徐濤，陳璟瑤，楊寶雨，喬為倉(cāng)，姜鐵民，陳歷俊

(1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連116033；2.北京三元食品股份有限公司 國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心，北京100163；3.桂林理工大學(xué)國(guó)家母嬰乳品健康工程技術(shù)研究中心南亞分中心，廣西 桂林541006)

0 引言

乳清蛋白作為配方奶粉一項(xiàng)重要檢測(cè)指標(biāo)，在食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB 10765-2010中規(guī)定嬰幼兒配方奶粉乳清蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)大于60%[1]。然而，最新的國(guó)標(biāo)中只規(guī)定了含量標(biāo)準(zhǔn)未規(guī)定檢測(cè)方法，其檢測(cè)仍沿用國(guó)標(biāo)GB/T 5413.2-1997中的乳清蛋白檢測(cè)方法。由于原料牛乳在加工前后會(huì)出現(xiàn)熱變性產(chǎn)生交聯(lián)蛋白，導(dǎo)致生產(chǎn)廠商不能有效對(duì)原輔料進(jìn)行監(jiān)測(cè)把控，相應(yīng)監(jiān)管部門(mén)也無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)終端乳粉產(chǎn)品進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管。因此，明確蛋白受熱結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而開(kāi)發(fā)更為準(zhǔn)確的乳清蛋白定量檢測(cè)方法是乳制品行業(yè)迫切所需。本文從乳清蛋白熱變性和乳清蛋白檢測(cè)方法兩個(gè)方面。綜述了國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)展，旨在為嬰幼兒配方乳粉加工前后乳清蛋白含量檢測(cè)提供參考。

1 乳清蛋白組成與功能

乳清蛋白是乳液中多種可溶性蛋白的總稱(chēng)，必需氨基酸種類(lèi)齊全，有極高的生物利用效價(jià)，主要包括α-乳白蛋白（α-Lactalbumin，α-La）、β-乳球蛋白（βlactoglobulin，β-Lg）、免疫球蛋白（immunoglobulins，Ig）和牛血清白蛋白（Bovine albumin，BSA）等生物活性物質(zhì),見(jiàn)表1。

表1乳清蛋白各組分生理功能

2 乳清蛋白熱變性對(duì)定量檢測(cè)的影響

乳具有一定的熱穩(wěn)定性，在加熱過(guò)程中，乳的熱穩(wěn)定性受到乳清蛋白蛋白變性、酪蛋白膠束的解聚及其表面電荷的變化、蛋白之間的共聚合作用和乳中各成分平衡被破壞的影響。其中，乳清蛋白自身結(jié)構(gòu)變性和乳蛋白之間的相互作用能夠?qū)е屡浞饺榉壑腥榍宓鞍椎臋z測(cè)出現(xiàn)誤差。如趙亭亭等[9]使用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析了不同受熱情況對(duì)乳粉中乳清蛋白的影響如圖1所示，從左到右樣品受熱溫度依次升高。在受熱溫度低時(shí)，乳清蛋白條帶清洗且顏色較深；隨溫度升高，乳清蛋白中β-乳球蛋白與α-乳白蛋白條帶顏色變淺。而酪蛋白條帶無(wú)明顯變化?？梢?jiàn)使用SDS-PAGE檢測(cè)乳制品中的乳清蛋白會(huì)有一定的限制，受到加工工藝的影響。除SDSPAGE檢測(cè)外，使用毛細(xì)管電泳，超高效液相色譜等在蛋白水平的檢測(cè)方法也都會(huì)受到蛋白變性的影響。與生牛乳相比較，加工后乳制品的檢測(cè)譜圖峰形發(fā)生偏移，峰底扭曲，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[10-11]。而其他在肽段水平或者氨基酸水平的檢測(cè)方法，由于蛋白質(zhì)被進(jìn)一步分解，其空間結(jié)構(gòu)的變化不會(huì)影響到檢測(cè)結(jié)果。

圖1 SDS-PAGE對(duì)不同受熱溫度乳蛋白的檢測(cè)

2.1 乳白蛋白熱變性

α-乳白蛋白分子內(nèi)含有8個(gè)半胱氨酸殘基，在Cys6-Cys120，Cys60-Cys77，Cys73-Cys90，Cys28-Cys111處能夠形成二硫鍵，由于自身不含游離的巰基，熱處理不會(huì)使其分子間發(fā)生二硫鍵的交換，受熱更穩(wěn)定。當(dāng)溫度到達(dá)一定程度時(shí)α-La自身的二硫鍵才會(huì)被破壞，蛋白結(jié)構(gòu)完全展開(kāi)如圖2所示，展開(kāi)后的α-乳白蛋白能夠與含游離巰基的其他蛋白質(zhì)結(jié)合形成蛋白聚合體[12-14]。α-La的熱穩(wěn)定性還與環(huán)境中Ca2+濃度有關(guān)，α-La上與Ca2+結(jié)合的位點(diǎn)是四個(gè)帶負(fù)電的天冬氨酸，在未結(jié)合Ca2+時(shí)，其自身的靜電排斥會(huì)影響蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白內(nèi)的疏水位點(diǎn)更容易接觸到外部，降低蛋白穩(wěn)定性[13]如圖3所示。

圖2熱處理對(duì)α-乳白蛋白結(jié)構(gòu)的變化

圖3α-乳白蛋白與金屬離子結(jié)合

2.2 乳球蛋白熱變性

β-乳球蛋白自身極易受溫度與p H值的影響，根據(jù)受熱溫度不同其自身的變化也不同。中性溶液中，溫度在30℃以下時(shí)β-乳球蛋白以單體和二聚體的形式存在，兩者能夠相互轉(zhuǎn)化并維持在一個(gè)平衡狀態(tài)；溫度達(dá)到30℃以上，此時(shí)β-乳球蛋白的平衡會(huì)向單體形態(tài)轉(zhuǎn)變，最終以單體的形式存在[16]；在溫度60℃以上時(shí)，β-乳球蛋白的空間折疊結(jié)構(gòu)逐漸被打開(kāi)，維持β-乳球蛋白基本結(jié)構(gòu)的二硫鍵發(fā)生交換，發(fā)生不可逆的變化；當(dāng)溫度高于85℃時(shí)，β-乳球蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)消失，巰基暴露，疏水性增強(qiáng)，分子之間通過(guò)二硫鍵與疏水作用折疊成熱變性聚合物如圖4所示。在高溫條件下熱變性聚合物的二硫鍵會(huì)發(fā)生斷裂，β-乳球蛋白會(huì)得到進(jìn)一步伸展[17-19]。

圖4熱處理前后β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)變化

2.3 熱處理對(duì)蛋白之間相互作用的影響

在乳的加熱過(guò)程中，β-乳球蛋白的球狀結(jié)構(gòu)先被打開(kāi)，通過(guò)二硫鍵的交換進(jìn)而形成聚集體；隨著溫度升高α-乳白蛋白空間結(jié)構(gòu)也被打開(kāi)與變性的β-乳球蛋白結(jié)合形成蛋白聚合體。乳清蛋白在受熱變性結(jié)構(gòu)展開(kāi)的過(guò)程中，其中的硫巰化合物與二硫鍵會(huì)與κ-酪蛋白相結(jié)合形成乳清蛋白-酪蛋白復(fù)合物[20]。

乳中另一部分重要的蛋白是酪蛋白，酪蛋白相較于乳清蛋白具有更高的熱穩(wěn)定性，只有當(dāng)溫度達(dá)到140℃時(shí)酪蛋白才會(huì)發(fā)生變性。酪蛋白對(duì)乳清蛋白熱聚合的保護(hù)性影響早在1964年就被發(fā)現(xiàn)，Kehoe等[21]發(fā)現(xiàn)β-酪蛋白能夠改變?nèi)榍宓鞍自诩訜徇^(guò)程中的熱聚集現(xiàn)象，β-酪蛋白并沒(méi)有改變?nèi)榍宓鞍椎淖冃詼囟纫膊皇峭ㄟ^(guò)減緩聚集過(guò)程發(fā)揮作用，而是以競(jìng)爭(zhēng)的方式影響乳清蛋白的熱聚集，β-酪蛋白形成的聚集體比乳清蛋白自聚集形成的聚集體小。更小的聚集體的形成產(chǎn)生更不渾濁、更可溶的蛋白質(zhì)溶液[22]。Arzuaga MR等[23]研究中發(fā)現(xiàn)在乳清蛋白加熱變性聚集過(guò)程中，酪蛋白的存在并沒(méi)有阻止變性行為的發(fā)生，但在酪蛋白-乳清蛋白體系中蛋白質(zhì)的溶解度增加了100%，能夠防止蛋白加熱時(shí)的聚集行為。Liyanaa rachchi等[24]研究不同酪蛋白與乳清蛋白比例對(duì)乳清蛋白熱凝集的影響，在p H 7.5，酪蛋白與乳清蛋白（30∶70）時(shí)乳清蛋白的二級(jí)構(gòu)象受加熱過(guò)程的影響最小，酪蛋白某個(gè)階段終止了乳清蛋白的變性和聚集過(guò)程。

3 乳清蛋白檢測(cè)方法

研究者針對(duì)配方乳粉中乳清蛋白各組分蛋白（α-La，β-Lg和BSA等）展開(kāi)了一系列的方法研究，雖檢測(cè)對(duì)象略有不同，但乳清蛋白中各組分蛋白之間的檢測(cè)方法具有通用性。目前主要的檢測(cè)方法包括十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）、氨基酸折算法、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）、高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LC-MC）等，見(jiàn)表2。

表2乳清蛋白各種檢測(cè)方法對(duì)比

3.1 毛細(xì)管電泳

1981年Jorgenson等人首先提出使用高壓電作為動(dòng)力在毛細(xì)管中進(jìn)行樣品分析，毛細(xì)管電泳技術(shù)誕生，由于其在生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Φ鞍踪|(zhì)等生物分子分離效果突出，得到迅速發(fā)展。最終發(fā)展成為在直流高壓場(chǎng)中以毛細(xì)管作為分離通道根據(jù)各檢測(cè)成分的淌度和分配行為差異進(jìn)行分離的高效電泳技術(shù)[32]。目前解決毛細(xì)管吸附問(wèn)題提高檢測(cè)準(zhǔn)確性的方法主要是在毛細(xì)管內(nèi)施加非共價(jià)鍵合涂層或共價(jià)鍵合涂層抑制內(nèi)壁對(duì)大分子的吸附[33]；此外調(diào)整電泳緩沖液，也能有效降低毛細(xì)管電泳的吸附[34]。

Zhao J等[35]使用帶有雙C4D/UV檢測(cè)器的毛細(xì)管電泳同時(shí)測(cè)定牛奶中的主要金屬陽(yáng)離子和乳清蛋白，陽(yáng)離子檢測(cè)分析過(guò)程中日內(nèi)和日間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%，n=5）分別為0.37%~0.55%和0.46%~0.79%，在乳清蛋白檢測(cè)分析中，β-Lg和α-La的檢測(cè)限分別為5 mg/L和3 mg/L，日內(nèi)和日間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%，n=5）為0.29%~0.31%，遷移時(shí)間在0.43%~0.48%之間，峰面積為2.89%~3.25%和3.29%~4.18%。

Ping Feng等[36-38]將乳清蛋白與酪蛋白看作整體，通過(guò)對(duì)脫脂奶粉的檢測(cè)，即可確定乳清蛋白和酪蛋白的面積校正因子，從而建立了快速檢測(cè)配方奶粉中乳清蛋白和酪蛋白比例的方法。實(shí)驗(yàn)對(duì)不含蛋白質(zhì)的配方乳粉進(jìn)行測(cè)定，從而證明在檢測(cè)配方乳粉時(shí)其他成分不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。經(jīng)過(guò)多次驗(yàn)證已被國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（ISO）設(shè)為檢測(cè)乳基嬰兒配方粉中乳清蛋白的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法（標(biāo)準(zhǔn)號(hào)ISO 23293-2020）。

3.2 SDS-PAGE

1959年Raymond等人利用人工合成的凝膠進(jìn)行電泳分析,創(chuàng)建了聚丙烯酰胺凝膠電泳。直至今日，聚丙烯酰胺凝膠電泳被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域中對(duì)蛋白質(zhì)、多肽、核酸等生物大分子的檢測(cè)鑒定。Robert G.E等[39]在SDS-PAGE過(guò)程中，使用陽(yáng)離子染料結(jié)晶紫代替考馬斯亮藍(lán)進(jìn)行染色，染色蛋白可以轉(zhuǎn)移到硝基纖維素上，western染色蛋白用酶偶聯(lián)抗體檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)中結(jié)晶紫能夠染色到16 ng的蛋白質(zhì)且無(wú)需脫色過(guò)程，比考馬斯亮藍(lán)染色低5倍，兩者具有相同的線(xiàn)性動(dòng)態(tài)范圍。賈宏信等[40]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，使用成像儀代替檢測(cè)凝膠條帶的光密度計(jì)，通過(guò)chemiDoc XRS與成像系統(tǒng)的Quantity One圖像處理軟件根據(jù)條帶顏色深淺計(jì)算蛋白含量，最終檢測(cè)值的RSD在1.85%~4.35%之間。

3.3 氨基酸折算法

氨基酸折算法是根據(jù)牛奶和乳清蛋白含有的獨(dú)特氨基酸圖譜，通過(guò)特定的氨基酸的差異來(lái)計(jì)算乳清蛋白含量的一種方法。Wesley等[41-42]對(duì)多種乳制品中乳清蛋白檢測(cè)的精確度進(jìn)行檢測(cè)評(píng)估。比對(duì)實(shí)際值與檢測(cè)質(zhì)，其重復(fù)性的估計(jì)值在0.3%~2.5%之間，平均回收率在97%~100%之間。

由于該方法的氨基酸含量對(duì)蛋白含量的計(jì)算轉(zhuǎn)化是通過(guò)經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的，并沒(méi)有對(duì)蛋白進(jìn)行直接的測(cè)定。李爽等[43]對(duì)氨基酸折算法計(jì)算奶粉中乳清蛋白含量的方法進(jìn)行評(píng)估，對(duì)國(guó)內(nèi)外品牌嬰幼兒配方粉檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，一階段奶粉中乳清蛋白的檢測(cè)值高于標(biāo)示值5%~10%，二、三段的奶粉乳清蛋白也與商品標(biāo)示值有所偏差。實(shí)驗(yàn)另一結(jié)果顯示，在對(duì)添加有大豆分離蛋白的奶粉使用該方法檢測(cè)時(shí)，乳清蛋白的檢測(cè)結(jié)果會(huì)發(fā)生明顯的升高，當(dāng)配方奶粉中添加20%的大豆蛋白時(shí)，乳清蛋白的檢測(cè)量從27.78%增加至63.99%。

3.4 高效液相色譜

高效液相色譜是根據(jù)樣品混合物中各組分之間結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的不同，在流動(dòng)相和固定相之間作用大小不同，從而使各組分形成滯留時(shí)間的差異。在1971年由科克蘭提出之后，該方法被廣泛用于化工，環(huán)境，生物，藥物和食品等領(lǐng)域。HPLC對(duì)配方乳粉中乳清蛋白的檢測(cè)僅適用于某些蛋白，無(wú)法廣泛應(yīng)用于全部乳清蛋白的分析，Xiaojing Ding等[44]在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)α-La與乳鐵蛋白在檢測(cè)中峰形會(huì)出現(xiàn)重疊從而干擾α-La檢測(cè)結(jié)果，建立了HPLC對(duì)乳制品中β-Lg的檢測(cè)，β-Lg A和β-Lg B的線(xiàn)性系數(shù)分別為0.9998和0.9997，濃度范圍內(nèi)的回收率在90.7%至116.8%之間。Farid M等[45]開(kāi)發(fā)了針對(duì)配方乳粉中骨橋蛋白檢測(cè)方法，通過(guò)反相色譜原理在HPLC上在214 nm處檢測(cè)分析，其結(jié)果線(xiàn)性大于0.999，檢出限與定量限分別為0.14 mg/L和0.41 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)＜0.2%。

3.5 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

20世紀(jì)80年代末，John Fenn發(fā)現(xiàn)了電噴霧電離(ESI)，使液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)獲得巨大發(fā)展。LC-MS技術(shù)將LC的物理分離能力與MS的質(zhì)量分析能力相結(jié)合，以其無(wú)與倫比的高靈敏度和高選擇性的混合分析能力成為蛋白質(zhì)組學(xué)中最重要的一部分[46-48]。Ke Xing等[49]使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用，對(duì)以牛乳或羊奶為乳基的配方乳粉中兩種乳清蛋白（α-la，β-lg）與4種酪蛋白（αS1-cs，αS1-cs，β-cs，κ-cs）進(jìn)行定量分析，目標(biāo)蛋白的定量限為0.01%~0.05%日內(nèi)和日間精密度的RSD分別為2.8%~6.2%和3.3%~9.8%，回收率范圍為82.3%~116.6%，在不同的加標(biāo)水平下具有很好的重現(xiàn)性（RSD＜12%）。Wang Z等[50]使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法評(píng)估乳清蛋白分析中牛α-La肽及其同位素標(biāo)記的肽之間的相互干擾。其中α-La肽的濃度對(duì)其相應(yīng)的同位素標(biāo)記肽段在正電噴霧源(ESI)下的MS響應(yīng)值有顯著影響，而β-Lg對(duì)其同位素標(biāo)記肽段的MS強(qiáng)度影響不大。研究對(duì)實(shí)驗(yàn)的前處理操作材料（移液器/注射器，過(guò)膜材料）進(jìn)行評(píng)估，在經(jīng)過(guò)注射器后α-La肽于其標(biāo)記肽的信號(hào)強(qiáng)度降低了50%，在經(jīng)過(guò)過(guò)濾器之后α-La肽與其標(biāo)記肽信號(hào)強(qiáng)度變化不大，β-Lg信號(hào)強(qiáng)度降低了50%。

3.6 其他方法

近幾年研究者們提出了通過(guò)學(xué)科交叉開(kāi)發(fā)蛋白檢測(cè)新技術(shù)。王士峰等[51]根據(jù)膠體金免疫層析技術(shù)，通過(guò)膠體金標(biāo)記的β-Lg單克隆抗體和IgG制成免疫層析試紙，進(jìn)而完成對(duì)配方羊奶粉中β-Lg的快速檢測(cè)。根據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)檢測(cè)目的蛋白的酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）對(duì)乳清蛋白中的牛血清蛋白和乳鐵蛋白也具有很好的檢測(cè)效果[52-53]。

2005年，Indyk等[54-57]將生物感應(yīng)器與乳清蛋白檢測(cè)相結(jié)合，提出通過(guò)光學(xué)生物傳感器檢測(cè)乳制品中蛋白的方法，使用表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance，SPR)檢測(cè)乳制品中乳鐵蛋白和Ig的檢測(cè)方法。Jagan M.Billakanti等[58]在其之后對(duì)SPR檢測(cè)進(jìn)一步優(yōu)化調(diào)整，測(cè)定原料奶、加工奶和各種奶制品中的蛋白時(shí)具有相對(duì)較好的準(zhǔn)確性。與光學(xué)生物傳感器檢測(cè)不同，Eissa等[59]針對(duì)乳制品中過(guò)敏原β-Lg的實(shí)時(shí)檢測(cè)，開(kāi)發(fā)了一種基于適體/石墨烯的電化學(xué)生物傳感器，能夠同步，低成本的檢測(cè)β-Lg，且具有較高的靈敏度。除此之外，由于單一的檢測(cè)技術(shù)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，通過(guò)兩種或多種技術(shù)相結(jié)合也是研究者關(guān)注的熱點(diǎn)。De Carvalho等[60]將分光光度法與多元校正法相結(jié)合建立了快速檢測(cè)乳清蛋白中糖巨肽蛋白的檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)奶粉中乳清摻假的快速、低成本檢測(cè)。

4 結(jié)果與展望

本文結(jié)合近幾年國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，綜述了目前配方乳粉中乳清蛋白定量檢測(cè)的研究進(jìn)展，對(duì)各檢測(cè)方法優(yōu)缺點(diǎn)以及各方法的優(yōu)化改善研究進(jìn)行了總結(jié)；歸納了乳清蛋白組成與其受熱條件下，蛋白空間結(jié)構(gòu)的變化；解釋了乳清蛋白變性對(duì)其定量檢測(cè)的影響。以期為嬰幼兒配方乳粉加工前后乳清蛋白定量檢測(cè)提供參考。

當(dāng)前可用于生產(chǎn)實(shí)踐中的乳清蛋白檢測(cè)技術(shù)并不多，大多數(shù)的檢測(cè)技術(shù)由于其成本，操作和儀器等問(wèn)題僅能在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。各定量方法中質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)被大多數(shù)研究者認(rèn)可，在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步降低成本，簡(jiǎn)化操作，應(yīng)是乳清蛋白定量研究的一個(gè)方向；另外乳清蛋白作為一個(gè)蛋白組，檢測(cè)過(guò)程中往往僅是對(duì)其主要的幾種子蛋白進(jìn)行單獨(dú)定量，最終計(jì)算乳清蛋白含量。不定量單個(gè)蛋白，直接將乳清蛋白當(dāng)作整體來(lái)進(jìn)行定量分析（如Ping Feng，毛細(xì)管電泳法）或許是種不錯(cuò)的選擇；另一方面對(duì)乳清蛋白的檢測(cè)應(yīng)盡量在肽段或者氨基酸的水平進(jìn)行，使其能夠避免蛋白質(zhì)自身結(jié)構(gòu)變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。以質(zhì)譜技術(shù)為基礎(chǔ)，在不使用同位素標(biāo)記的情況下對(duì)乳清蛋白整體進(jìn)行相對(duì)定量，有可能得到我們所期待的方法。