蘇瑩 馬麗麗 柳江

在我國，食管癌死亡率僅次于胃癌、肺癌和肝癌[1]。早期手術(shù)切除是提高食管癌患者存活率的主要方法，但早期食管癌癥狀并不明顯，大多數(shù)患者確診時因處于晚期而失去手術(shù)切除機會，預后較差[2]。既往研究已證實長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和微小RNA（microRNA，miRNA）在包括食管癌在內(nèi)的惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、治療及預后中具有重要作用，參與調(diào)控細胞增殖、遷移和侵襲等一系列生物學過程[3-5]。同源盒轉(zhuǎn)錄因子6反義RNA1（homeobox transcription factor 6 antisense RNA1，DLX6-AS1）是位于人類染色體7q21.3的lncRNA。研究顯示，lncRNA DLX6-AS1在肝癌、卵巢癌、胰腺癌、食管癌等多種腫瘤組織中均表達上調(diào)，且參與腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程[6-7]，因此認為其可能作為致癌基因發(fā)揮作用。本課題組前期通過DIANA-LncBase軟件分析發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1與miR-181b存在靶向結(jié)合位點，另有研究報道m(xù)iR-181b可靶向抑制白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表達[8]。但三者在食管癌中的作用及其機制尚不清楚。本研究將通過體外研究初步探討三者的相互潛在關(guān)系以及l(fā)ncRNA DLX6-AS1/miR-181b/IL-6軸對食管癌細胞增殖、遷移及侵襲的影響，旨在闡明食管癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人食管上皮細胞株HEEC和人食管鱗狀細胞癌細胞株Eca-109均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心；胎牛血清購自杭州四季青公司；青霉素、鏈霉素、胰酶和DMEM培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司；TurboFectTM轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermo scientific公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒和Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；TaqMan MicroRNA assay試劑盒購自美國ABI公司；SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒購自日本Takara公司；CCK-8試劑盒和EdU細胞增殖檢測試劑盒購自北京索萊寶生物公司；Transwell小室和Matrigel膠購自美國BD公司；BCA蛋白檢測試劑盒、ECL發(fā)光液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和結(jié)晶紫染色液均購自上海碧云天生物研究所；IL-6抗體（21865-1-AP）和GAPDH抗體（10494-1-AP）均購自中國Proteintech公司；羊抗兔二抗（14708）購自美國CST公司；pcDNA-3.1 NC、pcDNA-IL-6、lncRNA DLX6-AS1的 siRNA序列si-DLX6-AS1及其對照組序列si-NC、DLX6-AS1和IL-6野生型和突變型的報告基因載體均由廣州銳博生物科技有限公司合成與構(gòu)建。引物序列由上海生工生物工程公司合成。

1.2 細胞培養(yǎng)

將凍存的HEEC細胞和Eca-109細胞復蘇，分別接種至含10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2條件下的培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，待細胞生長融合度達到90%左右時，用胰酶消化，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染與分組

取對數(shù)生長期的Eca-109細胞，以2×105/孔接種在6孔板中，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。分別將si-DLX6-AS1、si-NC、mimics NC、miR-181b mimics、pcDNA-3.1 NC、pcDNA-IL-6以及pcDNA-IL-6+miR-181b mimics轉(zhuǎn)染至Eca-109細胞，并依次記為si-DLX6-AS1組、si-NC組、mimics NC組、miR-181b mimics組、pcDNA-3.1 NC組、pcDNA-IL-6組、pcDNAIL-6+miR-181b mimics組。轉(zhuǎn)染方法：將5 nmol si-DLX6-AS1、miR-181b mimics分別用250 μL無菌水制成終濃度為50 μmol/L存儲液；然后按照TurboFectTM體外轉(zhuǎn)染試劑盒操作，將5 μL IMAX溶于250 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，同時將5 μL的50 μmol/L si-DLX6-AS1或50 μmol/L miR-181b mimics溶于250 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，混勻兩種稀釋液，室溫下靜置20 min；按照分組在各孔細胞中加入對應(yīng)復合物500 μL，培養(yǎng)48 h后，收集各組細胞樣品。pcDNAIL-6與miR-181b mimics共轉(zhuǎn)染時，分別取5 μL的50 μmol/L miR-181b mimics溶于 250 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，0.5 μg pcDNA-IL-6 溶于 50 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，其余操作步驟同上。

1.4 qRT-PCR檢測目的基因的表達

根據(jù)Trizol法提取各組細胞中的總RNA，用Nanodrop測定RNA純度和濃度，然后通過TaqMan MicroRNA Reverse Transcription試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得miRNA的cDNA，并以PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser從總RNA中去除基因組DNA后反轉(zhuǎn)錄獲得mRNA的cDNA。使用miRNA檢測試劑盒TaqMan MicroRNA assay測定miR-181b的表達，擴增條件：95℃、10 min，1次循環(huán)；95℃、15 s，62℃、1 min，40次循環(huán)；使用SYBR Premix Ex TaqⅡ試劑盒檢測lncRNA DLX6-AS1和IL-6的表達，擴增條件：95℃、10 min，1次循環(huán)；95 ℃、10 s，60 ℃、30 s，72 ℃、10 s，35次循環(huán)。以U6作為miRNA的內(nèi)參基因，GAPDH作為lncRNA DLX6-AS1和IL-6的內(nèi)參基因，具體引物序列如下：miR-181b上游 5'-AAAACATTCATTGCTGTCG-3'，下游5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6 上游 5'-CTCGCTTCGGGCAGCACA-3'，下游 5'-AACCGCTTCACGAATTTGCGT-3?；lncRNA DLX6-AS1上游5'-AGTTTCTCTCTAGATTGCCTT-3'，下游5'-ATTGACATGTTAGGGCCCTT-3'；IL-6 上游 5'-AACGATGATGCACTTGCAGA-3'，下游5'-GAGCATTGGAAATTGGGGTA-3'；GAPDH上游5'-AACGTGTCAGTGGTGGACCTG-3'，下游 5'-AGGTGGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。擴增結(jié)束后，通過2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.5 CCK-8法檢測Eca-109細胞的增殖能力

收集轉(zhuǎn)染后的各組Eca-109細胞，按1×104/孔接種在96孔板中，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時加入10 μL CCK-8試劑液，混合均勻，繼續(xù)孵育4 h，采用全自動酶標儀測定每組細胞450 nm處的光密度（OD）值。

1.6 EdU染色檢測Eca-109細胞的增殖情況

收集轉(zhuǎn)染后的各組Eca-109細胞，按1×105/孔接種在24孔板中，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，次日更換為含10 μmol/L EdU染液的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育2 h，PBS清洗后，用4%多聚甲醛室溫固定30 min，2 mg/mL甘氨酸搖床孵育5 min，PBS清洗；加入0.5% Triton X-100搖床孵育10 min，再用PBS清洗細胞；加入DAPI，室溫避光孵育10 min后，用PBS清洗，甘油封片。采用激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞染色情況。隨機選擇5個視野，計數(shù)該視野下EdU標記的陽性細胞數(shù)目與總細胞數(shù)目，并計算EdU陽性細胞率。EdU陽性細胞率（%）=（EdU陽性細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目）×100%。

1.7 Transwell小室實驗檢測Eca-109細胞的遷移和侵襲能力

Transwell小室實驗檢測細胞侵襲時，預先取適量稀釋后的Matrigel膠均勻加在Transwell小室上室的底部，并置于37℃培養(yǎng)箱中使其凝固。將轉(zhuǎn)染后的各組Eca-109細胞調(diào)整為2×104/mL的細胞懸液，取100 μL細胞懸液加在預先用Matrigel膠包被好的Transwell小室上室中，下室加入600 μL含10% FBS的新鮮培養(yǎng)基，并置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育；24 h后，取出小室，去除上室內(nèi)細胞，用4%多聚甲醛室溫固定10 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS清洗后，封片。采用光學顯微鏡觀察并統(tǒng)計染色穿膜細胞數(shù)。Transwell小室實驗檢測細胞遷移的操作步驟除了不鋪Matrigel膠，其余同侵襲實驗。

1.8 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C基因的靶向關(guān)系

在報告載體pmirGLO上插入野生型DLX6-AS1、突變型DLX6-AS1的3'UTR端序列和野生型IL-6、突變型IL-6的3'UTR端序列，構(gòu)建含miR-181b結(jié)合位點的DLX6-AS1野生型及突變型（DLX6-AS1 WT和DLX6-AS1 MUT）和IL-6野生型及突變型（IL-6 3'UTR WT和IL-6 3'UTR MUT）的報告基因載體。將對數(shù)生長期的Eca-109細胞以1×105/孔接種至12孔板上，通過Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將雙熒光素酶重組質(zhì)粒分別與mimics NC或miR-181b mimics共轉(zhuǎn)染至細胞，于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)染48 h后，收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明測定各組細胞的熒光素酶活性。

1.9 Western blot檢測IL-6的表達情況

在Eca-109細胞中加入RIPA緩沖液，提取總蛋白，并按照BCA法測定蛋白樣品濃度。將蛋白置于沸水浴中煮沸10 min，并制備12% SDS-PAGE，上樣蛋白后經(jīng)電泳分離2 h，轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗IL-6多克隆抗體（稀釋比例為1∶1 000），4℃孵育過夜；次日，TBST洗膜，加入對應(yīng)二抗（稀釋比例為1∶5 000），室溫孵育1 h。TBST洗膜后，用ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃膜拍照，Image-Pro Plus 6.0軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，計算目的蛋白相對表達量。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計學分析與作圖。計量資料均以均數(shù)±標準差（）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 食管癌Eca-109細胞中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1、miR-181b及IL-6的表達情況

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與HEEC細胞相比，Eca-109細胞中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1、IL-6 mRNA的表達水平均顯著升高（P=0.005，0.006），而miR-181b的表達水平顯著下降（P=0.004），見圖1。

圖1 qRT-PCR檢測lncRNA DLX6-AS1、miR-181b和IL-6在HEEC和Eca-109細胞中的表達情況Fig.1 Expression of lncRNA DLX6-AS1,miR-181b and IL-6 in HEEC cells and Eca-109 cells detected by qRT-PCR

2.2 LncRNA DLX6-AS1對食管癌Eca-109細胞增殖、遷移及侵襲的影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組中l(wèi)ncRNA DLX6-AS1表達水平顯著下降（P=0.003），見圖2A。表明下調(diào)lncRNA DLX6-AS1表達的Eca-109細胞模型構(gòu)建成功。CCK-8檢測結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組在48 h和72 h時的細胞增殖活性明顯受到抑制（P=0.012，0.003），見圖2B；EdU染色實驗結(jié)果顯示，si-NC組有大量EdU陽性細胞表達，而si-DLX6-AS1組中EdU陽性細胞率顯著降低（P=0.007），見圖2C。Transwell小室實驗結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-DLX6-AS1組細胞遷移數(shù)目與侵襲數(shù)目均減少（P=0.008，0.003），見圖2D。

圖2 LncRNA DLX6-AS1對Eca-109細胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.2 Effects of lncRNA DLX6-AS1 on the proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells

2.3 LncRNA DLX6-AS1與miR-181b的關(guān)系驗證

DIANA-LncBase軟件分析結(jié)果顯示，lncRNA DLX6-AS1與miR-181b存在互補結(jié)合位點，見圖3A。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-181b mimics+DLX6-AS1 WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于mimics NC+DLX6-AS1 WT共轉(zhuǎn)染組（P=0.006）；而miR-181b mimics+DLX6-AS1 MUT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性與mimics NC+DLX6-AS1 MUT共轉(zhuǎn)染組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P=0.683），見圖3B。qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-DLX6-AS1的Eca-109細胞中miR-181b表達水平顯著高于si-NC組（P=0.010），見圖3C。

圖3 LncRNA DLX6-AS1與miR-181b的關(guān)系驗證Fig.3 Validation of the relationship between lncRNA DLX6-AS1 and miR-181b

2.4 miR-181b與IL-6的關(guān)系驗證

采用miRanda軟件進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-181b與IL-6的3'UTR存在互補結(jié)合位點，見圖4A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，miR-181b mimics+IL-6 3'UTR WT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性顯著低于mimics NC+IL-6 3'UTR WT共轉(zhuǎn)染組（P=0.010），但miR-181b mimics+IL-6 3'UTR MUT共轉(zhuǎn)染組與mimics NC+IL-6 3'UTR MUT共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學意義（P=0.712），見圖4B。qRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，與mimics NC組比較，miR-181b mimics組細胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達水平均明顯降低（P=0.008，0.005）；pcDNA-IL-6組細胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達水平均明顯高于pcDNA-3.1 NC組（P=0.007，0.003），而pcDNA-IL-6+miR-181b mimics組細胞中IL-6 mRNA和蛋白的表達水平均顯著低于pcDNAIL-6組（P=0.011，0.007），見圖4C～D。

圖4 miR-181b與IL-6的關(guān)系驗證Fig.4 Validation of the relationship between miR-181b and IL-6

2.5 miR-181b調(diào)控IL-6影響食管癌Eca-109細胞增殖、遷移及侵襲

CCK-8檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h和72h時，miR-181b mimics組的細胞增殖活性均低于mimics NC組（P=0.023，0.012），而pcDNA-IL-6組細胞增殖活性均高于pcDNA-3.1 NC組（P=0.027，0.015）和pcDNA-IL-6+miR-181b mimics組（P=0.024，0.011），見圖5A。

圖5 miR-181b調(diào)控IL-6對Eca-109細胞增殖、遷移及侵襲的影響Fig.5 Effects of miR-181b on the proliferation,migration and invasion of Eca-109 cells by regulating IL-6

EdU染色結(jié)果顯示，各組細胞中均有EdU陽性細胞表達，其中miR-181b mimics組的EdU陽性細胞率較mimics NC組降低（P=0.012），而pcDNA-IL-6組的EdU陽性細胞率高于pcDNA-3.1 NC組（P=0.018）和pcDNA-IL-6+miR-181b mimics組（P=0.021），見圖5B。

Transwell小室實驗檢測結(jié)果顯示，miR-181b mimics組細胞遷移和侵襲數(shù)目均低于mimics NC組（P=0.018，0.017）；而pcDNA-IL-6組遷移與侵襲細胞數(shù)目均高于pcDNA-3.1 NC組（P=0.024，0.027）和pcDNAIL-6+miR-181b mimics組（P=0.031，0.029），見圖5C。

3 討論

近年來，盡管食管癌的診斷和治療均取得一定進展[9]，但是晚期食管癌的療效并不理想。早期診斷和早期治療是提高其治療效果的關(guān)鍵措施，因此尋找有效的新型生物標志物尤為重要。在食管癌中，越來越多的研究報道了lncRNA的關(guān)鍵調(diào)控作用[10-12]。人類有6個無遠端同源盒（DLX）基因，包括3個雙基因簇代表：DLX1/DLX2、DLX5/DLX6和DLX3/DLX4。其中，lncRNA DLX6-AS1是DLX6的反義RNA，屬于DLX基因家族的一員，長度約為1 990 bp[13]。已有研究[14-16]表明，lncRNA DLX6-AS1在多種腫瘤中高表達，且可能作為致癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。如QIAN等[15]研究表明lncRNA DLX6-AS1在胃癌組織中過表達，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)受累和TNM分期呈正相關(guān)；ZHU等[16]報道lncRNA DLX6-AS1在前列腺癌組織和細胞中均表達上調(diào)，且可能通過miR-497-5p/SNCG軸發(fā)揮致癌基因作用從而促進前列腺癌生長。而在食管癌的研究中，WANG等[7]發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1在食管鱗狀細胞癌組織中高表達，且與腫瘤分化程度、遠處轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)密切相關(guān)；敲除DLX6-AS1可明顯抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，并提高細胞凋亡率，同時還可影響細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程。本研究在食管癌Eca-109細胞中檢測也發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1表達上調(diào)，沉默其表達后細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯下降，與上述文獻報道一致。說明lncRNA DLX6-AS1在食管癌中可能作為致癌基因發(fā)揮作用，但其具體作用機制尚不明確。

LncRNA可以作為一種競爭性內(nèi)源性RNA與miRNA相互作用，進而參與靶基因的表達調(diào)控，并在腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為中發(fā)揮重要作用。為了探索lncRNA DLX6-AS1的作用機制，本研究進一步通過DIANA-LncBase軟件預測lncRNA DLX6-AS1的靶基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA DLX6-AS1與miR-181b存在互補結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步驗證了兩者的靶向關(guān)系，且下調(diào)lncRNA DLX6-AS1可使miR-181b表達上調(diào)；在細胞功能實驗中也發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-181b表達后Eca-109細胞增殖、遷移及侵襲能力均明顯下降，由此推測lncRNA DLX6-AS1可能通過靶向調(diào)控miR-181b表達促進細胞增殖、遷移和侵襲。既往研究已報道了miR-181b在多種腫瘤中的作用，如在胃癌細胞中miR-181b可通過靶向HK2抑制其糖酵解[17]；在多形性膠質(zhì)母細胞瘤中通過抑制SP1介導的葡萄糖代謝抑制腫瘤生長[18]；在人動脈粥樣硬化斑塊和腹主動脈瘤中通過調(diào)節(jié)TIMP-3和彈性蛋白影響疾病進展[19]。但是miR-181b在Eca-109細胞中發(fā)揮作用的途徑仍不清楚。本研究通過miRanda軟件預測發(fā)現(xiàn)miR-181b與IL-6存在互補結(jié)合位點，且miR-181b可靶向負調(diào)控IL-6表達，與ZHANG等[8]報道結(jié)果一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)IL-6在Eca-109細胞中高表達，上調(diào)其表達后細胞增殖、遷移及侵襲能力均顯著提高，而同時上調(diào)miR-181b和IL-6表達后細胞增殖、遷移及侵襲能力均受到抑制。由此推測，lncRNA DLX6-AS1可能通過miR-181b靶向負調(diào)控IL-6而促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，lncRNA DLX6-AS1/miR-181b/IL-6通路在食管癌進展中發(fā)揮重要調(diào)控作用，lncRNA DLX6-AS1可能通過miR-181b靶向調(diào)控IL-6而促進食管癌細胞增殖、遷移及侵襲過程。本研究結(jié)果為進一步闡明食管癌的發(fā)生發(fā)展機制及其治療研究提供了新思路。