莫偉斌， 歐陽婉愛， 范少峰， 梁英杰

膿毒癥是一種由感染導致的全身炎癥反應綜合征，是燒傷、創(chuàng)傷、休克等重癥患者的高發(fā)并發(fā)癥之一，部分病例可繼發(fā)內(nèi)分泌、代謝及凝血等多種系統(tǒng)性紊亂，導致多器官功能障礙綜合征(MODS)等嚴重并發(fā)癥[1]，最終引起患者死亡[3]。全球現(xiàn)階段一年超過1900萬人發(fā)生膿毒癥，并且發(fā)病率還在逐年上升[2]。因此，對膿毒癥發(fā)病機制的研究一直是臨床科研的熱點，近年來，凝血系統(tǒng)功能紊亂與膿毒癥的密切聯(lián)系受到了更多關注[4]。與普通的感染患者比較，對膿毒癥患者可能發(fā)生MODS的早期評估和預測，對于診治方案的制定、預后的改善均有重要價值[5]。凝血功能障礙是MODS發(fā)生、發(fā)展過程中的關鍵環(huán)節(jié)，而抗凝血酶-Ⅲ(AT-Ⅲ)、血小板功能狀態(tài)則在此環(huán)節(jié)中扮演了重要角色。其中血小板可直接被內(nèi)毒素和促炎細胞因子激活，被激活的細胞膜為凝血的發(fā)生提供了基礎條件[6]。因此，對血小板相關參數(shù)的監(jiān)測，可以及時識別凝血功能的異常，進而預測膿毒癥繼發(fā)MODS的幾率。作為一種糖蛋白，CD63存在于血小板顆粒膜上，相關研究[7]表明，其可作為血小板聚集及活化標志物，可以早期、準確評估血小板功能狀態(tài)，已應用于多種免疫性、血栓性疾病等。AT-Ⅲ在膿毒癥中出現(xiàn)明顯下降，且與預后相關, 監(jiān)測AT-Ⅲ活性對膿毒癥患者的預后具有重要意義[8-9]。目前，對膿毒癥患者繼發(fā)MODS通過CD63、AT-Ⅲ來評估和預測的相關研究還較少，故本研究主要探討膿毒癥患者CD63陽性率、AT-Ⅲ活性與病情嚴重程度的相關性及其對繼發(fā)MODS的預測價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 患者來源于2018年2月至2021年2月廣州醫(yī)科大學附屬市八醫(yī)院重癥醫(yī)學科(ICU)。診斷標準：符合膿毒癥和MODS診斷標準[10]。排除標準：孕婦，急慢性心腦血管疾病，急慢性肝病，血栓性疾病，自身免疫性疾病，患有惡性腫瘤，糖尿病，年齡>80周歲或<18周歲。同時，在患者入組前 2 周內(nèi)應無使用對血小板或凝血功能有明確作用的藥物史。

1.2分組 本研究共納入膿毒癥患者60例，根據(jù)7 d內(nèi)是否繼發(fā)MODS將膿毒癥患者分為MODS組(n=30)和非MODS組(n=30)。

1.3治療方法 納入后按照2016年膿毒癥與膿毒性休克處理國際指南[11]進行治療。并且在連續(xù)性腎臟替代治療(CRRT)中使用枸櫞酸體外抗凝治療(均未出現(xiàn)枸櫞酸蓄積)，以此降低對凝血功能的影響?；颊哽o脈留置導管，建立血管通路，采用1000 mL生理鹽水沖洗管路，采用金寶Prismaflex CRRT進行腎臟替代治療，濾器為M100，枸櫞酸濃度 3.0 mmol/L。治療模式為連續(xù)靜脈-靜脈血液濾過透析(CVVHD)，血流量為200 mL/min，置換液總量為72 L，超濾時間48 h內(nèi)，1周治療2次。兩組患者在行CRRT治療前需完成首次血液樣本抽取，否則不可列為研究對象。

1.4一般資料 收集患者的性別、年齡數(shù)據(jù)及28 d內(nèi)預后(死亡或生存)。檢驗并記錄入院后患者血小板計數(shù)(PLT)、血白細胞計數(shù)(WBC)、凝血功能[D-二聚體、AT-Ⅲ活性、活化部分凝血活酶時間(APTT)及凝血酶原時間(PT)]和降鈣素原(PCT)、C-反應蛋白(CRP)、血乳酸(Lac)，以及患者序貫器官衰竭評分(SOFA)、急性生理學及慢性健康狀況評估系統(tǒng)Ⅱ(APACHEⅡ)評分等數(shù)據(jù)。

1.5檢測指標

1.5.1 CD63陽性率檢測 分別在入院24 h內(nèi)和第3天時抽取靜脈血2 mL，血樣采用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝后，即時檢測并記錄數(shù)據(jù)。檢測方法：對CD61和CD63采用異硫氰酸熒光素(FITC)和熒光素藻紅蛋白(PE)分別標記，取適量與吸取的樣本輕輕混勻，避光孵育(25 ℃)15 min后，立即終止反應[加入2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)]并使用流式細胞儀進行檢測。采用FlowJo 9.0版流式細胞分析軟件對結果進行分析，測定CD63陽性細胞百分比及平均熒光強度(見圖1)。

注：(a)為通過側向散射(SSC)和CD61圈定血小板；(b)為陰性對照組；(c)為MODS組CD63的陽性表達率；(d)為非MODS組CD63的陽性表達率

1.5.2 AT-Ⅲ活性檢測 應用發(fā)色底物法將受檢血漿加入過量凝血酶, 使AT-Ⅲ與凝血酶形成1∶1的復合物, 剩余的凝血酶作用于發(fā)色底物S-2238, 釋放出顯色基團對硝基苯胺(PNA),顯色深淺與剩余凝血酶呈正相關，而與AT-Ⅲ呈負相關, 根據(jù)受檢者吸光度A值從標準曲線中計算出AT-Ⅲ吸光度A的含量。

1.5.3 預測及評價 采用SOFA評分與APACHEⅡ評分評價疾病嚴重程度，分數(shù)越低，疾病嚴重程度越低。

2 結果

2.1非MODS組與MODS組各項指標比較 與非MODS組比較，MODS組平均年齡升高(P<0.05)；兩組性別比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)； MODS組的CD63陽性率表達水平明顯增高、PCT明顯增高及血Lac明顯增高(P均<0.05)，而AT-Ⅲ活性明顯下降(P<0.01)；MODS組的PLT降低，PT增高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而兩組血WBC、CRP、D-二聚體及APTT比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與非MODS組比較，MODS組SOFA評分與APACHEⅡ評分更高，兩組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 MODS組與非MODS組膿毒癥患者各項指標的比較

2.2膿毒癥患者繼發(fā)MODS的多因素Logistic回歸分析 二元Logistic回歸顯示，CD63陽性率、AT-Ⅲ活性和PCT是膿毒癥繼發(fā)MODS的獨立危險因素(P<0.05)，見表2。

表2 Logistic回歸分析判斷膿毒癥患者繼發(fā)MODS的獨立危險因素

2.3CD63聯(lián)合AT-Ⅲ對膿毒癥患者繼發(fā)MODS的預測價值 ROC曲線分析顯示，CD63陽性率預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的曲線下面積(AUC)為0.8177(95%CI0.7339～0.9015，P<0.001)，AT-Ⅲ預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的AUC為0.7714(95%CI0.6848～0.8579，P<0.001)，見表3、圖2。CD63聯(lián)合AT-Ⅲ對膿毒癥繼發(fā)MODS可能具有更好的預測能力(AUC=0.8665，敏感度81.82%，特異度74.26%)，見表4、圖3。

表3 CD63、AT-Ⅲ和PCT對膿毒癥患者繼發(fā)MODS的預測能力

圖2 CD63、AT-Ⅲ、PCT單獨預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的ROC曲線

表4 三種預測因子對膿毒癥患者繼發(fā)MODS的聯(lián)合預測能力

圖3 CD63、AT-Ⅲ、PCT兩兩聯(lián)合預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的ROC曲線

3 討論

膿毒癥是ICU的常見病，與內(nèi)分泌、免疫、代謝系統(tǒng)對感染的紊亂關系密切，若病情急劇惡化導致多系統(tǒng)嚴重紊亂，即轉化為MODS、休克，甚至死亡。根據(jù)最新的膿毒癥相關研究，區(qū)分感染和膿毒癥的關鍵因素就在于器官功能障礙和宿主免疫反應失調(diào)的情況，而患者預后往往與器官功能障礙的嚴重程度密切相關[12]。可見，在膿毒癥患者的治療方案制定及預后改善的過程中，對可能繼發(fā)MODS的高?；颊哌M行早期預測具有重要和現(xiàn)實的臨床意義。

近期相關研究表明，在膿毒癥的病理生理過程中，凝血功能紊亂發(fā)揮著關鍵作用，輕癥患者在感染相關的炎癥因子介導下，引起凝血酶合成與生理性抗凝之間的失衡，出現(xiàn)PLT下降和(或)凝血因子活性改變。伴隨病情惡化，凝血因子持續(xù)減少，纖溶功能減低，三成以上危重患者會繼發(fā)彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)，最終導致微循環(huán)衰竭、MODS。與此同時，凝血系統(tǒng)活化可使炎癥反應加劇，使病情迅速惡化[13]。

CD63(溶酶體相關膜蛋白-3，LAMP-3)屬于四跨膜蛋白家族成員之一，在血小板活化后才能轉移到質(zhì)膜上，因此被認為與血小板的活化密切相關[14]，近年來CD63常作為有效的血小板活化的標志物[15]。本研究表明，CD63陽性率表達水平在ROC曲線分析中AUC>0.8，特異度更高，可作為膿毒癥患者繼發(fā)MODS的獨立危險因素，對膿毒癥預后的早期判斷具有重要臨床預測價值。

AT-Ⅲ本質(zhì)是一種單鏈糖蛋白，主要在肝實質(zhì)細胞內(nèi)合成，可以協(xié)同多種特定蛋白來抑制凝血過程，是機體抗凝系統(tǒng)要素之一。相關研究[9]證實，伴隨膿毒癥患者病情進展，膿毒癥時AT-Ⅲ活性可降低至正常的20%～40%，其原因是多方面的，包括肝臟中AT-Ⅲ的合成減少；AT-Ⅲ與凝血酶結合導致其消耗增加；活化的中性粒細胞可釋放彈性酶等，從而加劇AT-Ⅲ的活性表達；毛細血管通透性改變，使部分AT-Ⅲ漏出等[8-9]。此時體內(nèi)凝血系統(tǒng)過度激活，大量凝血酶與纖維蛋白被迅速釋放，最終發(fā)生機體凝血與抗凝兩個系統(tǒng)之間失衡[13]。

有研究[9]顯示，AT-Ⅲ還與膿毒癥患者的病情嚴重程度及預后有密切關聯(lián)。但將早期膿毒癥患者AT-Ⅲ活性表達水平作為識別繼發(fā)MODS的風險預測因子，尚缺少相關報道。本研究結果表明，膿毒癥早期AT-Ⅲ活性表水平與患者疾病嚴重程度相關，MODS組早期AT-Ⅲ活性表達水平明顯低于非MODS組。且ROC曲線分析顯示，早期AT-Ⅲ活性可以作為預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的可靠指標，且敏感度和特異度皆較高，可以認為，AT-Ⅲ是患者發(fā)生MODS的獨立危險因素。而通過ROC曲線分析可進一步發(fā)現(xiàn)，將CD63陽性率及早期AT-Ⅲ活性進行聯(lián)合分析，對膿毒癥患者繼發(fā)MODS的風險評估和預測可能具有更高的指導意義(AUC=0.8665，敏感度81.82%，特異度74.26%)。

本研究結果還可看出，作為經(jīng)典炎癥指標的血WBC結果跨度偏大，可能影響了其對膿毒癥患者繼發(fā)MODS的預后判斷價值。結合臨床實際，如部分病毒感染、免疫抑制及重癥感染患者的血WBC可能升高不明顯，甚至出現(xiàn)下降。PCT是以往膿毒癥研究的熱點，但其作為膿毒癥預后指標的預測價值仍存在爭議[16]。本研究中，PCT在非MODS組和MODS組患者中的表達確有差異，但能否作為膿毒癥患者繼發(fā)MODS的獨立危險因素，有待更多證據(jù)支持。誠然，本研究的樣本例數(shù)較少，若要更加全面地發(fā)掘早期CD63、AT-Ⅲ預測膿毒癥患者繼發(fā)MODS的價值，仍需多中心協(xié)作，增加樣本量。

綜上所述，CD63與AT-Ⅲ的早期表達水平對膿毒癥患者的疾病嚴重程度及預后有一定的參考意義，其可作為預測患者是否繼發(fā)MODS的有效生物標志物，兩者聯(lián)合分析可展現(xiàn)出更好的預測價值。