E-H）haplotypes

通過軟件Arlequin 計算獲得多鱗四指馬鲅COI 序列和D-loop 序列的擴(kuò)張時間參數(shù)（τ）分別為1.852 和49.066，估算得出中國沿海多鱗四指馬鲅的群體擴(kuò)張時間分別為（2.4～7.2）萬年前和（15.4～61.7）萬年前。

3 討論

3.1 群體擴(kuò)張時間

通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)，COI 和D-loop 標(biāo)記都可以區(qū)分多鱗四指馬鲅和四指馬鲅這2 個形態(tài)近似魚種。研究發(fā)現(xiàn)多鱗四指馬鲅和四指馬鲅的分化時間在4.778 百萬年前[23-24]至54.3 百萬年前[25]，分歧時間較為久遠(yuǎn)。而本研究選取的2 種線粒體標(biāo)記突變速率高，遺傳變異較大，適用于對這2 種魚進(jìn)行分子區(qū)分。已開發(fā)用于鑒定這2 個物種的標(biāo)記包括Cytb[12]、16S rRNA[12]、形態(tài)特征標(biāo)記[26]、SNP 標(biāo)記[26]和SCAR 標(biāo)記[27]等。對未知來源四指馬鲅的鑒定和溯源也驗(yàn)證了這2 種標(biāo)記的有效性。因此，本研究拓展了鑒定多鱗四指馬鲅與四指馬鲅的分子標(biāo)記位點(diǎn)，可應(yīng)用于未知來源樣本的鑒定和溯源。

3.2 多鱗四指馬鲅的遺傳多樣性和歷史動態(tài)

遺傳多樣性是魚類適應(yīng)環(huán)境和生存能力的重要基礎(chǔ)。多鱗四指馬鲅是我國近海的重要經(jīng)濟(jì)魚類，關(guān)于其漁業(yè)資源狀況尚無文獻(xiàn)報道。對比以往對東海四指馬鲅的研究發(fā)現(xiàn)，本研究樣本的單倍型多樣性更高（0.89 vs.0.50～0.78）[28]，可能是由于本研究涵蓋了南海的樣本以及擴(kuò)增的COI 序列長度更長（1 289 bp vs.627 bp）。多鱗四指馬鲅與其近緣物種的單倍型多樣性較為接近，如本研究采集的四指馬鲅為0.90，澳大利亞報道的四指馬鲅為0.87[29]。多鱗四指馬鲅的核苷酸多樣性也與本研究的四指馬鲅（0.02 vs.0.02）一致，但高于澳大利亞的四指馬鲅（0.007 2）。因此，本研究結(jié)果顯示多鱗四指馬鲅具有較高的遺傳多樣性。

多鱗四指馬鲅的遺傳多樣性指數(shù)呈現(xiàn)高單倍型多樣性和低核苷酸多樣性特征，這是種群曾經(jīng)歷快速擴(kuò)張的典型特征[30]，普遍存在于中國近海魚類，如黑鯛Acanthopagrus schlegelii[31]、短尾大眼鯛Priacanthus macracanthus[32-33]和日本鯖Scomber japonicus[34]等。中性檢驗(yàn)的FU's Fs 檢驗(yàn)結(jié)果（P＜0.05）和COI 的核苷酸錯配分布圖（單峰模式）也支持這一結(jié)論。這可能是由于更新世冰期和間冰期的交替出現(xiàn)，冰期導(dǎo)致棲息地減少，海洋魚類區(qū)域性滅絕，而間冰期棲息地增加，海洋魚類又重新擴(kuò)張。在快速擴(kuò)張時期，單倍型多樣性快速增加，但是核苷酸多樣性由突變速率決定，短時間內(nèi)難以積累足夠的核苷酸多樣性。然而，TAJIMA's D（P＞0.05）以及D-loop 的錯配分布圖（多峰模式）并不支持種群快速擴(kuò)張模型，這可能需要進(jìn)一步的研究。綜上，多鱗四指馬鲅群體可能偏離中性理論下的Wright-Fisher 模型，群體歷史在時空尺度上可能經(jīng)歷過快速擴(kuò)張。

基于不同標(biāo)記的多鱗四指馬鲅群體擴(kuò)張時間之間有較大差異，COI 標(biāo)記估算的擴(kuò)張時間為（2.4～7.2）萬年前，而D-loop 標(biāo)記的估算結(jié)果則為（15.4～61.7）萬年前。鄧春興等[11]基于COI 標(biāo)記估算的多鱗四指馬鲅群體擴(kuò)張時間為6.1 萬年前，與本研究相同標(biāo)記的結(jié)果基本吻合。對其他魚類的研究也存在這一現(xiàn)象，如對短尾大眼鯛Cytb 和D-loop 標(biāo)記估算的群體擴(kuò)張時間分別為11 萬年前[33]和（1.7～5.6）萬年前[32]，對棘頭梅童魚COI 和D-loop 標(biāo)記估算的群體擴(kuò)張時間分別為7 萬年前[35]和3.8～12.9 萬年前[36]。同時，由于中國沿海魚類受到更新世冰期和間冰期的影響，同域分布的不同種魚類群體擴(kuò)張時間存在較大差異，如褐菖鲉Sebastiscus marmoratus 群體擴(kuò)張時間為（26.8～44.8）萬年前[37]、中國鯧Pampus chinensis 群體擴(kuò)張時間為（11.7～16.9）萬年前[38]以及花斑蛇鯔Saurida undosquamis 群體擴(kuò)張時間為（4～10）萬年前[39]等。但是對于多鱗四指馬鲅不同分子標(biāo)記對群體擴(kuò)張時間估算的影響以及不同物種間擴(kuò)張時間的差異，可能是由于物種分布范圍很小（僅分布于中國的東海和南海）或者可能是種群擴(kuò)張的時間過短造成的。

3.3 多鱗四指馬鲅的種群遺傳結(jié)構(gòu)

由于多鱗四指馬鲅游泳能力強(qiáng)且具有遷移洄游習(xí)性，東海和南海之間也缺乏明顯的地理屏障，即使在更新世冰期，南海也能通過巴士海峽與太平洋相連[40-41]。多鱗四指馬鲅的單倍型中間網(wǎng)絡(luò)連接圖、系統(tǒng)發(fā)育樹以及分子方差分析結(jié)果顯示，東海和南海群體基因交流頻繁，為單一種群結(jié)構(gòu)。雖然基于AFLP 標(biāo)記和魚體形態(tài)特征的研究發(fā)現(xiàn)，中國沿海的多鱗四指馬鲅已產(chǎn)生一定程度的分化[9-10]，但是分化程度并不顯著。因此，中國沿海的多鱗四指馬鲅可作為單一種群進(jìn)行管理和開發(fā)。

4 總結(jié)

中國沿海的多鱗四指馬鲅具有較高的遺傳多樣性，為單一種群結(jié)構(gòu)，且可能經(jīng)歷過種群的快速擴(kuò)張。本研究采樣時間和采樣批次過于集中，樣本數(shù)量也偏少，采樣群體可能無法代表整個種群狀況。這是由于多鱗四指馬鲅的捕撈量較為稀少，價格昂貴，且漁汛期十分集中，因此樣本十分珍貴。同時，鑒于不同分子標(biāo)記的研究結(jié)果之間存在較大的差異，如遺傳多樣性和群體擴(kuò)張時間，可能需要采用分辨率更高的分子標(biāo)記（如單核苷酸多態(tài)性）以及擴(kuò)大采樣的時空跨度，以期更加準(zhǔn)確地闡明該物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)，為該漁業(yè)資源管理的開發(fā)和利用提供更加科學(xué)的基礎(chǔ)資料。