胥欣欣，匡華

（1 江南大學食品科學技術國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122； 2 江南大學食品學院，生物界面與生物檢測研究所，江蘇 無錫 214122）

食品安全是世界性問題。隨著經濟全球化的日益發(fā)展，食品安全已成為關乎人類健康的全球性挑戰(zhàn)。食品安全問題對國家的政治穩(wěn)定、經濟建設、社會發(fā)展等都具有重要的影響。民以食為天，我國為保證食品安全，保障公眾身體健康和生命安全，制定了《中華人民共和國食品安全法》?，F行國家食品安全標準中明確規(guī)定了食品、食品添加劑、食品相關產品中的致病性微生物、農藥殘留、獸藥殘留、生物毒素、重金屬等污染物質以及其他危害人體健康物質的限量要求。對食源性疾病、食品污染以及食品中的有害因素進行監(jiān)測，是食品安全風險監(jiān)測和評估的重要環(huán)節(jié)之一。

目前，已經有多種成熟的檢測技術被廣泛應用于食品安全檢測，如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、高效液相色譜-質譜（HPLC-MS）、氣 相 色 譜- 質 譜（GC-MS） 和 核 磁 共 振（NMR）［1-2］。這些儀器分析技術有普遍的局限性，如檢測時間長，依賴專業(yè)的樣品處理技術和昂貴的儀器等，限制了它們的應用。ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）、膠體金免疫色譜（gold immunochromatographic assay，GICA）、電化學生物傳感器等相對低成本、便攜且易于操作，在食品分析領域展現出巨大的潛力［3-8］。還有基于分子印跡聚合物（molecular imprinted polymer，MIP）的傳感器，利用MIP可以模仿抗體、酶和其他生物分子的特異性和選擇性的優(yōu)勢，能夠實現污染物的識別、富集和分離［9-11］。

除了上述幾種檢測手段，基于受體-配體相互作用的受體結合測定技術（receptor-binding assay，RBA）也是篩查分析食品安全相關毒害物質的有效工具和研究熱點［7，12-14］。所謂受體，是指細胞膜或細胞內的一些能與生物活性分子（如藥物、毒素、神經遞質、激素和抗體等，統(tǒng)稱配體）相互作用的生物大分子。和抗體-抗原一樣，受體-配體反應具有高親和力、高特異性和高飽和。受體只能與相應的活性物質結合，因此受體技術在食品安全檢測方面同樣具有準確性。

本文將概述應用于食品檢測的受體種類，以及制備受體的常用表達方式，列舉已經開發(fā)用于食品檢測的具體受體，例如針對抗生素類藥物，生物毒素等。本文也將分析受體在食品安全檢測中的優(yōu)勢和潛在局限性，同時展望受體在食品安全檢測中的應用前景和未來研究方向。

1 受體的概述

廣義上來說，受體的涵蓋范圍很廣。只要能和目標物特異性結合的物質（如核酸、多肽、蛋白質等化合物），都可以被稱為受體。本文所述受體主要聚焦于受體蛋白，是來自于生物體或細胞的生物大分子。

1.1 受體與配體

受體和配體之間有3個相互關聯的功能：①識別和結合，即兩者以高親和力、高特異性識別并結合結構互補區(qū)域；②轉導信號，即受體-配體的相互作用會激活級聯反應，將細胞外的信號傳遞到效應器，比如酶、離子通道等，使它們的活性或構象發(fā)生相應的變化；③產生相應的生物效應，及引起細胞功能變化。另外，如果受體結合的是拮抗劑，那么就會阻斷某個生物效應。從受體-配體的結合角度看，受體具有四大特征：立體選擇性、飽和性、可逆性、高親和力［15］。本文著重介紹：基于受體-配體的特異性識別和結合，可以開發(fā)類似基于抗體-抗原反應的檢測裝置；基于受體-配體結合后產生的信號轉導，可以開發(fā)細胞傳感器，用于檢測目標物。

1.2 受體的分類

根據不同的細胞定位，可將受體分為三大類［15］：①外膜受體，包括神經遞質、絕大多數激素、生長因子、神經營養(yǎng)因子、免疫活性物質以及感覺刺激物等的受體；②內膜受體，即細胞器膜受體，如三磷酸肌醇受體等；③細胞漿膜內的受體，包括類固醇激素和一些脂溶性激素等的受體，這類受體都是在胞質中與配體結合，再移位至細胞核，激活相應基因的轉錄而發(fā)揮作用。由于它們最終與核內的DNA相互作用，故又被稱為核受體。

2 受體蛋白的制備

2.1 表達系統(tǒng)的概述

隨著分子生物相關學科的快速發(fā)展，越來越多的重組蛋白生產系統(tǒng)已經被開發(fā)出來。從最簡單的細菌到高等的轉基因動物，它們都可以作為表達宿主。目前，世界上已開發(fā)完善且得到廣泛認可的重組蛋白表達體系主要包括：大腸桿菌表達系統(tǒng)、酵母表達系統(tǒng)、昆蟲表達系統(tǒng)和哺乳動物表達系統(tǒng)（圖1），這些表達系統(tǒng)具有不同的優(yōu)劣勢（表1）。

表1 4種表達系統(tǒng)的比較Tab.1 Comparison of 4 expression systems

圖1 不同的重組蛋白表達系統(tǒng)Fig.1 Different expression systems for recombinant proteins production

2.1.1 原核表達系統(tǒng)

最常用的原核蛋白表達系統(tǒng)是大腸桿菌E.coli表達系統(tǒng)。大腸桿菌遺傳背景清晰、易培養(yǎng)、基因工程操作簡單，而且繁殖速度快、成本低，商品化表達載體種類齊全，最重要的是外源蛋白表達水平高。缺點是重組表達的蛋白易形成包含體，蛋白復性后易損失活性。在重組蛋白的N 端融合一個信號肽，將蛋白質定位到大腸桿菌的周質空間，通過周質空間的分子伴侶協(xié)助蛋白質正確折疊和二硫鍵形成，一定程度上可以穩(wěn)定蛋白。就本身來源于原核細胞的受體蛋白來說，用大腸桿菌系統(tǒng)表達是最佳的選擇，比如β-內酰胺類抗生素受體［16］。

2.1.2 酵母表達系統(tǒng)

酵母細胞在明確定義的培養(yǎng)基中能夠快速生長，不需要動物源性生長因子的參與，并且可以分泌大量重組蛋白。酵母細胞相對于大腸桿菌表達系統(tǒng)的主要優(yōu)點在于：無內毒素、完整的真核蛋白合成途徑和重組蛋白的分泌能力；另外，在酵母細胞中的蛋白質能夠正確折疊并進行翻譯后修飾，可以用于糖蛋白的表達。因此，當高等生物來源的受體蛋白難以在細菌中表達時，酵母表達系統(tǒng)不失為一個良好的選擇。與哺乳動物細胞系統(tǒng)相比，酵母細胞的蛋白質生產往往更快、更便宜。然而，酵母畢竟是低等的真核生物，其N-糖基化模式單一，可能無法保證重組受體的天然活性，這也是酵母表達系統(tǒng)的主要缺點。

2.1.3 哺乳動物表達系統(tǒng)

對于高等動物來源的重組蛋白，哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是首選。因為哺乳動物細胞的糖基化修飾完整，表達的蛋白折疊正確、活性高，最接近天然蛋白。長期以來，人胚胎腎細胞HEK293被認為是瞬時表達重組蛋白的最佳宿主。如今，隨著培養(yǎng)基成分的優(yōu)化和宿主細胞的工程改造，用懸浮馴化的中國倉鼠卵巢細胞CHO-K1作為瞬時轉染的宿主細胞，能夠進一步提高重組蛋白的產量。值得注意的是，細胞培養(yǎng)需要昂貴的培養(yǎng)基和嚴格的培養(yǎng)條件，而且細胞株構建和發(fā)酵周期長，因此成本較高。

2.1.4 昆蟲表達系統(tǒng)

昆蟲細胞表達系統(tǒng)也屬于真核細胞表達系統(tǒng)，是介于酵母和哺乳動物細胞表達系統(tǒng)之間的存在。昆蟲細胞表達系統(tǒng)的優(yōu)勢如下：生長迅速，蛋白表達量高，易規(guī)?；?；具有糖基化等翻譯后修飾系統(tǒng)；蛋白質的正確折疊，使重組蛋白更加接近天然結構；重組蛋白的可控性定位（核膜或分泌至胞外）；普適性，能表達絕大多數物種來源的蛋白。

2.1.5 無細胞翻譯系統(tǒng)

無細胞翻譯是一種不依賴于活細胞，在體外實現基因轉錄和翻譯過程的蛋白質合成系統(tǒng)（圖2）。該體系的組成主要包括細胞（微生物、動物或植物）裂解液中所含有的蛋白合成所需的必要元件、外源添加核苷酸、tRNA、能量物質等元素和含目的基因的質粒。目前，基于大腸桿菌裂解物的無細胞系統(tǒng)最為常用［17］。此外，真核細胞（小麥胚芽、昆蟲、酵母等）裂解物也可以用于無細胞系統(tǒng)［18-19］。無細胞翻譯系統(tǒng)能夠規(guī)避蛋白生產對細胞生長的影響，適用于膜蛋白的表達和具有細胞毒性蛋白的表達，以及非天然氨基酸的嵌入。相比其他成熟的表達系統(tǒng)，無細胞翻譯在大規(guī)模生產方面尚有不足，特別是真核無細胞系統(tǒng)，細胞培養(yǎng)的成本較高。

圖2 基于無細胞翻譯系統(tǒng)的蛋白制備Fig.2 Protein preparation based on cell-free translation system.

2.2 受體蛋白的表達

對于可溶性的受體蛋白，尤其是來源于細菌的受體，比如磺胺類抗生素受體蛋白［20］，大腸桿菌是最佳的表達宿主，只需要質粒構建、感受態(tài)轉化、誘導表達、親和色譜純化和離子交換純化的流程即可獲得較純的重組蛋白。對于簡單跨膜蛋白，比如β-內酰胺抗生素受體［21-22］，可以通過去除跨膜域的方式來提高受體蛋白的可溶性，提高其表達量，同時保證其對配體親和力的完整性。對于多跨膜域的膜蛋白，比如真核來源的β-興奮劑受體，往往需要用哺乳動物細胞［23］和昆蟲細胞［24］這類真核細胞或無細胞翻譯體系［25］來進行表達。具有磷脂雙分子層的細胞膜或其他膜類結構可以作為膜蛋白的載體，使受體蛋白無需被分離純化，這種膜和受體的復合體能夠保持受體的天然結合功能［26-27］。

2.3 受體蛋白的改造

隨著分子生物學相關技術的日益發(fā)展，人們的研究范圍不僅限于對蛋白質的功能和結構解析，還拓展到了對具有生物（催化）活性的蛋白質的理性設計和改造等領域。基于此類基礎理論研究和技術支撐，合理改造受體蛋白，以提高其親和性、特異性等物化性質，將是合成受體生物應用的重要發(fā)展方向之一。

2.3.1 受體蛋白的定點突變

定點突變技術是分子生物學中研究蛋白質結構和功能特性的寶貴工具［28］。定點突變的設計往往需要與計算機科學（同源建模、分子對接、動力學模擬等）相結合，是有目的地對某一個或某幾個氨基酸進行理性改變。通過基于定點突變的蛋白質合理改造，可以提高蛋白的催化活性或熱穩(wěn)定性等［29］。就基于合成受體的生物檢測而言，Ning 等［30］通過同源建模構建了地衣芽孢桿菌ATCC14580 的BlaR-CTD 的三維結構，同時與40 種β-內酰胺抗生素進行分子對接，系統(tǒng)分析活性口袋附近的關鍵氨基酸并合理設計定點突變，同時插入二硫鍵和鹽橋，最終異源表達了23 種突變受體蛋白。經活性和穩(wěn)定性測試，其中3種突變體對多種β-內酰胺抗生素具有更高的親和力，而I188K/S19C/G24C突變體的穩(wěn)定性最好。這一研究表明，受體蛋白BlaR-CTD 的結構變化會引起其親和力和穩(wěn)定性的改變，為受體蛋白的理性設計研究提供了思路。Wang等［31］也利用了類似方式，對四環(huán)素類抗生素受體蛋白TetR 進行了P105F 和P105Y點突變改造。利用免疫分析方法檢測四環(huán)素時，這兩種突變受體比野生型的親和力和靈敏度更高。

2.3.2 受體蛋白的定向進化

自然界存在“適者生存”的篩選法則，而在實驗室中，科學家們人為設定篩選條件，模擬蛋白質的發(fā)展進化過程，短時間內獲得性能優(yōu)良的蛋白，即蛋白定向進化。最近，研究人員設計構建了人工受體蛋白文庫，利用核糖體展示技術在大腸桿菌裂解液系統(tǒng)中進行體外轉錄和翻譯。經過多輪淘選，從隨機文庫中獲得的3種突變體蛋白對百草枯具有高親和力和檢測靈敏度［32］。該研究中的受體蛋白設計和定向進化篩選過程理論上也適用于其他類型的受體蛋白，具有一定的借鑒參考價值。2018 年諾貝爾化學獎對“定向進化”和“噬菌體展示”的概念給予了肯定，認可該研究在酶和抗體改造方面的重大貢獻［33］。就合成受體的生物檢測應用而言，為了獲得高特異、高親和、高靈敏的受體蛋白，對受體的定向進化改造是大勢所趨。

3 受體在食品安全檢測中的應用

3.1 抗生素殘留

抗生素是一種抑制或殺死細菌的化學物質，是由微生物或高等動植物在生活過程中產生的一類次級代謝產物。得益于其有效的抑菌作用，抗生素被廣泛應用于畜牧業(yè)和水產養(yǎng)殖業(yè)中。然而，抗生素的濫用使其在食品中殘留超標的案例屢見不鮮。對抗生素殘留進行快速、靈敏檢測，是保障食品安全的重要環(huán)節(jié)。受體只能與對應的活性分子相結合，因此受體技術在檢測抗生素方面具有更高的準確性［7］。近些年，基于受體的抗生素篩查分析技術已成為一個研究熱點，應用于檢測β-內酰胺、磺胺、四環(huán)素等抗生素殘留（表2）。

表2 基于受體的抗生素篩查分析方法Tab.2 Receptor-based antibiotic screening and analysis method

3.1.1β-內酰胺的檢測

β-內酰胺類抗生素是化學結構中具有β-內酰胺環(huán)的一大類抗生素，包括青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內酰胺類和碳青霉烯類。β-內酰胺環(huán)具有不穩(wěn)定性，在抗體制備過程中容易降解，因此難以獲得針對完整β-內酰胺類抗生素的抗體。β-內酰胺類抗生素的受體是其抗體的絕佳代替物，人們已經開發(fā)了多種基于受體的檢測方法。

針對肺炎鏈球菌來源的青霉素結合蛋白PBP2x，Zeng 等［21］通過截短N 端的跨膜域，提高PBP2x的可溶性，在大腸桿菌中重組表達受體蛋白PBP2x*?；赑BP2x*建立微孔板檢測方法，45 min 可檢測42 個牛奶樣品的16 種β-內酰胺類抗生素，其中15種的檢測限低于歐盟最大限量規(guī)定。該課題組進一步研究發(fā)現，青霉素結合蛋白3的可溶性部分（sPBP3*）對β-內酰胺類抗生素的親和力更高，可應用于檢測牛奶中的11 種青霉素和16 種頭孢菌素［34］。Lamar 等［35］基于PBP2x*開發(fā)了微孔板檢測法，通過使用HRP 標記的地高辛抗體Fab 片段檢測DIG-AMP/PBP2x*復合物，建立標準曲線可檢測牛奶、肉汁、雞蛋和蜂蜜中的β-內酰胺。Peng等［22］在大腸桿菌BL21（DE3）中重組表達了地衣芽孢桿菌BlaR 的C 端活性域（BlaRCTD），作為β-內酰胺受體蛋白，建立ELISA 方法用于檢測牛奶、牛肉和雞肉3種不同基質中的β-內酰胺類抗生素，可以同時檢測15 種β-內酰胺，其中11 種的檢出限低于歐盟規(guī)定的最大殘留限量。Yuan 課題組［16，30］通過同源建模和分子對接技術，設計了23種BlaR-CTD突變蛋白，篩選獲得高穩(wěn)定性、高親和力的I188K/S19C/G24C 突變受體，建立了酶聯受體檢測方法可檢測13 種食物樣品中的40 種β-內酰胺。Li 等［36］利用I188K/S19C/G24C 的BlaR-CTD 突變受體，結合膠體金免疫色譜（GICA）技術，可以在10 min 內實現對牛奶和雞肉樣品中21種β-內酰胺的快速檢測。

最近，Fan 等［37］基于四環(huán)素抗體和青霉素結合蛋白PBP-6，構建表面增強拉曼散射（SERS）的免疫傳感器，實現了四環(huán)素和青霉素的聯合檢測，其中對青霉素的檢測限可達0.010 ng/mL，IC50值為1.77 ng/mL，是目前最靈敏的生物分析方法。

3.1.2 磺胺類抗生素的檢測

磺胺類藥是一類具有廣譜抗菌活性的合成抗生素，在獸醫(yī)醫(yī)學中被廣泛用于預防和治療傳染病。就磺胺類藥而言，基于受體的檢測方法很少。二氫葉酸合成酶（DHPS）是磺酰胺類的受體之一，該受體是葉酸輔酶因子合成過程中的關鍵酶。抗微生物試劑（如磺胺和氨苯砜）是對氨基苯甲酸（PABA）的競爭抑制劑，通過競爭結合DHPS，影響二氫葉酸的合成，最終抑制細菌的生長。

Liang 等［20］在大腸桿菌中表達肺炎鏈球菌來源的DHPS，用于開發(fā)新型微孔板檢測法以檢測磺胺類藥。該方法是基于磺胺類藥和HRP 標記的磺胺類衍生物之間的競爭作用，在最佳條件下，對9 種磺胺類藥和PABA 的檢測限可達100 ng/mL 以下；對于28 種不同磺胺類藥，IC50值在426～50 000 ng/mL 之間。該檢測方法雖然靈敏度不夠高，但是具有很強的獨創(chuàng)性，為檢測磺胺類藥物提供了新的思路。在后續(xù)工作中，該團隊合成的DHPS-DHPPP（二氫蝶呤焦磷酸）二元復合物，對磺胺類藥具有更高的親和力，繼而開發(fā)了熒光偏振測定法（FPA）和生物傳感器，可檢測牛奶樣品中29 種磺胺類藥，IC50值小于100 ng/mL［38-39］。基于DHPS-DHPPP 復合物的生物傳感器同樣可以檢測不同基質中的磺胺類藥，以磺胺甲嘧啶（SMZ）為例，其在雞肉、豬肉、雞蛋和蜂蜜中的檢出限分別為17.82 μg/kg、20.55 μg/kg、23.22 μg/kg和5.57 μg/kg［40］。

3.1.3 四環(huán)素藥物檢測

四環(huán)素藥物（TC）是一類廣譜抗菌藥物，在人類和動物中廣泛用于治療細菌性疾病。在自然界中，某些抗TC 的細菌具有特殊Tet 阻遏蛋白（TetR），可以特異性結合TC 并將其轉移出細菌［49-50］。

在含有四環(huán)素的條件下，TetR 會與同源操縱子tetO 解離，這種解離效應和四環(huán)素濃度之間存在劑量關系。21 世紀初，瑞士的科研人員利用該原理，在微孔板或PVDF 膜上固定tetO，用mouse anti-His 和anti-mouse IgG-HRP 間接法檢測His 標記的TetR，實現對四環(huán)素的定量。在牛奶和牛血清基質中微孔板法的檢測限是0.1～7.2 ng/mL［41］；在牛奶、肉末、牛血清基質中試紙條法的線性范圍是5～10 ng/mL［42］。Wang等［43］將TetR視為四環(huán)素的受體，在大腸桿菌Rosetta-gami（DE3）中表達TetR 受體蛋白，通過分子對接技術探究其對四環(huán)素的識別機理，最終建立了基于TetR 的化學發(fā)光免疫分析方法，可用于測定牛奶中的5種四環(huán)素藥物，檢測限為5～16 pg/mL，空白牛奶樣品中的添加回收率在71.7%～95.8%之間。同年，作者通過定向進化獲得TetR 蛋白結合口袋的關鍵氨基酸Pro105的兩種突變體，能夠同時識別9種四環(huán)素藥物。與野生型TetR相比，它們具有更高的親和力和靈敏度?；谧顑?yōu)突變體開發(fā)的競爭性熒光免疫測定法，可以檢測雞蛋樣品中的9種四環(huán)素藥物，IC50值在3.1～17.2 ng/mL，檢測限在0.3～5.8 ng/mL［31］。Meyer 等［44］建立了基于TetR-tetO 的可再生化學發(fā)光受體測定法，適用于檢測環(huán)境和食品樣品中四環(huán)素。雖然該研究僅針對加標自來水，且檢測限僅為0.1 μg/L，不過可回收、可再生性是它的一個亮點和特色。

3.1.4 大環(huán)內酯類檢測

大環(huán)內酯類抗生素是一類分子結構中具有12～16 碳內酯環(huán)的抗菌藥物。Weber 等［45］以哺乳動物細胞為模型，在細胞內構建基于大環(huán)內酯類調控蛋白MphR（A）及其操縱子ETR 的調控系統(tǒng)，通過調控表達分泌型堿性磷酸酶作為標志物，檢測大環(huán)內酯類抗生素。M?hrle 等［46］采用類似的方式構建微生物傳感器，以熒光素酶基因表達產物作為檢測信號。Weber 等［41］基于MphR（A）和ETR 建立了類似ELISA 的微孔板法，可檢測紅霉素、竹桃霉素、克拉霉素、羅紅霉素、阿奇霉素，檢測限分別為1.7 ng/mL、26 ng/mL、63 ng/mL、605 ng/mL、5000 ng/mL。Cheng 等［47-48］在前人的研究基礎上，對大環(huán)內酯類抗生素調控蛋白MphR（A）、MphR（E）與不同操縱子DNA 的組合進行優(yōu)化，最終以MphR（A）和A-DNA為基礎，采用蛋白和抗生素藥物分步反應的方式，建立了檢測原奶中紅霉素殘留的類ELISA 系統(tǒng)，CCα 值為43.28 ng/mL， CCβ 值 為46.44 ng/mL。 然 而，MphR（A）僅對紅霉素具有高親和力，限制了此類方法的實用性，若要作為實際應用產品，仍需要進一步深入研究。

3.2 農藥殘留

百草枯（PQ）是一種水溶性的季銨鹽除草劑，長期以來在農業(yè)、園林業(yè)等領域被廣泛使用。膽素結合蛋白（bilin-binding protein，BBP）是一種脂質運載蛋白，Li 等［32］利用核糖體展示技術，經數輪篩選，獲得并鑒定3 個BBP 變體，對PQ 復合物具有高親和力，IC50值低至14.039 ng/mL±0.970 ng/mL，檢測限達到0.083 ng/mL±0.011 ng/mL。BBP 作為一種穩(wěn)定的半抗原的受體蛋白，有潛力成為重組抗體片段的替代品，在生物分析領域具有較高的應用價值。

3.3 非法添加劑

3.3.1 β興奮劑的受體

β 興奮劑，即β-腎上腺素受體激動劑，是一類體能增強藥物，會被一些運動員違規(guī)濫用。Bovee等［51］基于放射性標記的β 興奮劑和可溶性的受體建立了β 興奮劑的發(fā)光檢測方法。在無β 興奮劑的條件下，放射性標記的β 興奮劑仍然與受體結合，通過計數測量發(fā)光強度；在含有β興奮劑藥物的條件下，藥物競爭結合受體并取代放射性標記的β興奮劑，發(fā)光強度減弱。該方法可實際檢出真實的陽性樣本。

在牲畜養(yǎng)殖業(yè)，β 興奮劑被用于促進家畜動物的生長。β 興奮劑在我國是被嚴禁使用的。β 興奮劑包含多種不同的藥物，因此基于β興奮劑受體結合的檢測方法具有一定的廣譜性優(yōu)勢。Wang 等［23］利用人胚胎腎細胞HEK293 表達重組β 興奮劑受體蛋白β2-AR，開發(fā)了一種基于β2-AR的酶聯受體測定法（ELRA）。該方法類似競爭法ELISA，可用于豬尿中克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的快速高通量檢測，對應的IC50值分別為34 μg/L、53 μg/L 和63 μg/L。在后續(xù)工作中，該作者所在課題組利用無細胞翻譯系統(tǒng)［25］和SF9 昆蟲細胞表達系統(tǒng)［24］表達了β2-AR 并建立ELRA。用無細胞翻譯系統(tǒng)可提高β2-AR 的表達量至1.1 mg/mL，但對β 興奮劑的檢測靈敏度會有所下降，針對克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺的IC50值分別為45.99 μg/L、60.38 μg/L 和78.02 μg/L。β2-AR 在昆蟲細胞表達系統(tǒng)中的表達量更高， 可達1.23 mg/mL，ELRA 檢測方法對3種β興奮劑的IC50值分別為28.36 μg/L、50.70 μg/L、59.57 μg/L，呈現出更好的檢測性能。Cheng 等［52］利用SF9 細胞表達了敘利亞倉鼠肺來源的β2-AR并建立ELRA方法，針對萊克多巴胺的檢測限為5.20 μg/L，IC50值為30.38 μg/L。值得一提，重組受體β2-AR 也可以通過大腸桿菌E.coli［53］、釀酒酵母［54］和其他哺乳動物細胞［55］等體系表達，不過能否適用于β 興奮劑的檢測仍有待進一步研究。理論上來說，哺乳動物細胞中表達的受體蛋白在結構上與天然受體最為接近，也最具有應用前景。基于受體的非法添加劑篩查分析方法見表3。

表3 基于受體的非法添加劑篩查分析方法Tab.3 Receptor-based screening and analysis method of illegal additives

3.3.2 磷酸二酯酶PDE5抑制劑

磷酸二酯酶PDE5 抑制劑是一類用于治療勃起功能障礙的藥物，市場上用于增強性功能的膳食補充劑產品經常摻入PDE5 抑制劑，對人體健康造成影響。Santillo 等［56］基于PDE5 抑制劑對PDE5活性的抑制作用，開發(fā)了一種熒光檢測方法來快速檢測摻假產品中的PDE5 抑制劑。在不含基質的溶液中，可以靈敏檢測9 種PDE5 抑制劑，IC50值在0.4～4.0 ng/mL 之間。在空白基質加標1 mg/g 的濃度下，成功檢測到所有9種摻假物。該方法可在15 min內同時分析40多個樣品。

3.4 真菌毒素

真菌毒素是由絲狀真菌產生的有毒次生代謝物或有機化合物。目前人們已經發(fā)現超過300種真菌毒素，其中較為常見且危害較大的霉菌毒素包括黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、單端孢霉烯、伏馬毒素、玉米赤霉烯酮、展青霉素、橘霉素和交鏈孢霉毒素等，它們主要產自于鐮刀菌、曲霉菌、青霉菌和交鏈孢霉菌等不同菌屬［57-59］。目前，基于天然受體的真菌毒素檢測方法鮮有報道，只有少量基于多肽片段的真菌毒素識別研究，而且設計具有高親和力的新型多肽受體仍具有挑戰(zhàn)性［60-61］。

Bazin 等［62］固相合成來自氧化還原蛋白的不同多肽片段，通過HPLC評估多肽結合赭曲霉毒素OTA 的能力，篩選獲得OTA 結合肽NFO4 并建立競爭性ELISA，可用于檢測紅葡萄酒基質中的OTA，檢測限可達2 μg/L。該課題組以OTA 結合肽NFO4為基礎，對檢測體系進行了更加深入的研究，將NFO4 分別和三維多孔殼聚糖載體［63］和電流傳感器［64］聯合使用，能夠稍微提高對OTA 的檢測靈敏度。Heurich等［65］通過計算模型設計，從多肽文庫中篩選出兩個與OTA 有親和力的肽段：八肽和十三肽。雖然這兩種多肽在體外均能與OTA結合，但是該研究并未以此建立OTA 的競爭性檢測方法。

除了多肽受體外，還有基于分子印跡蛋白的玉米赤霉烯酮（ZEN）［66］和黃曲霉毒素（AFB1）［67］檢測方法，可用于真實樣品中真菌毒素的檢測。

3.5 海洋生物毒素

海洋生物毒素是由微觀藻類產生的天然化學物質，可以在貝殼類和魚類等水生生物中蓄積。人類位于食物鏈頂端，誤食海洋生物毒素污染的水產品會對人類的生命健康造成極大的威脅［68-69］。

3.5.1 環(huán)亞胺類毒素檢測

環(huán)亞胺類毒素是鞭毛藻來源的神經毒素，它們是煙堿乙酰膽堿受體（nAChR）的有效拮抗劑。利用富含煙堿乙酰膽堿受體的電鰩細胞膜和熒光標記的α-金環(huán)蛇毒素，Vilari?o等［70］建立了熒光偏振定量檢測方法，原理是檢測物中的環(huán)亞胺抑制了金環(huán)蛇毒素與nAChR 的相互作用，產生熒光偏振變化。該方法可用于檢測貽貝提取物中裸草胺-A 和13-去甲基螺旋內酯C，檢測范圍分別是50～2000 μg/kg 和70～700 μg/kg。該方法對檢測蛤蚌、牡蠣、扇貝基質中裸草胺-A 和13-去甲基螺旋內酯C 具有普適性［71］，而且適用于檢測13，19-去二甲基螺旋內酯C，定量范圍為40～200 μg/kg［72］。在前人的基礎上，Otero等［73］用熒光素衍生物直接標記nAChR，開發(fā)了螺環(huán)內酯的熒光偏振直接測定法，從間接識別到直接識別的轉變使得檢測靈敏度和速度都顯著提高。

基于相同的傳感特性，具有不同檢測技術的固相受體結合檢測方法已經被開發(fā)出來［74-77］。原理類似競爭抑制ELISA，比如待測物中環(huán)亞胺與固相上的毒素競爭結合其受體，再用受體的一抗、HRP-二抗檢測受體的量，從而計算目標物的含量。Aráoz 等［75］基于環(huán)亞胺類毒素對α-金環(huán)蛇毒素與nAChR 結合的競爭性抑制，開發(fā)了受體結合微孔板測定法，能夠檢測貝類樣品中的環(huán)亞胺類毒素。該方法具有高靈敏度和可重復性，但是選擇性較低，需結合質譜分析才能確認毒素類型。Rodríguez 遵循類似的原理，利用微球/流式細胞儀系統(tǒng)開發(fā)了基于受體的螺內酯檢測方法，所用的受體分別是石紋電鰩來源的nAChR 和靜水椎實螺來源的乙酰膽堿結合蛋白（AChBP）。通過將nAChR 或AChBP 固定在羧化微球表面上，用環(huán)亞胺與α-金環(huán)蛇毒素競爭結合受體蛋白的方式來進行熒光定量檢測。經簡單樣品前處理，該方法可以靈敏檢測貽貝、扇貝和蛤蚌中13-去甲基螺旋內酯C，檢測范圍為10～6000 μg/kg［76］。

3.5.2 其他海洋生物毒素

軟骨藻酸是一種興奮性神經遞質谷氨酸酯的類似物。Van Dolah 等［26］開發(fā)了一種受體測定法，即在SF9 昆蟲細胞膜上表達了谷氨酸受體GLUR6，利用競爭法檢測軟骨藻酸。由于GLUR6 同樣能夠識別谷氨酸，所以檢測樣品必須經過去谷氨酸處理，使得該方法具有一定的局限性。Van Dolah 和來自6 個不同國家的9 所實驗室合作，開展了一項針對麻痹性貝類毒素的受體結合測定研究。該研究基于提取物與3H 標記的蛤蚌毒素（3H-saxitoxin）競爭結合大鼠腦膜的鈉離子通道，3H-saxitoxin 結合數量的減少與海鮮中存在的貝類毒素量成比例［78］。

海葵毒素（PLT）是一種高毒性非肽類海洋天然產物，具有復雜的化學結構，其作用靶點是Na+，K+-ATPase 酶。Alfonso 等［79］結合熒光偏振開發(fā)了一種基于Na+，K+-ATPase和?？舅叵嗷プ饔玫臋z測方法，用熒光偏振度來量化?？舅貪舛?。該方法可以檢測貽貝樣品和鞭毛藻培養(yǎng)物中海葵毒素，定量限為10 nmol/L，檢出限為2 nmol/L。隨后，該團隊還開發(fā)了基于Na+，K+-ATPase的表面等離子體共振生物傳感器，對?？舅氐臋z出限為3.73 pg，定量限為11.20 pg［80］。

3.6 生物性污染

食源性致病菌是導致食品安全問題的重要來源，檢測食品中存在的食源性致病菌對于預防傳染病的傳播至關重要。利用感官受體蛋白構建電子鼻、舌，可以用于食品質量和安全評估［81］。

受真菌污染的谷物中會產生1-辛烯-3-醇，可以被特定人類嗅覺受體（OR）所識別。Ahn 等［27］利用人胚胎腎細胞HEK293 生產含OR 的納米囊泡，并將囊泡整合到單壁碳納米管場效應晶體管（swCNT-FET）中，構建了對特定氣味的感知和信號放大系統(tǒng)。該系統(tǒng)對1-辛烯-3-醇具有高選擇性，因此可以有效用于谷物中真菌污染的實時測量，檢測靈敏度可達1 fmol/L。遵循類似的手法，Son等［82］利用兩種人類嗅覺受體OR51S1 和OR3A4，分別用以識別細菌產生的土臭素（GSM）和2-甲基異冰片醇（MIB），結合swCNT-FET 放大信號，所構建的電子鼻可以實現對自來水、瓶裝水和河水中細菌的檢測，靈敏度低至10 ng/L。Sankaran等［8］利用來自果蠅增香劑結合蛋白LUSH 的多肽片段作為感知材料，開發(fā)了石英微天平（QCM）傳感器，以檢測指示包裝牛肉中沙門氏菌污染所產生的揮發(fā)性有機化合物，如3-甲基-1-丁醇和1-己醇。

RAW264.7 免疫細胞表面富含受體蛋白比如TLR，能夠識別病原體相關分子模型（PAMP）。細胞被細菌污染后，最終會激活細胞因子的表達，比如TNF-α。基于這一原理，Seo等［83］以RAW264.7細胞為感知元件，用雙抗體夾心的傳感器檢測TNF-α，形成檢測信號，可以應用于實時檢測牛奶樣品中的志賀氏菌、金黃色葡萄球菌和單核細胞增生李斯特氏菌等致病細菌。不過，該傳感器的信號傳導易受培養(yǎng)基的攪動程度和體積影響，這勢必會影響在實際應用中的推廣。再者，這種傳感器雖然基于受體-配體結合的原理，但是其檢測信號本質上是經由復雜通路激活產生的，在穩(wěn)定性上可能會有所欠缺。

3.7 瑞鮑迪苷A

瑞鮑迪苷A（Reb-A）是一種甜菊醇糖苷，是可以從菊科甜菊中提取的天然甜味劑。Reb-A在高溫條件下具有良好的穩(wěn)定性，因此在食品中被廣泛使用。Arodola等［84］通過同源性建模、分子對接和分子動力學模擬等計算機輔助技術，闡明了Reb?A 和人類甜味受體T1R2 單體之間的相互作用關系，構建了基于T1R2-Reb-A 復合物、氧化鋅納米顆粒（ZnO-NPs）和氧化石墨烯（GO）的電化學傳感器，用于檢測Reb-A，遺憾的是該方法沒有落實到真實樣品的檢測。另外，該作者所在團隊［85］還開發(fā)了一種新型的細胞色素C 修飾的納米復合電化學生物傳感器，用于測定不同食品樣品中的Reb-A。雖然目前還沒有關于甜菊糖苷對健康危害的報道，但考慮到此類甜味劑在食品工業(yè)中的廣泛使用，上述檢測方法可能在未來有一定的應用前景。

4 受體用于食品安全檢測的優(yōu)缺點

傳統(tǒng)抗體的制備都要經由動物免疫，不僅周期長，而且需要熟練的操作技藝。另外，對于本身帶有毒性的待測物，動物經免疫后易死亡，獲得特異性抗體難度較大。受體的制備主要通過在細胞中重組表達產生的，相對制備周期短、效率高。此外，受體還具有檢測優(yōu)勢，受體最重要和獨特的特征是特異性，受體可以與特定藥物類別中許多藥物組合，無論其結構相似性如何。遇到同一類別的多種藥物的混合物并不少見，對應某一類非法添加物，受體的另一個優(yōu)點得以呈現，即受體測定方法能夠對包含多種藥物的混合物產生單一的信號響應。受體在這類混合物的檢測中往往能發(fā)揮重大作用。對于一些高毒素分子和低免疫原性的分子，往往無法通過制備單克隆抗體的方式檢測，受體檢測是絕佳的選擇。和基于抗體的檢測方法類似，受體同樣可以和多種標記技術串聯使用，從而獲得更高的檢測靈敏度。

常規(guī)的單克隆抗體，往往需要經過多次免疫和篩選的過程，以不斷完善抗體的高親和力進化。相比之下，天然的受體蛋白與配體的親和力相對固定。隨著檢測要求的不斷提高，其性能可能難以達標。另外，相比抗體，蛋白的穩(wěn)定性較差是酶標受體的缺點之一。受體對藥物分子的識別通常具有廣譜性，對于一類化合物中某種特定藥物的高特異性檢測，恐怕很難滿足。再者，一些受體蛋白，特別是含有多個跨膜域的膜蛋白，由于其本身性質，在不同的蛋白表達系統(tǒng)中表達量都不會太高，不易制備，或者制備所得受體物質活性會有所損失，導致特異性減弱。要想真正將此類受體應用于食品檢測，這是必須要改進的一個方面。

5 展望

21 世紀是生物技術學科飛速發(fā)展的時代，分子生物學和合成生物學技術和理論的不斷革新，進一步推動受體結合測定技術的進步。目前，基于受體蛋白的受體結合測定技術已經成為食品安全檢測的有效手段，可應用于檢測食品中抗生素、農藥、生物毒素、病原菌、非法添加物等多種危害物質殘留，展現出不俗的未來發(fā)展前景和一定的市場應用潛力。究其原因，是不斷的生物進化或人為進化過程使受體蛋白對配體（如危害物質）具有高親和力和特異性，從而成為配體的“天然靶標”。特別是當受體蛋白能夠識別某一類物質的共有位點或被某一類物質的共有位點抑制活性時，那么就可以利用受體蛋白實現對此類物質的廣譜性檢測。比如，基于β-內酰胺受體蛋白的檢測技術發(fā)展較為成熟，已有多款檢測試劑盒（試紙條）類產品實現商品化，用于β-內酰胺類抗生素的快速、靈敏檢測。

不過，許多基于受體蛋白的檢測方法仍處于實驗室研究階段，亟待解決的瓶頸問題主要包括受體蛋白的穩(wěn)定性、特異性或廣譜性等。隨著分子克隆和基因工程等生物技術的快速發(fā)展，“定向進化”和“噬菌體展示”的概念已逐漸被人們所認可且熟知。研究人員通過對酶的定向改造，可以使其擁有更高的活性和穩(wěn)定性［86］、更多的選擇性和功能性［87-88］。噬菌體展示技術是目前最高效的高通量篩選手段之一，能夠實現基因型（DNA 序列）和表型（高親和力、高特異性）的完美對接，適用于篩選優(yōu)質的結合蛋白或抗體［33］。對于正在開展檢測應用研究的受體蛋白來說，這些技術的合理利用是解決上述瓶頸的關鍵。利用同源建模、分子對接和動力學模擬，預測受體蛋白識別和結合配體的活性位點。針對相關位點設計隨機突變引物，結合PCR 擴增技術構建受體蛋白噬菌體展示文庫。通過對受體蛋白的定向進化設計，改變其特異性或提高其親和力、穩(wěn)定性，從而擴展其在食品檢測中的應用將是未來的研究熱點。另一方面，對危害物質的檢測可以借助能夠被危害物質抑制的酶，或者能夠代謝危害物質的酶，又或者能夠識別、轉運危害物質的酶。這些酶都是能和危害物質相互作用的蛋白，均可視為危害物質的潛在“受體蛋白”。因此，將來開發(fā)此類受體蛋白并運用于食品安全檢測也具有不錯的研究前景。

通過多學科交叉研究的方式，開發(fā)更廉價的檢測設備，實現受體信號的轉換和放大；針對不同類型受體蛋白，優(yōu)化不同底盤生物中的表達條件，實現受體蛋白的量產化，從而降低受體檢測應用的價格；一些難以制備抗體的小分子毒害物質，可以嘗試使用其天然的受體或定向篩選非天然受體，比如分子印跡蛋白質、多肽片段等。以上都是未來值得研究的方向。