夏立萍，顏成瑞，朱愛(ài)意，葉瑩瑩

（浙江海洋大學(xué)國(guó)家海洋設(shè)施養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，浙江舟山 316022）

方斑東風(fēng)螺Babylonia areolata 簡(jiǎn)稱東風(fēng)螺，俗稱花螺，隸屬于腹足綱Gastropods，新腹足目Neogastropoda，蛾螺科Buccinidae，東風(fēng)螺屬Babylonia[1]。我國(guó)主要在福建、海南、廣西和廣東等省的沿海地區(qū)大量分布，是我國(guó)分布的幾種東風(fēng)螺中生長(zhǎng)較快、個(gè)體較大、抗病能力強(qiáng)的一種優(yōu)質(zhì)貝類[2]。方斑東風(fēng)螺因其外殼鮮艷漂亮、肉質(zhì)肥厚、口味鮮美，在海產(chǎn)品市場(chǎng)上占據(jù)很大份額。但最近這幾年，由于市場(chǎng)需求量增加和過(guò)度捕撈，方斑東風(fēng)螺的自然生存數(shù)量開(kāi)始銳減[3-4]。因此，通過(guò)遺傳育種，遺傳改良，評(píng)估方斑東風(fēng)螺遺傳多樣性水平對(duì)其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，分子標(biāo)記作為物種鑒定及遺傳多樣性研究的常用方法已被廣泛應(yīng)用，如線粒體COI 基因、16S rRNA 基因、Cytb 基因和D-Loop 基因序列已被廣泛應(yīng)用到貝類[5-6]、甲殼動(dòng)物[7]和魚類中[8]。在方斑東風(fēng)螺中，蘇天鳳[9]運(yùn)用PCR 擴(kuò)增技術(shù)，基于COI 基因和16S rRNA 基因?qū)Σ勺圆煌貐^(qū)的方斑東風(fēng)螺進(jìn)行序列分析。結(jié)果分析顯示COI 基因序列相比16S rRNA 基因序列而言更適用于東風(fēng)螺種群的遺傳多樣性分析。目前現(xiàn)有的研究中很少有將線粒體基因與核糖體基因序列結(jié)合應(yīng)用于方斑東風(fēng)螺遺傳多樣性的研究中，而線粒體Cytb 基因又是一個(gè)包含變異性和保守性雙重特性的一段DNA 序列區(qū)段[10-11]，適用于研究物種遺傳分化、種群遺傳結(jié)構(gòu)的分子標(biāo)記方法，因此本研究將線粒體Cytb 基因與核糖體ITS 基因結(jié)合來(lái)進(jìn)一步探討方斑東風(fēng)螺在我國(guó)南海4 個(gè)種群的遺傳結(jié)構(gòu)具有重要研究意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和DNA 提取

本研究所用的方斑東風(fēng)螺樣品采集于4 個(gè)沿海地區(qū)：廣東湛江（ZJ）、福建廈門（XM）、廣西北海（BH）和海南?？冢℉K）。所有樣本參照改良鹽析法提取基因組DNA[12]，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其純度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 線粒體Cytb 和核糖體ITS 序列PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

參照NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中方斑東風(fēng)螺線粒體基因組序列（NC-023080.1）設(shè)計(jì)擴(kuò)增Cytb 的基因序列的引物，引物序列如下：CytbF2：5’-ATCGGGTTAGCAGTTATTCT-3’，CytbR2：5’-GAGCATTGGTCTTGTAAGTC-3’；ITS 基因采用通用引物，序列如下：ITS3：5’-GCATCGATGAAGAACGCAG,ITS28：5’-CGCCGTTACTAGGGGAATCCTTGTAAG-3’[13]。PCR 擴(kuò)增條件均為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，51 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸90 s，35 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，交由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

通過(guò)ClustalX 2.1 對(duì)測(cè)序獲得的Cytb 和ITS 序列進(jìn)行比對(duì)矯正，并對(duì)齊全部序列片段。為鑒定物種和所得片段的準(zhǔn)確位置，使用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中在線BLAST 工具（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)所有片段進(jìn)行在線比對(duì)[14]。利用MEGA v7.0 軟件進(jìn)行序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建[15]。利用軟件Network v5.1，基于中介鄰接法（median-joining method）構(gòu)建各分子標(biāo)記的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖[16]。使用軟件DnaSP v5.0 對(duì)所有數(shù)據(jù)根據(jù)其群體進(jìn)行分組，并計(jì)算各類遺傳多樣性參數(shù)，如：?jiǎn)伪缎蛡€(gè)數(shù)（n）、變異位點(diǎn)、單倍型多樣性（h）、核苷酸多樣性（π）和核苷酸不匹配曲線分布（Mismatch distribution）[17]。使用軟件Arlequin v3.5 進(jìn)行分子方差分析（AMOVA）、計(jì)算遺傳分化系數(shù)（FST）、基于Tajima′s D 與Fu′s Fs 模型下，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行中性檢測(cè)[18]。為了進(jìn)一步測(cè)試每個(gè)群體之間的遺傳差異，將相應(yīng)片段數(shù)據(jù)從FASTA 格式轉(zhuǎn)換成STR 格式之后使用Bonferroni 進(jìn)行校正及多次檢測(cè)FST的P 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增測(cè)序，我們從4 個(gè)群體的樣品中獲得了894 bp Cytb 和324 bp ITS 基因片段。數(shù)據(jù)分析顯示在獲得的Cytb 基因片段樣本中含有36 個(gè)單倍型（表1），其中有12 個(gè)共享單倍型且Hap-4 是唯一一個(gè)被這4 個(gè)群體同時(shí)共享的單倍型。唯一一個(gè)被3 個(gè)群體（湛江、北海、?？冢颖竟蚕淼膯伪缎褪荋ap-8。此外，被湛江和北海群體共享的單倍型是Hap-1、Hap-3、Hap-10、Hap-11、Hap-12，被廈門和海口群體共享的單倍型有：Hap-13、Hap-14、Hap-16 和Hap-23，被北海和?？谌后w共享的單倍型只有Hap-31。其余單倍型均為各個(gè)群體特有單倍型。同樣在分析ITS 基因片段時(shí)，發(fā)現(xiàn)35 個(gè)單倍型，這其中也包含了6 個(gè)共享單倍型（表2）。其中，北海、廈門、湛江、?？谶@4 個(gè)群體共享同一個(gè)單倍型Hap-6。Hap-4 為北海、廈門、?？谶@3 個(gè)群體共享的單倍型。Hap-10 是北海和海口群體共享單倍型，Hap-16 為北海和湛江群體共享單倍型，Hap-22 和Hap-24 是湛江和?？谌后w共享單倍型。其余單倍型均為各個(gè)群體特有單倍型。

表1 基于Cytb 標(biāo)記的方斑東風(fēng)螺4 個(gè)群體的遺傳學(xué)參數(shù)Tab.1 Genetic diversity parameters of partical Cytb gene in four B.areolata populations

表2 基于ITS 標(biāo)記的方斑東風(fēng)螺4 個(gè)群體的遺傳學(xué)參數(shù)Tab.2 Genetic diversity parameters of partical ITS gene in four B.areolata populations

從表1 和表2 得到4 個(gè)群體的方斑東風(fēng)螺Cytb 和ITS 基因的遺傳學(xué)參數(shù)。其中方斑東風(fēng)螺Cytb 序列的平均單倍型多樣性處于較高水平（h=0.905 82），核苷酸多樣性處于偏低的水平（π=0.003 62）；而ITS 序列的平均單倍型多樣性處于中等偏高水平（h=0.784 798），核苷酸多樣性是偏低的（π=0.018 48）。這4 個(gè)群體的單倍型多樣性比較平均，彼此之間的差別不是很大，其中單倍型多樣性最高的群體是北海（BH）地區(qū)的群體（h=0.956 52），?？冢℉K）地區(qū)的群體單倍型多樣性數(shù)值最低（h=0.865 94）。我國(guó)南海方斑東風(fēng)螺群體遺傳多樣性均較高。

2.2 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

從表3 可以很明顯地看出在Cytb 基因結(jié)果中，遺傳分化系數(shù)FST值處于-0.012 12 與0.037 86 之間，表里較低水平的遺傳分化，僅?？谂c北海和湛江群體之間的存在顯著性差異，而ITS 結(jié)果表明遺傳分化系數(shù)FST值處于-0.002 54 與0.237 16，廈門群體與其他3 個(gè)群體之間均存在顯著的遺傳分化。

表3 基于Cytb 和ITS 的方斑東風(fēng)螺的群體遺傳分化系數(shù)（FST）Tab.3 Population genetic differentiation（FST）of B.areolata based on Cytb and ITS genes

利用4 個(gè)群體的Cytb 和ITS 基因的遺傳距離構(gòu)建NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖1、2 所示，2 個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)基本一致，該系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)總體分為2 大支，廈門群體為單獨(dú)一支，其余的3 個(gè)群體在另外一個(gè)大支上，ITS 基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示這3 個(gè)群體又分了2 小支，其中北海和?？趩伪缎驮谝粋€(gè)小支上而湛江單獨(dú)地在另外一個(gè)小支上；在Cytb 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上顯示，?？趩为?dú)分在了其中的一小支上，湛江和北海共同在另外一個(gè)小支上。

圖1 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體Cytb 基因的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 NJ phylogenetic tree of four populations of B.areolata based on Cytb gene

圖2 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體ITS 基因的NJ 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 NJ phylogenetic tree of four populations of B.areolata based on ITS gene

圖3、4 為方斑東風(fēng)螺群體的單倍型網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，Cytb 和ITS 基因結(jié)果一致，由圖可知，Cytb 基因中Hap-4 位于單倍型中央，ITS 基因中Hap-6 位于單倍型中央，為所有群體共享，呈現(xiàn)明顯的“星狀”拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。不同群體的單倍型未呈現(xiàn)地理分支，沒(méi)有表現(xiàn)出顯著的地理系譜結(jié)構(gòu)。

圖3 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的Cytb 單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 Haplotype evolutionary network of four populations of B.areolata based on Cytb gene

圖4 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的ITS 單倍型進(jìn)化網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Haplotype evolutionary network of four populations of B.areolata based on ITS gene

2.3 群體歷史動(dòng)態(tài)分析

AMOVA 分析表明（表4），我國(guó)南海方斑東風(fēng)螺的遺傳分化2.77%（Cytb）和12.28%（ITS）來(lái)自群體間，97.23%（Cytb）和87.72%（ITS）來(lái)自群體內(nèi)。表明群體內(nèi)的遺傳分化比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于群體間的遺傳分化比例。中性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，Tajima′s D 值以及Fu′s FS值的P 值均為負(fù)值（P＜0.05），Cytb 核苷酸不匹配分布圖呈現(xiàn)雙峰型，ITS 核苷酸不匹配分布圖呈現(xiàn)多峰型，表明4 個(gè)群體的方斑東風(fēng)螺在史上均未出現(xiàn)種群擴(kuò)張（表5、6，圖5、6）。

表4 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體Cytb 和ITS 分子方差分析（AMOVA）Tab.4 AMOVA analysis among four populations of B.areolata based on Cytb and ITS genes

表5 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的Cytb 選擇中性檢驗(yàn)Tab.5 Neutral test for four populations of B.areolata based on Cytb gene

表6 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的ITS 選擇中性檢驗(yàn)Tab.6 Neutral test for four populations of B.areolata based on ITS gene

圖5 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的Cytb 核苷酸不匹配分布圖Fig.5 Nucleotide mismatch distribution of four populations of B.areolata based on Cytb gene

圖6 4 個(gè)方斑東風(fēng)螺群體的ITS 核苷酸不匹配分布圖Fig.6 Nucleotide mismatch distribution of four populations of B.areolata based on ITS gene

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性代表著物種適應(yīng)環(huán)境變異的能力，是生物多樣性的基礎(chǔ)，群體遺傳結(jié)構(gòu)是生物多樣性的保護(hù)單元，在進(jìn)化上具有重要意義。目前在不斷地倡導(dǎo)保護(hù)自然資源、保護(hù)魚類資源，海洋魚類數(shù)量上的銳減已經(jīng)得到了很大的改善，但是隨之而來(lái)問(wèn)題逐漸凸顯：物種的多樣性是否也得到了保護(hù)？近些年來(lái)，以PCR 技術(shù)為主要試驗(yàn)支撐技術(shù)的分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在物種的種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用[19]。在這個(gè)過(guò)程中也出現(xiàn)了許多分子標(biāo)記的方法，不僅有從核DNA 出發(fā)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法，也有得到了較多應(yīng)用的例如D-Loop 區(qū)、COI、Cytb、16S rRNA 等多種線粒體DNA 片段，還有利用核糖體DNA 區(qū)段。本研究利用線粒體Cytb 和核糖體ITS 基因序列研究了我南海沿海方斑東風(fēng)螺的遺傳多樣性及遺傳分化水平，結(jié)果表明我國(guó)南海的方斑東風(fēng)螺有著比較豐富的遺傳多樣性。單倍型多樣性水平和核苷酸多樣性水平是評(píng)價(jià)遺傳多樣性水平高低的重要參數(shù)。單倍型多樣性和核苷酸多樣性值越大，物種的遺傳多樣性越豐富，本研究中Cytb 和ITS 基因在方斑東風(fēng)螺群體中單倍型多樣性指數(shù)分別為0.905 82 和0.784 79，核苷酸多樣性指數(shù)分別為0.003 62 和0.018 48，該結(jié)果與張旦旦等[20]利用COI 和Cytb 基因研究香螺Neptunea cumingii 的遺傳多樣性水平相似。此外，這種情況也存在于許多海洋貝類中[21-23]。

3.2 種群遺傳結(jié)構(gòu)

群體遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示方斑東風(fēng)螺兩兩群體間的FST值呈較低水平且僅少數(shù)達(dá)到顯著性水平，表明方斑東風(fēng)螺不同群體間沒(méi)有形成顯著的遺傳分化，僅廈門群體與其他3 個(gè)群體間存在低程度的遺傳分化。我國(guó)南海沿海方斑東風(fēng)螺群體沒(méi)有形成顯著的遺傳結(jié)構(gòu)，其遺傳分化水平較低，各個(gè)群體間存在頻繁的基因交流。AMOVA 分析結(jié)果也證明造成遺傳變異的主要因素都存在于種群的內(nèi)部。

通常，海洋生物的遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳分化水平較之陸生生物低，這可能是由于海洋環(huán)境缺乏像陸地環(huán)境一樣的有效屏障[24-25]。由于大多數(shù)的海洋生物都有浮游幼蟲期，尤其是成體營(yíng)固著生活的雙殼類，海流的存在極大地增強(qiáng)了幼蟲的擴(kuò)散能力，使不同地理種群間產(chǎn)生基因交流，從而避免顯著系統(tǒng)地理結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)[26]。海流對(duì)生物的遺傳分化的影響是十分重要的，方斑東風(fēng)螺生活史中具有12 d 左右的浮游期[27]。其繁殖期在我國(guó)為每年4-9 月[28]，此期間，在浮游幼蟲可在南海西南季風(fēng)漂流及其分支的推動(dòng)下，各群體間可以進(jìn)行頻繁的基因交流，從而降低遺傳分化水平。