田濟(jì)銘 邢義涓 胡玉萍 梁曉磊 楊永秀

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在女性惡性腫瘤中發(fā)病率居第六位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病率不斷上升，且呈年輕化趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅著女性健康[1-2]。大多數(shù)患者因絕經(jīng)后陰道不規(guī)則出血就醫(yī)，早期患者5年生存率約為90%，然而30%的患者在診斷時(shí)已處于晚期，F(xiàn)IGOⅢ期患者的5年生存率為47%，F(xiàn)IGOⅣ期為17%[3]。目前，子宮內(nèi)膜癌的TCGA相關(guān)分子分型已經(jīng)被納入指南，這體現(xiàn)了子宮內(nèi)膜癌的基因和分子特征在患者臨床診療及預(yù)后評(píng)估中的重要作用[4]。此外，免疫失調(diào)在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也發(fā)揮重要作用。腫瘤組織中免疫分子的異常表達(dá)會(huì)引起免疫細(xì)胞功能紊亂，而免疫微環(huán)境的改變可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[5]。同時(shí)，子宮內(nèi)膜癌通常伴有高負(fù)荷的移碼突變，這將導(dǎo)致體內(nèi)新抗原表達(dá)增加，進(jìn)而加劇異常的免疫反應(yīng)[6]。因此，針對(duì)子宮內(nèi)膜癌異常的免疫微環(huán)境，在積極探索潛在治療靶點(diǎn)的同時(shí)，建立以免疫相關(guān)基因?yàn)橹鞯念A(yù)后預(yù)測(cè)模型尤為必要。本研究通過(guò)多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)聯(lián)合分析，建立了基于6個(gè)免疫相關(guān)基因（immune related genes，IRGs）的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型，以期為子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后評(píng)估和免疫治療方案提供參考。

1 資料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

子宮內(nèi)膜癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)從TCGA網(wǎng)站下載，免疫相關(guān)基因列表從IMMPORT網(wǎng)站獲取。通過(guò)比對(duì)IMMPORT下載的IRGs列表，篩選出TCGA隊(duì)列免疫相關(guān)基因的表達(dá)矩陣。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴原發(fā)腫瘤經(jīng)病理學(xué)診斷為子宮內(nèi)膜癌；⑵具有完整的年齡、病理分級(jí)、分期、身高、體重等基本信息；⑶具有完整的生存狀態(tài)、隨訪時(shí)間等信息。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他腫瘤或嚴(yán)重疾病。主要觀察的預(yù)后指標(biāo)為總生存期（overall survival，OS），包括1年總生存率，3年總生存率和5年總生存率。為構(gòu)建預(yù)后模型，整個(gè)TCGA隊(duì)列使用“caret”包中的“createDataPartition”函數(shù)按照1∶1的比例隨機(jī)分為訓(xùn)練隊(duì)列（n=252）和驗(yàn)證隊(duì)列（n=252）。

1.2 差異預(yù)后基因的篩選

通過(guò)“EdgeR”包對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，以P＜0.05，|Log2（FC）|＞2為標(biāo)準(zhǔn)，獲得在子宮內(nèi)膜癌中高表達(dá)與低表達(dá)的差異免疫相關(guān)基因。使用“survival”包在訓(xùn)練隊(duì)列中進(jìn)行單因素Cox分析，分析基因表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，獲得31個(gè)預(yù)后相關(guān)免疫基因。

1.3 差異基因的功能富集分析

差異基因列表上傳到DAVID網(wǎng)站，通過(guò)基因本體論（GO）和京都基因組百科全書(shū)（KEGG）探索差異基因可能集中的生物過(guò)程和通路，選擇P＜0.05的通路和生物過(guò)程，利用“recharts”包繪制差異基因與生物過(guò)程對(duì)應(yīng)的和弦圖。

1.4 預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證

獲得差異免疫基因后，通過(guò)最小絕對(duì)收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）回歸分析（10倍交叉驗(yàn)證）處理共線性基因，對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步篩選。多因素Cox回歸分析LASSO回歸結(jié)果，P＜0.05被定義為具有獨(dú)立作用的預(yù)后基因，使用“cph”函數(shù)構(gòu)建多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型，針對(duì)多因素Cox回歸分析中獨(dú)立預(yù)后基因，利用“nomogram”函數(shù)構(gòu)建列線圖模型。在列線圖中，通過(guò)確定單個(gè)因素的評(píng)分，進(jìn)而將各個(gè)評(píng)分累加得到總評(píng)分，得到評(píng)分對(duì)應(yīng)的結(jié)局事件發(fā)生概率。使用“cox.zph”函數(shù)進(jìn)行比例風(fēng)險(xiǎn)假定檢驗(yàn)，GLOBALP值為0.66，滿(mǎn)足比例風(fēng)險(xiǎn)假定。在訓(xùn)練集中使用時(shí)間依賴(lài)的受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，評(píng)估預(yù)測(cè)模型的區(qū)分度。使用校準(zhǔn)曲線對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)（通過(guò)Bootstrap法循環(huán)抽樣1 000次），以評(píng)估列線圖的1年、3年和5年預(yù)測(cè)生存率與實(shí)際生存率之間的擬合程度來(lái)評(píng)價(jià)列線圖的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性，預(yù)測(cè)曲線與45°對(duì)角線越接近代表預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度越高。采用“ggDCA”包繪制5年的決策曲線（decision curve analysis，DCA），評(píng)價(jià)該預(yù)后模型在指導(dǎo)臨床決策方面的收益情況。DCA被廣泛應(yīng)用于評(píng)估預(yù)后模型的臨床應(yīng)用能力，DCA離極端曲線越遠(yuǎn)，代表模型的臨床應(yīng)用能力越好。最后，在訓(xùn)練隊(duì)列中通過(guò)單因素和多因素Cox回歸分析年齡、病理分級(jí)、臨床分期和風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)與子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的關(guān)系。在驗(yàn)證隊(duì)列和整體隊(duì)列中也對(duì)上述指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用R 4.1.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。使用X-Tile 3.6.1軟件計(jì)算年齡、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分及基因表達(dá)量的最佳閾值，并根據(jù)最佳閾值將連續(xù)性變量轉(zhuǎn)換為二分類(lèi)變量。Kaplan-Meier方法用于繪制生存曲線，兩組生存曲線比較采用log-rank檢驗(yàn)。雙側(cè)t檢驗(yàn)用于分析兩組之間的差異，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 差異免疫相關(guān)基因的篩選

本研究共納入504例患者，包含482例腫瘤組織以及22例配對(duì)的腫瘤組織和癌旁組織。為了構(gòu)建預(yù)后模型，將整個(gè)隊(duì)列隨機(jī)分為兩組：訓(xùn)練隊(duì)列（n=252）和驗(yàn)證隊(duì)列（n=252）。訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的臨床信息和生存曲線如表1和圖1所示，其中訓(xùn)練隊(duì)列納入252例患者，年齡中位數(shù)為63.5歲；死亡21例，存活231例，1、3、5年總生存率分別為97.47%、83.95%、80.23%；驗(yàn)證隊(duì)列納入252例患者，年齡中位數(shù)為63歲；死亡22例，存活230例，1、3、5年總生存率分別為96.25%、84.45%、79.27%。通過(guò)分析一共篩選出394個(gè)差異基因，包括111個(gè)上調(diào)基因和283個(gè)下調(diào)基因，見(jiàn)圖2。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中504例子宮內(nèi)膜癌患者的臨床信息Tab.1 Clinical information of 504 endometrial carcinoma patients from TCGA

圖1 訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列的生存曲線Fig.1 Survival curves for training and validation cohorts

圖2 差異免疫相關(guān)基因的火山圖Fig.2 Volcanic map of differential expression IRGs

2.2 功能富集分析

功能富集分析發(fā)現(xiàn)，差異免疫相關(guān)基因主要富集于免疫應(yīng)答、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞增殖的正調(diào)控、蛋白水解、先天免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程（圖3A）。通路富集側(cè)重于神經(jīng)活性配體-受體相互作用、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、癌癥通路、PI3K-Akt、Ras、Rap1、MAPK信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控和黑色素瘤等通路（圖3B）。

圖3 差異免疫基因的功能富集Fig.3 Functional enrichment analysis of differential expression IRGs

2.3 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的建立與驗(yàn)證

在訓(xùn)練隊(duì)列中對(duì)394個(gè)差異免疫相關(guān)基因進(jìn)行了單因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)31個(gè)免疫相關(guān)基因與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率相關(guān)（圖4A）。為避免過(guò)度擬合，通過(guò)LASSO回歸確定了ANGPT4、CRH、HGF、PLA2G2A、SPAG11B、SST和VGF7個(gè)關(guān)鍵基因（圖4B～C）。多因素Cox回歸分析進(jìn)一步篩選出6個(gè)獨(dú)立影響預(yù)后的免疫相關(guān)基因：ANGPT4、HGF、PLA2G2A、SPAG11B、SST和VGF（圖5A）。最后，構(gòu)建了基于6個(gè)免疫基因的預(yù)后模型，計(jì)算公式：Risk score=ANGPT4×0.247+HGF×1.332+PLAG2GA×0.367+SPAG11B×2.716+SST×0.001+VGF×0.033，并繪制了風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分評(píng)估預(yù)后的列線圖（圖5B）。

圖4 預(yù)后相關(guān)基因的篩選和LASSO回歸分析Fig.4 Screening of prognosis-related genes and LASSO regression analysis

圖5 多因素Cox回歸分析及列線圖預(yù)后模型的構(gòu)建Fig.5 Multivariable Cox regression analysis and construction of the nomogram prognostic model

采用時(shí)間依賴(lài)的ROC曲線評(píng)估模型預(yù)測(cè)5年總生存率的準(zhǔn)確性，在訓(xùn)練隊(duì)列中，該模型預(yù)測(cè)1年、3年和5年生存率的曲線下面積為分別為0.986、0.846和0.849（圖6A）；在驗(yàn)證隊(duì)列中，分別為0.667、0.629和0.693（圖6B）；在整體隊(duì)列中，分別為0.798、0.735和0.770（圖6C），提示該模型具有良好的預(yù)測(cè)效果。訓(xùn)練隊(duì)列、驗(yàn)證隊(duì)列和整體隊(duì)列的校準(zhǔn)圖顯示模型預(yù)測(cè)的生存率接近實(shí)際生存率（圖6D～F）。5年DCA決策曲線表明，該模型在指導(dǎo)臨床決策方面也具有良好的效益（圖6G～I(xiàn)）。

圖6 風(fēng)險(xiǎn)模型在訓(xùn)練隊(duì)列、驗(yàn)證隊(duì)列和整體隊(duì)列中的預(yù)后評(píng)估效能和臨床應(yīng)用能力Fig.6 Prognostic evaluation and clinical application utility of risk model in training,validation and total cohorts

2.4 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型的效果評(píng)價(jià)

在訓(xùn)練隊(duì)列、驗(yàn)證隊(duì)列以及整體隊(duì)列中均發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（表2）。使用X-Tile軟件將風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分按照-0.3分為兩組，在訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列中都顯示高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的患者預(yù)后更差（圖7A～B）。為進(jìn)一步明確模型所納入免疫基因是否可以作為子宮內(nèi)膜癌預(yù)后標(biāo)志物，在整個(gè)隊(duì)列中評(píng)估了6個(gè)免疫基因表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系，結(jié)果顯示6個(gè)基因表達(dá)水平越高，患者預(yù)后越差（均P＜0.05，圖7C～H）。

表2 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因素的單因素和多因素回歸分析Tab.2 Univariable and multivariable Cox regression analyses of the prognosis risk factors

圖7 基于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分和6個(gè)免疫基因的生存分析Fig.7 Survival analysis based on risk score and 6 immune genes

3 討論

免疫療法是近年來(lái)惡性腫瘤治療的熱點(diǎn)，已有大量研究在婦科腫瘤中開(kāi)展。隨著子宮內(nèi)膜癌從傳統(tǒng)分型向分子分型的轉(zhuǎn)變，免疫治療成為晚期和復(fù)雜病理類(lèi)型子宮內(nèi)膜癌患者的潛在選擇[7]。目前，對(duì)于錯(cuò)配修復(fù)缺陷（mismatch repair-deficient，dMMR）或高微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（high microsatellite instability，MSI-H）的子宮內(nèi)膜癌患者，聯(lián)合免疫治療已經(jīng)極大改善了患者的結(jié)局[8]。腫瘤突變負(fù)荷（tumour mutational burden，TMB）新興標(biāo)志物也不斷被發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌患者也在其指導(dǎo)下接受免疫治療[9]。因此，開(kāi)發(fā)基于免疫相關(guān)基因的預(yù)后模型本質(zhì)上是對(duì)機(jī)體免疫反應(yīng)的評(píng)估，這對(duì)患者免疫治療的用藥方案和療效評(píng)價(jià)具有重要指導(dǎo)意義[10]。

本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取了子宮內(nèi)膜癌基因表達(dá)矩陣，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)清洗后，獲得了1 661個(gè)免疫基因表達(dá)矩陣。通過(guò)差異分析共鑒定出394個(gè)差異免疫相關(guān)基因，其中上調(diào)基因111個(gè)，下調(diào)基因283個(gè)。功能富集分析發(fā)現(xiàn)這些差異基因主要集中在免疫反應(yīng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、PI3K-Akt、Ras、Rap1、MAPK等致癌信號(hào)通路。此外，單因素Cox回歸分析獲得31個(gè)與預(yù)后相關(guān)的基因，進(jìn)一步利用LASSO回歸和多因素Cox回歸建立了基于ANGPT4、HGF、PLA2G2A、SPAG11B、SST和VGF等6個(gè)基因的預(yù)后評(píng)估模型。且該模型在訓(xùn)練隊(duì)列、驗(yàn)證隊(duì)列中均顯示出良好的預(yù)測(cè)效果，在3個(gè)隊(duì)列中均發(fā)現(xiàn)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分是影響子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

近年來(lái)，不斷有學(xué)者探索子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型，目前已有多種子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型被建立和評(píng)估。如YING等[11]在全基因組的基礎(chǔ)上鑒定子宮內(nèi)膜癌差異表達(dá)基因，并基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)建立了一個(gè)包括9個(gè)基因的預(yù)測(cè)模型，結(jié)果在預(yù)測(cè)患者生存時(shí)間中顯示了良好效能，其預(yù)測(cè)5年生存率的AUC值為0.676；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)該模型結(jié)合FIGO分期和其他預(yù)后因素可以進(jìn)一步區(qū)分預(yù)后較差的患者。O'MARA等[12]使用來(lái)自TCGA的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)嚴(yán)格的薈萃分析，發(fā)現(xiàn)了一組基因的表達(dá)水平與子宮內(nèi)膜癌患者的總生存時(shí)間有關(guān)，但只進(jìn)行了單因素分析，沒(méi)有考慮年齡、病理分級(jí)、FIGO分期等其他預(yù)后因素。CHEN等[13]使用ESTIMATER工具和兩種機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)識(shí)別影響預(yù)后的相關(guān)腫瘤微環(huán)境免疫基因，建立了8個(gè)基因預(yù)測(cè)模型，其5年的AUC值為0.797。相較既往研究，本研究雖然僅基于6個(gè)免疫相關(guān)基因構(gòu)建了子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型，但具有更高的ROC曲線下面積，顯示出更好的預(yù)后預(yù)測(cè)潛力。

在本研究建立的預(yù)測(cè)模型中，HGF、ANGPT4、PLA2G2A、SST、SPAG11B和VGF等6個(gè)免疫相關(guān)基因被用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后。其中，HGF在子宮內(nèi)膜癌中已有廣泛研究，基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的HGF通過(guò)c-Met信號(hào)通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的增殖和侵襲，在子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[14]。ANGPT4是血管生成素家族的成員，發(fā)揮促血管生成作用，而腫瘤最典型的特征之一就是新生血管形成。據(jù)報(bào)道ANGPT4表達(dá)水平與乳腺癌總生存率呈負(fù)相關(guān)，但在子宮內(nèi)膜癌中尚未見(jiàn)報(bào)道[15]。PLA2G2A在消化系統(tǒng)腫瘤中異常表達(dá)，可能與結(jié)直腸腫瘤發(fā)生、藥物敏感性及預(yù)后相關(guān)，但PLA2G2A在子宮內(nèi)膜癌中的作用未知，需深入探索[16-17]。SST常常在子宮內(nèi)膜異位癥病變組織和細(xì)胞中異常表達(dá)，可阻止血小板衍生生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的癌細(xì)胞增殖和侵襲，SST類(lèi)似物也被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜異位癥有前景的治療藥物[18]。既往研究[19-20]發(fā)現(xiàn)尿液中的SST甲基化是潛在的診斷標(biāo)志物，這些研究都反映了SST在子宮內(nèi)膜癌診治中的潛力。SPAG11主要在男性生殖道中表達(dá)，目前有關(guān)SPAG11B的研究主要集中在男性不育癥以及炎癥性疾病[21-22]。VGF最早被發(fā)現(xiàn)是一種在神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元的神經(jīng)損傷和炎癥后高度表達(dá)的顆粒樣神經(jīng)肽前體，被認(rèn)為是治療神經(jīng)性疼痛的潛在靶點(diǎn)[23]。有研究表明，VGF可以促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞存活并保持其干細(xì)胞特性，誘導(dǎo)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分泌，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用[24]?？梢?jiàn)，上述基因用于預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后具有一定的生物可解釋性，也可能在子宮內(nèi)膜癌進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用，但其相關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

本研究仍存在不足，如患者數(shù)據(jù)僅來(lái)源于TCGA，納入的患者多為拉美人群，是否適用于我國(guó)，還需進(jìn)一步評(píng)估。此外，這些免疫相關(guān)基因具體如何影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展，其機(jī)制需要進(jìn)一步的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究探索。

綜上，本研究構(gòu)建了一個(gè)基于6個(gè)免疫相關(guān)基因的子宮內(nèi)膜癌預(yù)后模型，該模型可以有效預(yù)測(cè)子宮內(nèi)膜癌患者的預(yù)后，對(duì)其免疫治療和預(yù)后評(píng)估具有一定指導(dǎo)意義。