宮睿 劉暌 陳勁草 江普查

彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤是一種較為罕見(jiàn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，預(yù)后較差，特別是高級(jí)別腫瘤（WHOⅢ～Ⅳ級(jí)）患者，5年生存率不超過(guò)20%[1-2]。近年來(lái)，雖然放化療、靶向治療及免疫治療取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但是患者生存率仍未見(jiàn)明顯提高[3-4]。因此，尋找膠質(zhì)瘤的生物學(xué)標(biāo)志物并開(kāi)發(fā)潛在的治療靶點(diǎn)有重要意義。既往研究發(fā)現(xiàn)可催化組蛋白H3第27位（histone H3 lysine27-to-methioninemutations，H3K27M）可以通過(guò)甲基化導(dǎo)致特定抑癌基因活性下降，并增強(qiáng)原癌基因活性，H3K27M及H3K27M三甲基化（H3K27me3）參與細(xì)胞周期調(diào)控，與腫瘤進(jìn)展有關(guān)[5-6]。提示H3K27M及其甲基化在腫瘤中可能發(fā)揮重要作用，但其與彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚未明確。為此，本研究分析H3K27M及H3K27me3與彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤預(yù)后的關(guān)系，以期為臨床診療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇武漢大學(xué)中南醫(yī)院2016年1月—2019年1月收治的75例彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤患者為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴術(shù)前未接受放化療；⑵組織病理活檢確診為彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤；⑶病例資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并患其他部位的原發(fā)性腫瘤者；⑵肝、腎、心等臟器功能不全者；⑶患自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病者。在75例患者中，男性41例，女性34例；平均年齡為（25.84±7.52）歲；WHO分級(jí)：Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)43例，Ⅳ級(jí)10例；平均腫瘤大小為（3.25±1.13）cm。本研究方案獲武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 免疫組化檢測(cè)H3K27M表達(dá)水平

標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋，4 μm連續(xù)切片。操作步驟嚴(yán)格按照免疫組化SP試劑盒（武漢卡諾斯科技有限公司）說(shuō)明書進(jìn)行H3K27M（1：1 000）染色。觀察H3K27M在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)部位。免疫組化判定[7]：每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×200）評(píng)估，若經(jīng)顯微鏡觀察到細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色細(xì)顆粒物，則提示陽(yáng)性，按照染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞占比進(jìn)行計(jì)分。染色強(qiáng)度：無(wú)染色、淡黃、棕黃、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分。陽(yáng)性細(xì)胞占比：0～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%分別計(jì)1、2、3、4分，兩項(xiàng)計(jì)分乘積即為最終結(jié)果，總分＞2分為陽(yáng)性表達(dá)，≤2分為陰性表達(dá)。

1.3 染色質(zhì)免疫沉淀聯(lián)合芯片法檢測(cè)H3K27me3表達(dá)水平

用TRIzol試劑（北京萊博潤(rùn)科生物科技有限公司）提取總RNA，測(cè)定RNA濃度與純度，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（武漢卡諾斯科技有限公司），逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，依次加入Total RNA 2 μg，2.5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL，RTase Mix 1 μL，5×Reaction Buffer 5 μL，加入RNase/DNase Free Water使整體為25 μL，并行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃延伸、退火1 min，40個(gè)循環(huán)。上、下游引物序列分別為5'-TTTGGCACTAGCACATT-3'、5'-GCTACTCAACTGAGGG-3'。采用2-△△Ct計(jì)算目的基因相對(duì)表水平。根據(jù)H3K27me3表達(dá)水平的平均值，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。

1.4 隨訪

對(duì)所有患者進(jìn)行門診或電話隨訪，隨訪起始時(shí)間為2016年1月，每3個(gè)月隨訪1次，隨訪截至2021年1月，中位隨訪時(shí)間為22.5個(gè)月。記錄患者的總生存期（overall survival，OS），OS定義為自確診之日至患者死亡或最后一次隨訪的時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。分類資料采用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間比較用log-rank檢驗(yàn)。采用多因素Cox回歸模型分析H3K27M、H3K27Mme3表達(dá)水平與OS的關(guān)聯(lián)。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤中H3K27M、H3K27me3的表達(dá)

彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤組織中H3K27M陽(yáng)性表達(dá)率為65.33%（49/75），陰性表達(dá)率為34.67%（26/75）；彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤組織中H3K27me3平均表達(dá)量為0.54±0.22，以均值為界值將患者分為高、低表達(dá)兩組，其中高表達(dá)率為58.67%（44/75），低表達(dá)率為41.33%（31/75）。見(jiàn)圖1。

圖1 H3K27M、H3K27me3在彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤中的表達(dá)Fig.1 Expression of H3K27M and H3K27me3 in diffuse spinal glioma

2.2 H3K27M、H3K27me3表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

H3K27M及H3K27me3表達(dá)水平均以WHO分級(jí)、顱內(nèi)播散轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）；未發(fā)現(xiàn)H3K27M及H3K27me3表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤大小有關(guān)（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 H3K27M、H3K27me3表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Tab.1 Relationship between H3K27M,H3K27me3 expression and pathological features[n(%)]

2.3 H3K27M、H3K27me3表達(dá)與OS的關(guān)聯(lián)

生存分析結(jié)果顯示，H3K27M陽(yáng)性組2年生存率為51.6%，H3K27M陰性組為78.9%（log-rank χ2=7.954，P=0.005），見(jiàn)圖2A。H3K27me3高表達(dá)組2年生存率為48.4%，H3K27me3低表達(dá)組為74.2%（log-rank χ2=8.130，P=0.004），見(jiàn)圖2B。

進(jìn)一步采用Cox回歸分析H3K27M、H3K27me3表達(dá)與OS的關(guān)聯(lián)，模型1校正年齡、性別后，顯示H3K27M陽(yáng)性表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)較H3K27M陰性表達(dá)組高 97%（HR=1.97，95%CI：1.35～2.87，P＜0.001），H3K27me3高表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)較H3K27me3低表達(dá)組高 71%（HR=1.71，95%CI：1.20～2.44，P=0.003）；進(jìn)一步校正年齡、性別、WHO分期、顱內(nèi)播散轉(zhuǎn)移以及腫瘤大小后，結(jié)果顯示H3K27M陽(yáng)性表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)較H3K27M陰性表達(dá)組高67%（HR=1.67，95%CI：1.06～2.64，P=0.026），H3K27me3高表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)較 H3K27me3 低表達(dá)組高 84%（HR=1.84，95%CI：1.05～3.22，P=0.032），見(jiàn)表2。

表2 H3K27M、H3K27me3表達(dá)與OS關(guān)聯(lián)的Cox回歸分析結(jié)果Tab.2 Cox regression analysis results of H3K27M,H3K27me3 expression and OS

3 討論

目前，隨著基因遺傳學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，關(guān)于腫瘤發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制的研究越來(lái)越深入并取得了一定進(jìn)展[8]。表觀遺傳學(xué)修飾與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，主要包括DNA甲基化、組蛋白乙?；图谆?。有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白甲基化在基因表達(dá)調(diào)控中起重要作用，并且能夠通過(guò)影響染色體結(jié)構(gòu)“關(guān)閉”影響基因轉(zhuǎn)錄[9]。H3K27M蛋白屬于組蛋白類型，有多種變體，分為5種亞基，包括H1、H2A、H2B、H3和H4。H3K27M是主要的甲基化修飾位點(diǎn)之一，H3K27M突變可引起H3K27低甲基化，影響基因轉(zhuǎn)錄穩(wěn)定性，從而促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展[9]。既往研究[10]表明H3K27M及其三甲基化與胃癌發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)ILBIN等[11]研究亦發(fā)現(xiàn)H3K27M參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展，但其作用機(jī)制未完全明確。本研究發(fā)現(xiàn)彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤組織中，H3K27M以陽(yáng)性表達(dá)居多，H3K27me3以高表達(dá)居多。其機(jī)制可能與Zeste基因有關(guān)，研究認(rèn)為Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡與增殖，參與腫瘤進(jìn)展，可通過(guò)對(duì)H3K27M甲基化進(jìn)行催化，對(duì)分化相關(guān)基因、肝細(xì)胞維持等功能予以介導(dǎo)，從而促使H3K27M及其甲基化參與腫瘤干細(xì)胞的分化、增殖過(guò)程[12]。研究表明H3K27M能對(duì)下游靶基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行抑制，調(diào)節(jié)干細(xì)胞更新，促進(jìn)細(xì)胞增殖，這可能是其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制之一[13-14]。H3K27M、H3K27me3在瘤體組織中的表達(dá)受Zeste基因增強(qiáng)子人類同源物2表達(dá)的調(diào)控，它能通過(guò)與組蛋白去乙?；D(zhuǎn)移酶互相作用，促進(jìn)H3K27M表達(dá)以及三甲基化，對(duì)腫瘤內(nèi)抑癌基因表達(dá)進(jìn)行抑制，損害自然殺傷細(xì)胞功能[15]。

本研究結(jié)果顯示H3K27M陽(yáng)性組、H3K27me3高表達(dá)組的Ⅲ～Ⅳ級(jí)患者、顱內(nèi)播散轉(zhuǎn)移率均較高，表明兩者可能參與脊髓膠質(zhì)瘤進(jìn)展。本研究還發(fā)現(xiàn)H3K27M陽(yáng)性表達(dá)，H3K27me3高表達(dá)均與較差的預(yù)后相關(guān)。值得注意的是，H3K27M酶活性改變能使癌細(xì)胞中H3K27M、H3K27me3表達(dá)異常，提升癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致預(yù)后更差[16]。以上提示，H3K27M、H3K27me3可能是脊髓膠質(zhì)瘤潛在的預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述，彌漫性脊髓膠質(zhì)瘤組織中H3K27M呈陽(yáng)性表達(dá)，H3K27me3呈高表達(dá)，兩者均與較差的預(yù)后相關(guān)。但本研究樣本例數(shù)較少，且僅分析了2年的預(yù)后情況，未來(lái)還需增加樣本量以及延長(zhǎng)隨訪時(shí)間，分析H3K27M及其甲基化對(duì)遠(yuǎn)期預(yù)后的影響。