李繼忠， 李 曼， 魏鸞潁

非ST段抬高心肌梗死(NSTEMI)是一種不伴ST段抬高的心臟病變，在臨床上有較高發(fā)病率，且發(fā)病率呈逐年攀升態(tài)勢，給老年人群生存質(zhì)量帶來嚴(yán)重威脅。因此，如何在早期有效、快速地做出診斷，以及尋找NSTEMI的治療新靶點，是目前臨床的重點研究課題。研究[1]指出，冠脈血栓是心血管事件發(fā)生的主要原因，嚴(yán)重血栓負(fù)荷者采用經(jīng)皮冠狀動脈介入(PCI)手術(shù)治療時易出現(xiàn)血栓事件，影響治療安全性。目前臨床對于血栓事件的發(fā)生機(jī)制尚未完全明確，通常認(rèn)為其可能與毛細(xì)血管床損傷、局部炎癥反應(yīng)等因素相關(guān)[2-3]。研究[4-6]發(fā)現(xiàn)，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3， NLRP3)炎性小體活化在介導(dǎo)動脈粥樣硬化發(fā)生的炎性機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，但尚無研究涉及NLRP3炎性小體與血栓負(fù)荷的相關(guān)性。本研究收集30例急性NSTEMI患者的臨床資料，將其與ST段抬高心肌梗死患者、健康受試者的臨床檢測指標(biāo)進(jìn)行比較分析，并探討NLRP3炎性小體與血栓積分的關(guān)系，以期為急性NSTEMI的早期診斷與靶向治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取河北中石油中心醫(yī)院2021年1月至2021年5月收治的急性心肌梗死患者60例，按心電圖ST段是否抬高分為非ST段抬高組(30例)與ST段抬高組(30例)，并選擇30例無心肌梗死的志愿者為健康對照組。

1.2納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)以下3條診斷標(biāo)準(zhǔn)至少符合2條：①有缺血性胸痛的臨床病史；②心電圖動態(tài)演變，伴或不伴ST段抬高；③血清肌酸激酶同工酶、肌鈣蛋白等心肌標(biāo)志物濃度升高；(2)年齡在18周歲及以上；(3)意識清楚，能夠理解診療過程，配合完成相關(guān)檢查；(4)本課題納入患者知情同意，研究經(jīng)廊坊市人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號：KYLL-2018-22)。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合心肌梗死的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②資料不全，配合度不佳；③近期有大手術(shù)史、炎癥性病變史；④合并其他嚴(yán)重惡性病變；⑤急診PCI術(shù)后因病情危重即刻轉(zhuǎn)院或死亡，或術(shù)后12 h內(nèi)出院而無法留取術(shù)后標(biāo)本。

1.3檢查方法

1.3.1 實驗室檢測指標(biāo) 各組受試者入院后均采集外周靜脈血20 mL，采用全自動生化分析儀、化學(xué)發(fā)光儀、熒光免疫定量分儀器等，進(jìn)行常規(guī)血、肝腎、心肌酶等各項指標(biāo)檢測。

1.3.2 NLRP3炎性小體檢測 各組抽取外周靜脈血于EDTA管，離心，分離外周血單抗細(xì)胞(PBMCs)。分離后的PBMCs中加入1 mL的Trizol混勻備用。

1.3.2.1 Real-time PCR法進(jìn)行PBMCs NLRP3 mRNA炎性小體水平檢測 提取各組PBMCs總蛋白并測定其濃度，再逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，根據(jù)PCR試劑盒說明書擴(kuò)增引物。NLRP3上游引物序列為：5′-CATGAGTGCTGCTTCGACAT-3′：下游引物序列為：5′-GCTTCAGTCCCAGCTCTTCCAC-3′；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為：5′-AGA-CAGCCGCATCTTCTTGT-3′；下游引物序列為：5′-CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT-3′。建立PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為預(yù)變性，以2-△△ct計算外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA相對表達(dá)量。

1.3.2.2 Western blot法進(jìn)行NLRP3炎性小體蛋白表達(dá)檢測 提取PBMCs總蛋白進(jìn)行濃度測定，再依次進(jìn)行電泳分離、覆膜、封閉、孵育等操作后，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)檢測其蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 血栓負(fù)荷評估 心肌梗死患者實施冠脈造影，常規(guī)行多體位投照，充分顯示冠狀動脈狹窄情況，管腔狹窄程度在50%及以上即為陽性，反之則為陰性。詳細(xì)記錄兩組患者造影所示管腔狹窄部位、程度、類型等，并根據(jù)冠脈造影結(jié)果計算血栓積分用以評價血栓負(fù)荷，采用0～4分5級評分制，未見血栓以0分表示，依此類推，若見大于血管內(nèi)徑2倍的血栓以4分表示，血栓積分越高意味著患者血栓負(fù)荷越重[7]。

2 結(jié)果

2.1基本資料 三組性別、年齡等常規(guī)資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；非ST段抬高組射血分?jǐn)?shù)、白細(xì)胞計數(shù)(WBC)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、N末端B型腦利鈉肽(NT-proBNP)、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)、高敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)表達(dá)及血栓積分均明顯高于健康對照組(P<0.05)，但NT-proBNP、cTnI、hs-CRP表達(dá)及血栓積分均明顯低于ST段抬高組(P<0.05)。見表1。

表1 三組間基本資料比較

2.2炎性因子 非ST段抬高組外周血單核細(xì)胞NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白表達(dá)水平以及IL-1β、IL-18表達(dá)均高于健康對照組(P<0.05)，但各指標(biāo)又低于ST段抬高組(P<0.05)。見表2。

表2 三組間炎性因子比較

2.3冠狀動脈造影結(jié)果 非ST段抬高組共檢出74支動脈狹窄，ST段抬高組共檢出68支動脈狹窄，組間在病變部位、病變支數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但非ST段抬高組三支病變發(fā)生率高于ST段抬高組，且非ST段抬高組管腔狹窄程度>90%、側(cè)支循環(huán)率明顯高于ST段抬高組(P<0.05)。見表3。

表3 ST段抬高組和非ST段抬高組急性心肌梗死患者冠狀動脈造影結(jié)果比較(n=30)

2.4血栓負(fù)荷與炎性指標(biāo) 按血栓積分評估結(jié)果將非ST段抬高組患者分為高血栓負(fù)荷組和低血栓負(fù)荷組。高血栓負(fù)荷組NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白及IL-18均明顯高于低血栓負(fù)荷組(P<0.05)。見表4。

表4 不同血栓負(fù)荷的心肌心肌梗死患者炎性指標(biāo)比較

2.5相關(guān)性與ROC曲線分析 Pearson相關(guān)性分析顯示，NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白與血栓積分均呈明顯正相關(guān)性(r=0.669、0.597，P均<0.05)。ROC曲線分析NLRP3炎性小體對非ST段抬高心肌梗死血栓負(fù)荷的診斷價值顯示，NLRP3 mRNA的曲線下面積(AUC)為0.78，NLRP3蛋白的AUC為0.72。見圖1、表5。

注：NLRP3為核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3

表5 NLRP3炎性小體預(yù)測非ST段抬高心肌梗死血栓負(fù)荷的ROC曲線分析

3 討論

心肌梗死是急診常見病，根據(jù)心電圖特征一般分為伴或不伴ST段抬高，本研究主要對急性NSTEMI進(jìn)行分析。NSTEMI后冠脈粥樣硬化斑塊破裂，且會發(fā)生局部血栓或冠脈血管痙攣，出現(xiàn)突發(fā)的胸痛，長時間難以緩解。在心電圖上，患者大多可見急性心肌缺血，同時伴心肌酶標(biāo)志物濃度增高。再者，由于罪犯血管中有多種炎性細(xì)胞的參與，該病也被認(rèn)為是一種與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的病變[8-9]。在病理機(jī)制方面，雖然非ST段抬高與ST段抬高心肌梗死存在諸多共同點，但兩者的血栓性質(zhì)并不完全相同。以血小板血栓為主的是非ST段抬高心肌梗死，血管堵塞后也有可能自發(fā)性再通，但其存在更為嚴(yán)重的心內(nèi)膜損傷[10]；而ST段抬高心肌梗死患者的血栓形成主要為纖維蛋白性血栓，堵塞部位比較固定，易使心肌發(fā)生透壁性損傷[11]。

本研究結(jié)果顯示，非ST段抬高組的射血分?jǐn)?shù)、WBC、CK-MB、NT-proBNP、cTnI血栓積分明顯高于健康組，這與吳錚等[12]的研究結(jié)果基本相符。CK-MB、NT-proBNP等是心肌功能評估的重要指標(biāo)，cTnI是心肌損傷的特異性診斷指標(biāo)，均對診斷與評估急性心肌梗死預(yù)后有重要意義。血栓積分可用于評估患者的血栓負(fù)荷，為臨床科學(xué)治療提供依據(jù)。上述指標(biāo)非ST段抬高組又低于ST段抬高組，提示以上指標(biāo)可作為急性心肌梗死患者診斷與預(yù)后評估的重要指標(biāo)，以及非ST段抬高與ST段抬高心肌梗死鑒別的依據(jù)[13]。此外，炎性因素對心臟病變也有著重要的影響[14-15]。hs-CRP、IL-1β、IL-18作為炎性標(biāo)志物，在急性感染性疾病診斷中的應(yīng)用廣泛，是急性心肌梗死的重要預(yù)測因子。NLRP3炎性小體屬于心肌炎癥的關(guān)系介質(zhì)，在健康人群中，NLRP3炎性小體活性始終處于抑制狀態(tài)，當(dāng)出現(xiàn)炎癥性病變便會激活其活性，使NLRP3炎性小體水平升高[16-17]。

在NSTEMI患者中，NLRP3炎性小體可能是通過如下三種機(jī)制被激活的：①線粒體中活性氧(ROS)的大量釋放；②溶酶體外大量蛋白酶的釋放；③胞外三磷酸腺苷(ATP)與依賴ATP的嘌呤受體P2X7受體相結(jié)合后，導(dǎo)致通道蛋白Pannexin-1開放，胞內(nèi)鉀離子水平下降，激動劑進(jìn)入胞內(nèi)[18-19]。以上機(jī)制還有可能通過協(xié)同作用，進(jìn)一步加速NLRP3炎性小體的激活，并使下游IL-1β與IL-18激活，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究顯示，非ST段抬高組NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白和IL-1β、IL-18均高于健康對照組，但同時各指標(biāo)表達(dá)又低于ST段抬高組，這與韓玉澤等[20]有關(guān)心肌梗死大鼠心肌組織中NLRP3、IL-1β及TNF-α等炎性因子表達(dá)水平升高的研究有相似之處。這提示上述炎性因子指標(biāo)聯(lián)合心電圖檢查可以對NSTEMI進(jìn)行診斷和預(yù)后判斷，并可作為與ST段抬高心肌梗死鑒別的重要標(biāo)志物。

冠脈造影結(jié)果分析，非ST段抬高心肌梗死患者中，高血栓負(fù)荷亞組(血栓積分≥2分)的NLRP3 mRNA、NLRP3蛋白及IL-18表達(dá)均明顯高于低血栓負(fù)荷亞組(血栓積分<2分)。Pearson分析也發(fā)現(xiàn)，非ST段抬高組NLRP3炎性小體mRNA、NLRP3蛋白與血栓積分呈明顯正相關(guān)性，提示NLRP3炎性小體通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與患者血栓負(fù)荷存在關(guān)聯(lián)。孟利民等[21]研究顯示，高血栓負(fù)荷的急性ST段抬高心肌梗死患者炎癥因子水平明顯高于低血栓負(fù)荷組。但目前尚未看到更多有關(guān)NSTEMI患者血栓負(fù)荷與NLRP3炎性小體等指標(biāo)相關(guān)性的分析。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，NLRP3 mRNA與NLRP3蛋白判斷血栓負(fù)荷的AUC分別為0.78與0.72。提示對NSTEMI患者而言，可以考慮將NLRP3炎性小體表達(dá)作為判斷血栓負(fù)荷的指標(biāo)之一；同時，也可嘗試將NLRP3炎性小體的靶向干預(yù)作為新的治療思路，通過降低患者炎癥反應(yīng)來改善血栓負(fù)荷，緩解心肌梗死。但鑒于目前臨床尚無更多NLRP3炎性小體在非ST段抬高心肌梗死中的作用及其與血栓積分關(guān)系的研究，后續(xù)還需更多的實踐資料對本研究觀點加以驗證。

總而言之，NLRP3炎性小體表達(dá)與急性NSTEMI患者血栓積分之間存在相關(guān)性，其對患者炎癥狀態(tài)及血栓負(fù)荷的評估有一定指導(dǎo)意義，對探索心肌梗死的靶向治療也有一定參考價值。