劉奇奇，王春玉，齊天翊，朱明盛，黃興祿

（南開大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，藥物化學(xué)生物學(xué)國家重點實驗室，生物活性材料教育部重點實驗室，納米酶聯(lián)合實驗室，天津300071）

近年來，隨著合成生物學(xué)的興起，如何對生物體進行理性設(shè)計、改造乃至從頭合成，成為這一領(lǐng)域的研究熱點。目前，科學(xué)家已經(jīng)能夠?qū)怂帷⒌鞍踪|(zhì)、脂質(zhì)、酶等生物基大分子進行設(shè)計和合成。酶作為其中重要的一部分，是維持生物體正常生命活動所不可缺少的。近一個世紀(jì)以來，酶學(xué)研究一直處于科學(xué)研究的重要位置，多次獲得諾貝爾獎，如1946 年的諾貝化學(xué)獎揭示了酶的化學(xué)本質(zhì)是蛋白質(zhì)；1989 年核酶的發(fā)現(xiàn)，闡明了酶的復(fù)雜性和多樣性；2018 年諾貝爾化學(xué)獎授予酶的定向進化技術(shù)等。天然酶具有極強的催化能力，能在常溫常壓下將化學(xué)反應(yīng)的速度提高107～109倍，因此具有廣泛的應(yīng)用價值，預(yù)計到2024 年全球酶市場將達到105億美元［1］。隨著人們對其需求越來越大，天然酶在來源、提取、保存、使用等方面的諸多弊端也被暴露出來。

為應(yīng)對以上問題，人工酶（artificial enzyme）的研究被提上日程，也是酶學(xué)研究中一個重要里程碑。通常，研究人員可以尋找并模擬大自然的智慧，通過計算［2］和直接進化［1］的方式進行人工酶的設(shè)計和構(gòu)建；或者，研究人員也可以通過研究酶的物理化學(xué)內(nèi)在相互作用，使用合成材料來構(gòu)建人工酶［3］。隨著近年來納米技術(shù)的發(fā)展，一些納米材料自身也展現(xiàn)出一些類酶的活性，即納米酶（nanozyme）。納米酶的研究使得納米材料具有了除光、熱、磁等以外的新特性，也使得納米材料的內(nèi)涵和應(yīng)用都得到了進一步的提升。作為一種新型人工酶，目前納米酶的研究基本上還是屬于材料領(lǐng)域的延伸，嚴(yán)格意義上與合成生物學(xué)的內(nèi)容相差甚遠。最近，我們以基因重組的重鏈鐵蛋白作為蛋白骨架，通過仿生、創(chuàng)造等理念，在其內(nèi)腔中合成了一系列的納米酶新材料，從而融合蛋白骨架的靶向和納米酶的催化等性能于一體。鑒于這種策略實現(xiàn)了合成生物學(xué)、納米酶催化和納米生物學(xué)等技術(shù)的深度融合，在此我們將其命名為“合成生物納米酶”。本文將從納米酶的基本概況、天然蛋白骨架納米酶、基因改造蛋白骨架及合成生物納米酶4 個部分展開綜述。

1 納米酶的基本概況

納米酶（nanozyme）是一類本身蘊含酶學(xué)特性的納米材料，能夠催化酶的底物，產(chǎn)生同天然酶類似的催化反應(yīng)，并具有酶促反應(yīng)動力學(xué)等特征，屬于一類新型模擬酶［4-5］。與天然酶類似，納米酶可以在溫和的生理條件下高效催化酶的底物，因其可調(diào)的催化活性、苛刻條件下的高穩(wěn)定性、組成和結(jié)構(gòu)設(shè)計的靈活性以及優(yōu)異的生物相容性等優(yōu)勢，成為了天然酶的理想替代品［6-7］。2007年，閻錫蘊院士團隊［8］首次報道并證明了磁性四氧化三鐵納米顆粒的類過氧化物酶活性。隨著近年來納米技術(shù)、合成生物技術(shù)、催化和理論計算的飛速發(fā)展，越來越多具有不同類酶活性的納米酶被發(fā)現(xiàn)或設(shè)計，納米酶的優(yōu)勢也逐漸被挖掘出來（表1）。

表1 天然酶與納米酶優(yōu)缺點對比［9］Tab.1 Advantages and disadvantages of natural enzymes and nanozymes［9］

合成的納米酶可以模擬天然酶的結(jié)構(gòu)或功能，能夠催化與酶相同的底物和化學(xué)反應(yīng)，主要模擬的酶類型有氧化還原酶和水解酶等，有些納米酶可同時表現(xiàn)出雙酶或多酶活性，這些活性被廣泛應(yīng)用于生物傳感、生物成像、抗菌、抗氧化、疾病診斷治療等領(lǐng)域［10］。盡管納米酶具有同天然酶類似的催化反應(yīng)及酶促反應(yīng)動力學(xué)等特征，但在其特異性、高效性和催化類型的豐富性等方面與天然酶相比還有所差異。因此，納米酶近年來的研究重點也致力于增強納米酶的催化活性，改善納米酶的催化特異性及豐富納米酶的催化類型等。與天然酶相比，納米酶的優(yōu)勢之一是更容易進行理性設(shè)計［11］，研究人員可以通過仿生設(shè)計、高通量計算等手段增加其各方面的性能［12-15］。然而，目前納米酶的催化機制還較為模糊，主要原因是其研究受限于納米酶種類的多樣性、結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及催化位點的不確定性等，如：納米材料的尺寸、形貌、組成成分及表面修飾等都會影響其類酶活性［7］。最近，對于納米酶催化機理的研究已取得一定進展，此方面的工作在多篇綜述中進行了總結(jié)［16-19］，在此主要關(guān)注于納米酶的功能化設(shè)計及在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。

近年來，納米酶代替天然酶在開發(fā)免疫傳感器中顯示出低成本、穩(wěn)定性好、靈敏度高和選擇性強的優(yōu)點。過氧化物酶樣納米酶用于構(gòu)建多功能 生 物 傳 感 器［20-22］已 被 廣 泛 研 究。 例 如，Wei 等［23］通過將葡萄糖氧化酶與具有類過氧化物酶活性（peroxidase，POD）的Fe3O4納米酶結(jié)合，開發(fā)了一種兼具敏感性和選擇性的葡萄糖傳感策略。納米酶制備的納米探針還可以快速靈敏地檢測病毒，Duan 等［24］通過將Fe3O4納米顆粒作為探針，開發(fā)了基于Fe3O4納米酶的免疫試紙條（nanozyme-strip），可檢測低至1 ng/mL的埃博拉病毒糖蛋白，將埃博拉病毒檢測的精度提高了近百倍，檢測的敏感性與ELISA 方法相當(dāng)，但是速度要快得多，可在30 min 內(nèi)完成且更為簡單，這為埃博拉病毒疫情的診斷提供了便捷有效的篩查工具（圖1）。

圖1 納米酶試紙條的設(shè)計［24］（a）標(biāo)準(zhǔn)膠體金試紙條；（b）納米酶試紙條，利用納米酶的活性，可以與底物發(fā)生顯色反應(yīng)，實現(xiàn)肉眼可見的增強信號Fig.1 Design for nanozyme-strips［24］(a)Colloidal gold strips;(b)Nanozyme-strips.Probe with nanozyme activity generates a color reaction with substrates,which significantly enhances the signal so that it can be visualized by naked-eyes

此外，納米酶對活性氧（reactive oxygen species，ROS）的調(diào)控能力使其具有抗腫瘤［25］、抗氧化［26］和抗菌［27］等治療潛力。以抗腫瘤治療為例，納米酶首先可以通過被動方式和主動方式靶向腫瘤細胞，然后利用類氧化物酶（oxidase，OXD）和POD 活性直接生成或協(xié)同增強ROS 來殺傷腫瘤細胞；或者通過其過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，將腫瘤微環(huán)境的H2O2催化生成O2，可以有效緩解腫瘤組織乏氧，促進腫瘤細胞凋亡，也可以提高光動力、聲動力和放射治療等需氧治療方法的效率。Fan 等［28］利用氮摻雜多孔碳納米球開發(fā)了一種具有4 種類酶活性（OXD、POD、CAT 和SOD）的納米酶。在酸性條件下，碳氮納米酶可以通過OXD 和POD 活性催化氧和過氧化氫生成活性氧自由基殺傷腫瘤細胞，在中性環(huán)境中，它們會發(fā)揮CAT 和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，能夠清除自由基保護正常細胞不受損害。

納米酶可以有效減輕氧化應(yīng)激引起的損傷，即抗氧化作用。例如，ROS 可能是腦型瘧疾發(fā)生過程中損害血腦屏障的重要介質(zhì)，Zhao 等［29］針對腦內(nèi)皮細胞中ROS 上升的特點，設(shè)計合成了鐵蛋白納米酶，其在中性條件下具有的CAT 活性可以保護血腦屏障內(nèi)皮細胞免受ROS 損傷，顯著提高了實驗性惡性腦瘧小鼠的存活率。同時鐵蛋白納米酶和抗瘧疾藥物蒿甲醚聯(lián)合給藥時可以顯著減輕惡性腦瘧小鼠腦部炎癥和記憶障礙。納米技術(shù)在抗菌、抗病毒方面也展示了巨大的應(yīng)用潛力［27］。目前，抗菌納米酶主要包括金屬基化合物、碳基納米材料、過渡金屬硫化物/過氧化物/氧化物、單原子納米酶和金屬有機框架（metal-organic frameworks，MOFs）基 化合 物等［27，30-33］。例 如，石墨烯量子點（GQDs）是一種具有類POD 活性的碳納米材料，GQDs 催化過氧化氫分解生成具有較高抗菌活性的羥基自由基，以達到殺滅細菌的作用，對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌均具有廣泛的抑菌活性［33］。

2 天然蛋白骨架納米酶

基于天然蛋白為骨架設(shè)計的納米酶，通常以天然蛋白質(zhì)為載體，與納米酶共同組成復(fù)合材料。該系統(tǒng)具有如下優(yōu)勢：

（1）良好的生物相容性：天然蛋白骨架大多為內(nèi)源性物質(zhì)，具有低毒和低免疫原性，并且代謝產(chǎn)物安全。

（2）較強的穩(wěn)定性：天然蛋白通常在一定的溫度和酸堿度下保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對于一些如金屬納米團簇/顆粒材料等不穩(wěn)定的納米酶，天然蛋白骨架可以通過與其結(jié)合或包載提高整體穩(wěn)定性。

（3）出色的靶向能力：許多天然蛋白可以通過與某些細胞表面受體天然的親和力實現(xiàn)靶向遞送。

（4）可延長體內(nèi)半衰期：一些天然蛋白可以通過躲避免疫系統(tǒng)的識別和清除（如血清白蛋白等），延長自身在循環(huán)系統(tǒng)中存在的時間。

天然蛋白骨架原位合成或包載納米酶通常利用了蛋白配體和金屬之間存在的相互作用，這種相互作用主要與金屬攜帶的正電荷有關(guān)，同時蛋白質(zhì)的局部電荷和構(gòu)象特征也會影響金屬結(jié)合位點的活性高低［34］。蛋白質(zhì)與金屬配位主要依靠的是側(cè)鏈殘基上能夠提供電子的氨基酸。例如，存在于螺旋或β鏈中的組氨酸通過咪唑環(huán)上氮提供的孤對電子與金屬元素配位［35］；存在于螺旋、轉(zhuǎn)角和環(huán)中的天冬氨酸和谷氨酸通過羧酸基團與金屬元素結(jié)合［36］。主鏈上的羰基氧也參與一些金屬元素的結(jié)合，尤其是Ca（Ⅱ）［37］。

白蛋白是血液中最為豐富（35～50 g/L 人血清）的血漿蛋白。作為一種內(nèi)源性的蛋白，白蛋白無免疫原性，由肝臟合成，主要用于維持血漿pH 和滲透壓［38］。白蛋白具有半衰期長、水溶性好的特點，在人血液中的半衰期約為19 d，以此合成納米酶可保持納米酶相對較長時間不被清除，使得納米酶能夠更持久地發(fā)揮活性。目前對于白蛋白金屬結(jié)合位點的研究已經(jīng)比較清晰，大多數(shù)的哺乳動物白蛋白主要包含4 個金屬結(jié)合位點［39］，分別是位于N 末端的結(jié)合位點（N-terminal site，NTS）、Cys34 及其附近的環(huán)境、位于界面處的多金屬結(jié)合位點A（multi-metal binding site，MBS）和位置暫時未知的金屬結(jié)合位點B，這4 個金屬結(jié)合位點在蛋白結(jié)構(gòu)和金屬離子結(jié)合特異性上存在較大的差異。

人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）是最為常見的兩種白蛋白類納米酶骨架。其中，HSA的整體三維結(jié)構(gòu)呈心形，由3 個同源結(jié)構(gòu)域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組成，每個結(jié)構(gòu)域包含兩個亞結(jié)構(gòu)域（A和B）［40］（圖2）。目前研究表明，HSA 中存在多個配體結(jié)合位點，能通過共價或非共價的結(jié)合方式實現(xiàn)藥物或金屬等物質(zhì)的搭載，因此是與納米酶結(jié)合的理想載體。HSA 還具有天然的腫瘤組織靶向能力，主要是基于其與細胞表面受體（包括gp18、gp30、gp60、FcRn）之間的相互作用［41］。BSA 在結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上與HSA 有相似性，也可作為納米酶的天然蛋白骨架。Huang 等［42］利用HSA 修飾四氧化三錳（Mn3O4）納米顆粒，發(fā)展了一種新型復(fù)合抗氧化納米材料來抑制缺血性中風(fēng)再灌注引起的神經(jīng)系統(tǒng)損傷。其中，HSA 的修飾使得該納米酶復(fù)合材料表現(xiàn)出很好的生物相容性和較低的器官毒性等特征，能夠治療小鼠缺血性腦卒中再灌注引起的腦損傷。Han 等［43］以BSA 為模板實現(xiàn)了二氧化錳納米片的可控合成，通過改變BSA 的濃度能夠影響納米酶材料的類酶活性。此外，該納米材料還具有串聯(lián)酶催化的特性，從而利用此特性提出了一鍋法、無酶葡萄糖比色傳感新策略，該方法靈敏度高、檢測限低、檢測時間短，解決了傳統(tǒng)血糖檢測方法中生物酶、多催化劑、分步反應(yīng)、非原位反應(yīng)帶來的問題。

圖2 HSA的晶體結(jié)構(gòu)［40］Fig.2 Crystal structure of HSA［40］

絲蛋白（silk fibroin，SF）也是一種廣泛應(yīng)用于納米遞送系統(tǒng)的天然蛋白。絲素蛋白纖維核心由1 個重鏈（約350 kDa）和1 個輕鏈（約25 kDa）組成，通過二硫鍵和糖蛋白連接在一起。重鏈絲蛋白的一級結(jié)構(gòu)中具有（Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala）n的氨基酸重復(fù)序列［44］。絲蛋白具有優(yōu)異的生物相容性、可控的生物降解性和低免疫原性，還能通過與其他聚合物混合來調(diào)節(jié)其性能，可顯著改善納米酶的生物利用度。Yang 等［45］在絲蛋白存在的條件下，利用氯金酸和氯鉑酸的生物結(jié)晶（bioinspired crystallization）構(gòu)建了Au、Pt 雙金屬納米酶，并在體外4T1腫瘤細胞和體內(nèi)異種移植腫瘤模型上證明了所合成的AuPt@SF（APS）納米酶的抗腫瘤作用，這些納米催化劑對腫瘤微環(huán)境特別敏感，可實現(xiàn)有效的腫瘤治療和診斷。

天然酶自身也可以作為一種納米酶合成蛋白骨架，從而可以產(chǎn)生更為豐富的催化能力［46］。Zeng等［47］將金納米顆粒（Au）與辣根過氧化物酶（HRP）相結(jié)合，組裝成納米催化共軛物（HRPAu）進行葡萄糖檢測，HRP/Au的適當(dāng)混合可以顯著提高級聯(lián)反應(yīng)的催化活性。Losada-Garcia 等［48］使用幾種酶分子為蛋白骨架合成了銅納米顆粒雜化的銅納米酶，雜化后的納米酶具有不同于酶支架的酶活性，并且銅納米顆粒和支架酶之間的協(xié)同作用還可以提高雜化銅納米酶的氧化還原酶活性。Li 等［49］將脂肪酶-聚合物共軛物與Pd 納米簇雜化構(gòu)建了脂肪酶-Pd 納米簇雜化催化劑，在催化S-1-苯乙胺外消旋中表現(xiàn)出了較商用Pd/C催化劑高50倍以上的活性，并且還可以回收重復(fù)使用。

3 基因改造蛋白骨架

天然蛋白骨架在合成納米酶上最大的問題是可塑造性差，以基因重組、改造為基礎(chǔ)的可設(shè)計蛋白骨架，其最大的特點是可“按需定制”，能夠賦予蛋白骨架更多的功能，如靶向疾病等。在納米研究領(lǐng)域，可設(shè)計蛋白骨架最具代表性的是蛋白納米籠。與傳統(tǒng)納米材料相比，蛋白納米籠因其高比表面積、內(nèi)/外表面可設(shè)計性、多功能性和特殊的內(nèi)在特性，在包括藥物輸送在內(nèi)的多個領(lǐng)域中具有良好的應(yīng)用前景［50-52］。以這種蛋白納米籠為蛋白骨架，仿生合成納米顆粒為進一步開發(fā)納米酶材料提供了基礎(chǔ)。

自然界中存在很多種天然自組裝的蛋白納米籠結(jié)構(gòu)，如鐵蛋白、小熱休克蛋白（sHSP）［53］、封裝蛋白［54］和lumazine合酶［55］等；此外，病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）也是一種自組裝納米顆粒，包括豇豆褪綠斑駁病毒（CCMV）、噬菌體P22 等［52］（圖3）。一些籠狀蛋白本身就是一種酶，肺炎鏈球菌的氨基肽酶是一種鋅依賴的金屬肽酶，由12 個亞基自組裝成四面體，在其中合成Pt 金屬納米顆粒，能夠?qū)K催化加氫和肽酶水解多步催化反應(yīng)結(jié)合在一起［56］。

圖3 各種基于籠狀蛋白的結(jié)構(gòu)示意圖及其透射電鏡圖［52］（比例尺=50 nm。上圖顯示了基于天然結(jié)構(gòu)的納米籠，下圖展示了基于病毒樣顆粒的納米籠）Fig.3 Schematic diagrams and TEM images of structures of various protein-based nanocages[52](Scale bar:50 nm.Upper images show natural structure-based nanocages,and lower images show virus-like particles.)

天然籠狀蛋白也可以通過基因重組、改造得到，使其“按需”獲得一定的功能。此外，它們也可作為蛋白骨架，仿生合成各種金屬納米材料。天然鐵蛋白（ferritin）由重鏈和輕鏈亞基組成，基因重組重鏈鐵蛋白是由24 個亞基自組裝成的中空籠狀結(jié)構(gòu)（ferritin nanocage，F(xiàn)Tn），外徑和內(nèi)徑分別為12 nm 和8 nm。FTn 能夠結(jié)合腫瘤高表達的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（TfR1）［57-58］，具有腫瘤靶向的特性及穿越血腦屏障的能力［59］，已在腫瘤靶向治療［60-61］及成像［62-63］等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用。FTn 可以方便地通過遺傳或者化學(xué)的手段在內(nèi)腔、外表面及亞基界面修飾改性來獲得新的功能，如在表面引入RGD 基序［64］及表皮生長因子（EGF）［65］等來改善靶向或治療能力。重要的是，F(xiàn)Tn自身具有生物礦化特性，可以作為蛋白骨架在其內(nèi)腔原位合成金屬納米顆粒，包括Fe、Pt、Pd、Cu、Co、Au、Ag 等［66-67］。進一步通過基因工程改造內(nèi)腔，可提高合成金屬納米顆粒的合成效率，如在內(nèi)腔引入半胱氨酸和組氨酸，可以通過巰基/咪唑和一些金屬螯合，增加鐵蛋白內(nèi)部的金屬裝載量［68］。除了鐵蛋白外，一些其他基因改造的籠狀蛋白也被用于合成納米顆粒。將青蛙M-鐵蛋白模擬肽（QEHEDE） 或帶負電荷的富含谷氨酸肽（EEEEEE）通過基因改造嵌入到內(nèi)腔，可以使工程E2 蛋白獲得鐵礦化的能力［69］。豇豆褪綠斑駁病毒（CCMV）由于具有較大且?guī)д姷膬?nèi)腔，可被用于合成金屬納米顆粒，通過基因改造可以實現(xiàn)病毒衣殼內(nèi)部的電荷轉(zhuǎn)換，將其N 端帶正電的氨基酸替換為帶負電荷的谷氨酸仍能保持其籠狀結(jié)構(gòu)，可以介導(dǎo)Fe（Ⅱ）在內(nèi)腔的結(jié)合及24 nm 的γ-FeOOH 納米粒子在CCMV 內(nèi)腔中的合成［70］。Giessen 等［71］改造了T.maritima衣殼蛋白，在天然EncTm 操縱子中刪除了Flp，并在N 端遺傳融合了DNA 編碼的銀沉淀肽AG4（NPSSLFRYLPSD），構(gòu)了工程衣殼蛋白EncTmAG4，使其具有了內(nèi)部形成銀納米顆粒能力。

天然蛋白經(jīng)過億萬年進化，已形成了穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，因此，一定程度上基因改造的天然蛋白質(zhì)還是能夠維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。與之相比，人為創(chuàng)造非自然界存在的蛋白骨架更具挑戰(zhàn)，即利用算法語言進行計算編程、建模和模擬，從而從頭設(shè)計蛋白質(zhì)納米籠。華盛頓大學(xué)Baker 實驗室［72］使用Rosetta 套件高通量篩選的方式，將所有可能的界面趨近于自然進化的結(jié)構(gòu)。之后通過軟件對接最佳亞基和尋找互補性優(yōu)化產(chǎn)物，在一項工作中設(shè)計出了5 個籠狀結(jié)構(gòu)，每個結(jié)構(gòu)由24 個亞基組成［73］。除此之外，他們還進一步設(shè)計了蛋白納米籠的外表面，通過螺旋間隔結(jié)構(gòu)域?qū)⒖贵w的恒定結(jié)構(gòu)域與納米籠的外表面結(jié)合，這種方法可將抗體精準(zhǔn)地結(jié)合到具有幾何形狀的納米籠中［74］。Gao 等［75］從頭設(shè)計構(gòu)建了一種氧氣通透性可調(diào)控的人工蛋白納米籠，策略是基于高分辨結(jié)構(gòu)信息，利用親和性的分子補丁封閉蛋白納米籠外殼的通道，進而可逆地控制蛋白籠的氧通透性。這種從頭設(shè)計策略對將來的納米酶理性設(shè)計十分具有借鑒意義，或許可以成為納米酶催化底物選擇特異性及活性控制等策略之一。

一般來說，籠狀蛋白可以在外腔、內(nèi)腔和亞基界面基因工程化改造［76］，如改造外表面使其具有靶向作用或改善其生物相互作用［77］；改造內(nèi)腔可以高效地裝載或合成金屬納米顆粒［68，78］；改造亞基界面會使籠通道打開或誘導(dǎo)拆卸/重新組裝［79-80］。這種以基因改造為基礎(chǔ)的可設(shè)計蛋白納米籠，在合成酶學(xué)的研究中可作為一個人工酶展示平臺，用于展示具有精確空間關(guān)系的酶或構(gòu)建多酶級聯(lián)納米反應(yīng)器系統(tǒng)［81］。這些結(jié)構(gòu)可以有效地模仿自然界中的酶絡(luò)合物，通過酶的級聯(lián)反應(yīng)來提高催化的效率［82］?？稍O(shè)計蛋白納米籠在納米酶的研究中也可作為合成模板或生物反應(yīng)器，以構(gòu)建多樣化和功能化的納米酶［83］。因此，這樣的特點可以將蛋白骨架的可設(shè)計優(yōu)勢與納米酶催化特性巧妙地融合在一起，賦予納米酶設(shè)計更多的可能性。

4 合成生物納米酶

合成生物納米酶是在上述基因改造蛋白骨架的基礎(chǔ)上，利用和借鑒合成生物學(xué)技術(shù)手段和思路，開辟納米酶研究領(lǐng)域的新分支。從設(shè)計上講，區(qū)別于通常意義的納米酶，合成生物納米酶在結(jié)構(gòu)上著重以基因重組、改造為基礎(chǔ)的蛋白為骨架，再加以具有類酶催化活性金屬納米顆粒的合成，可以視其為生物材料和無機金屬材料組成的雜化分子。合成生物納米酶優(yōu)于其他納米酶的方面在于，研究人員可以將種種功能和結(jié)構(gòu)部分作為一個模塊/基塊進行自下而上地組裝和構(gòu)建，這種構(gòu)建方式以基因工程重組為前提，能夠更為理性和標(biāo)準(zhǔn)化地控制。從催化機理上來講，合成生物納米酶的組成更類似于天然酶的組成特點，例如金屬蛋白酶，因此也更容易模擬天然酶的設(shè)計，更容易探究其催化機理。從功能和應(yīng)用上來講，既可以利用蛋白骨架本身的功能，如靶向疾病等，也可以利用納米顆粒的催化功能，兩者合二為一。

基于以上特點，這種合成生物納米酶目前研究最多的是鐵蛋白納米酶，我們和其他研究者在這方面做了許多的工作?；蛑亟M重鏈鐵蛋白（FTn）已被證明是一種優(yōu)良的納米遞送平臺［84］，它可以穿越多種生物屏障［59］，具有腫瘤靶向且可以趨向于低氧的腫瘤組織［85-86］。通過在鐵蛋白內(nèi)部仿生合成金屬納米酶，可以進行多種酶活性的模擬［83］。利用此種策略合成的人工納米酶具有優(yōu)良的單分散性、均勻的尺度及良好的生物相容性等優(yōu)點。我們利用這種鐵蛋白作為蛋白骨架原位合成制備一系列功能各異的納米酶，如合成模塊化組裝鐵蛋白Pt 納米酶具有腫瘤靶向殺傷能力［87］；靶向改造的鐵蛋白Mn 納米酶具有SOD-CAT 級聯(lián)催化活性［88］；鐵蛋白Pd納米酶模擬細胞色素P450可實現(xiàn)生物正交催化［89］；鐵蛋白Fe 納米酶的過氧化物酶活性模擬胞內(nèi)氧化應(yīng)激［90］等。

氧化還原酶類的納米酶可以進行ROS 調(diào)控，進而進行細胞內(nèi)重要功能的調(diào)控［91-93］。在FTn內(nèi)部合成的Mn 納米酶具有類過氧化氫酶樣活性。這種仿生人工酶可以有效穿透腫瘤組織缺氧區(qū)域發(fā)揮過氧化氫酶活性以提供氧氣，這可以顯著緩解腫瘤的缺氧。這種氧氣的產(chǎn)生可以緩和光動力療法對氧氣的需求大、腫瘤部位氧氣不足的問題，增強光動力療法的療效［94］。通過對鐵蛋白外殼進行改造之后在其內(nèi)部合成納米酶，制備了靶向線粒體的鐵蛋白納米酶（mito-fenozyme），這種人工級聯(lián)納米酶具有類超氧化物歧化酶和過氧化氫酶樣活性，可以克服多種生物屏障靶向線粒體。在心臟缺血再灌注損傷過程中，線粒體呼吸鏈中超氧陰離子的產(chǎn)生是造成再灌注損傷的重要因素［95］，mito-fenozyme 在線粒體部位發(fā)揮超氧化物歧化酶的活性，清除過量產(chǎn)生的超氧化物自由基，保護因缺血造成的組織損傷［88］（圖4）。

圖4 雜化鐵蛋白納米酶（mito-fenozyme）保護線粒體功能［88］（a）mito-fenozyme制備示意圖；（b）FTn的負染色TEM圖；（c）MnO2 fenozyme TEM圖；（d） mito-fenozyme TEM圖（比例尺=20 nm）；（e）在mito-fenozyme作用下細胞內(nèi)自由基向非細胞毒性分子轉(zhuǎn)化的示意圖；（f）mito-fenozyme影響線粒體氧化損傷的共聚焦圖像（上）和量化分析（下）；（g） mito-fenozyme處理的細胞內(nèi)氧化損傷自由基水平下降（比例尺=10 μm）Fig.4 Hybrid ferritin nanozyme(Mito-Fenozyme)protects mitochondrial functions［88］(a)Schematic diagram for the preparation of Mito-Fenozyme.TEM images of the FTn protein shell(negative staining with 1%uranyl acetate)(b),MnO2 nanoparticles inside the FTn shell(c),and Mito-Fenozyme(d).Scale bar:20 nm.(e)Schematic diagram for the intracellular conversion of free radicals to non-cytotoxic molecules under the catalysis of Mito-Fenozyme.(f)Confocal images(top)and quantitative analysis(bottom)for the effect of Mito-Fenozyme on mitochondrial oxidative damage.(g)Mito-Fenozyme reduced intracellular free radical levels in oxidatively damaged cells.Scale bar:10 μm

鐵蛋白納米酶因其出色的酶活性及可編程的特異性，在體外檢測中也有出色的表現(xiàn)。最為經(jīng)典的例子是鐵蛋白四氧化三鐵納米酶，其具有過氧化物酶活性和TfR1 結(jié)合能力，能夠靶向腫瘤高表達的TfR1 發(fā)揮活性，作者檢查了來自9 種癌癥患者的474個臨床樣本，驗證了此納米酶可以區(qū)分癌細胞和正常細胞，靈敏度為98%，特異性為95%［96］。Jiang 等［97］報道了通過將肝靶向肽SP94遺傳融合到鐵蛋白表面的方式，制備了遺傳改造的肝細胞癌特異性靶向鐵蛋白（HccFn），并在其內(nèi)部仿生合成了鈷納米酶——HccFn（Co3O4）。這種遺傳改造的人工納米酶具有過氧化物酶樣活性催化底物二偶氮氨基苯（DAB）的氧化，在H2O2的存在下發(fā)生顏色反應(yīng)。作者檢查了424份臨床肝細胞癌標(biāo)本，證實HccFn（Co3O4）納米酶區(qū)分肝癌組織與正常肝組織的敏感性為63.5%，特異性為79.1%，與臨床使用的HCC 特異性標(biāo)志物α 胎蛋白相當(dāng)。

合成生物學(xué)模塊化思路也可以應(yīng)用于納米酶的設(shè)計和構(gòu)筑。通過對鐵蛋白外殼組裝后再組裝的策略，制備了具有精確超分子結(jié)構(gòu)的寡聚納米酶［87］（圖5）。這種“自下而上”方式構(gòu)建的寡聚納米酶具有精確的結(jié)合價，有助于增加靶向、延長血液循環(huán)時間及腫瘤組織的穿透能力。寡聚鐵蛋白鉑納米酶具有強的過氧化物酶活性，在溶酶體中產(chǎn)生高毒性的羥基自由基，最終導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。細胞色素P450 是一種末端加氧酶，參與了體內(nèi)重要的生物學(xué)過程［98］。肝臟中的細胞色素P450 是藥物代謝的關(guān)鍵酶，可以將一些疏水藥物轉(zhuǎn)化為親水以便于排除體外。最近研究發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白鈀納米酶（FTn-Pd）具有模擬P450BM3活性［89］，可以特異性地切割丙基醚基團，并且可以在溶酶體中催化生物正交反應(yīng)。在溶酶體內(nèi)的酸性環(huán)境下，F(xiàn)Tn-Pd 納米酶還會發(fā)揮其過氧化物酶活性，進一步介導(dǎo)溶酶體膜的滲漏。FTn-Pd 納米酶的多酶協(xié)同特性允許我們在溶酶體生物正交釋藥并克服溶酶體屏障增強藥效。

圖5 模塊化組裝思路構(gòu)筑寡聚納米酶［87］（a）鐵蛋白胞內(nèi)重組胞外再重組構(gòu)筑寡聚組裝體示意圖；（b）構(gòu)筑的幾種組裝體的示意圖（上）和TEM照片（下）。比例尺=20 nmFig.5 Assembly of chain-like nanostructures［87］(a)Schematic illustration for the preparation of FTn-Ner via a two-step self-assembly/post-assembly approach.The uniform FTn as motifs were obtained by the self-assembly of 24 FTn subunits expressed in E.coli.Subsequently,purified FTn motifs were further assembled to form different FTn-Ner by using two-armed PEG.(b)Representative TEM images of various assembled nanostructures.Scale bar:20 nm

使用合成生物學(xué)自下而上的策略，僅使用其最小功能單元重構(gòu)細胞生物學(xué)過程對于在分子和機械水平上研究細胞內(nèi)生化機制非常有幫助。通過在簡化的實驗系統(tǒng)中組合可控數(shù)量的組件，可以詳細了解對一些生命至關(guān)重要的生物過程和分子機器。合成生物納米酶具有模塊化可設(shè)計且生物相容性好等優(yōu)勢，這允許我們設(shè)計、控制、模擬和標(biāo)準(zhǔn)化生物過程。ROS 導(dǎo)致的DNA 損傷及脂質(zhì)過氧化是重要的生物學(xué)過程［99］。Hu 等［90］設(shè)計了人工細胞系統(tǒng)，用鐵蛋白納米酶（fenozym）及人工合成脂質(zhì)膜系統(tǒng)模擬細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過納米酶誘導(dǎo)確定的催化反應(yīng)，在巨型單層囊泡（GUV）體系中重建了細胞中重要的氧化應(yīng)激化學(xué)事件，包括DNA 損傷和脂質(zhì)過氧化。此外，GUV系統(tǒng)還可以響應(yīng)腫瘤微環(huán)境中高表達的H2O2，主動誘導(dǎo)腫瘤細胞DNA 雙鏈斷裂和脂質(zhì)損傷。這個概念性的研究，為定義生物系統(tǒng)中的催化提供了一個有前途的選擇，并為以全合成的方式從頭創(chuàng)建人工細胞提供了新的見解。

5 展望

綜上所述，納米酶是一個學(xué)科交叉研究的產(chǎn)物，作為一個“載體”或“平臺”，能夠?qū)⒍喾N不同的領(lǐng)域融合在一起，展現(xiàn)出強大的生命力。作為一種新型的人工酶，納米酶能夠把傳統(tǒng)的酶類從“單分子”延伸至“顆?！?，極大擴充了合成生物學(xué)的工具包。納米酶領(lǐng)域經(jīng)過10 多年的發(fā)展，目前已開發(fā)出成百上千種不同的納米酶材料，能夠模擬多種不同的酶活性，尤其是氧化還原酶類和水解酶類?；谶@些酶的模擬，近年來，納米酶在體外檢測、體內(nèi)疾病調(diào)控等方面正在發(fā)揮越來越大的作用，甚至在人造細胞的全合成方面也展現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。然而，目前納米酶領(lǐng)域仍然有很多問題亟待解決，如催化機制理論體系的建立、對底物選擇性、類酶活性、標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立等。為應(yīng)對以上問題，借鑒天然酶的基本結(jié)構(gòu)，即蛋白骨架和活性中心，理性設(shè)計所需納米酶，使其結(jié)構(gòu)更為簡單、組分更為明確，將對解決目前納米酶存在的基本問題提供很好的思路。

由于一些天然來源的蛋白容易獲取，像HSA和BSA 等，已被用來合成一些納米酶材料，但這類材料僅僅利用了蛋白作為模板來合成材料，在材料的可控性、功能性和賦能性上大大受限。事實上，利用合成生物學(xué)理念和技術(shù)，通過基因工程改造或從頭設(shè)計，一些非天然蛋白骨架已被越來越多地開發(fā)出來，這些蛋白骨架利用計算生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、遺傳工程、化學(xué)手段等將分子功能元件融為一體，使得獲得的蛋白骨架具有多種優(yōu)勢，如尺寸精準(zhǔn)可控、模塊化組裝、功能分子精準(zhǔn)設(shè)計、性能按需設(shè)計等，這為進一步構(gòu)建合成生物納米酶提供了基礎(chǔ)。某些氨基酸/蛋白結(jié)構(gòu)域能夠親和/捕捉金屬離子，從而為納米酶材料的原位生長或礦化提供了結(jié)合位點，事實上，通過前期的基因改造或蛋白結(jié)構(gòu)設(shè)計，也能夠?qū)Y(jié)合位點或親和金屬類型進行按需定制，因此，相較于其他納米酶，合成生物納米酶允許我們集合人工篩選的或自然界中已有的功能模塊進行重新整合，還可以將現(xiàn)有的計算生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)、蛋白/基因工程手段及化學(xué)手段等融為一體（圖6），進行更為精巧設(shè)計和活性定制，這是優(yōu)于傳統(tǒng)納米酶的一大特點。另外，以金屬蛋白酶為例，經(jīng)過億萬年的進化，酶的結(jié)構(gòu)和表現(xiàn)的催化特性在某種意義上是一種極致的存在形式，蛋白的柔性和金屬催化活性中心的完美協(xié)同作用，使其成為控制生命體代謝過程中不可分割的一部分。合成生物納米酶以蛋白骨架原位合成納米酶材料，其存在的必要性和優(yōu)勢也需要進一步挖掘和拓展，這也為傳統(tǒng)酶學(xué)研究領(lǐng)域、合成生物學(xué)領(lǐng)域及其他新興交叉領(lǐng)域展示了無限的可能性和新的思考。

圖6 合成生物納米酶可能的方向Fig.6 Prospects for synthetic biological nanozymes