翟婷婷，顧宏周，樊春海

（上海交通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，上海 200240）

酶是一類具有高度特異性和高催化效率的生物催化劑，在化工生產(chǎn)、藥物制備和食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用［1］。然而，酶的催化反應(yīng)主要發(fā)生在一定條件下的水相環(huán)境中，溫度和pH 值的變化以及有機(jī)介質(zhì)的存在等往往會(huì)導(dǎo)致酶催化活性降低，限制其在工業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用［2］。例如，藥物生產(chǎn)中疏水性底物參與的化學(xué)反應(yīng)通常需要添加有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，而該操作會(huì)顯著降低酶的催化效率。因此，提高酶在有機(jī)溶劑中的催化活性和穩(wěn)定性具有重要的研究?jī)r(jià)值。

酶固定化技術(shù)是采用固體材料將酶束縛或限制在一定區(qū)域內(nèi)，從而維持有機(jī)相中酶活性和穩(wěn)定性的有效手段［3］。與游離酶相比，固定化酶結(jié)構(gòu)剛性提升，可維持更為穩(wěn)定的三維活性構(gòu)象。與此同時(shí)，固相載體也能為酶提供特定物理化學(xué)性質(zhì)的微反應(yīng)環(huán)境。因而，固定方法以及所用載體是決定固定化酶催化性質(zhì)的關(guān)鍵因素。隨著固定化酶技術(shù)的飛速發(fā)展，吸附法、交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法和包埋法等被廣泛用于游離酶的固定。但是在這些方法中，酶通常是被隨機(jī)固定在載體表面，存在取向性差的缺陷，導(dǎo)致酶活性的降低［4］。自組裝蛋白納米結(jié)構(gòu)是一種新興的酶固定化支撐材料。通過蛋白質(zhì)工程和自組裝技術(shù)，游離酶可以被定向附著在蛋白納米結(jié)構(gòu)的表面［5-6］。蛋白質(zhì)載體不僅保留了傳統(tǒng)載體的優(yōu)點(diǎn)，而且還能進(jìn)一步保護(hù)酶的活性；此外，蛋白質(zhì)載體的表面性質(zhì)可通過氨基酸殘基精確調(diào)控實(shí)現(xiàn)靈活的設(shè)計(jì)。因此，以自組裝蛋白為載體的酶固定化策略為構(gòu)建界面性質(zhì)及空間取向可控的高活性固定化酶提供了可能性。

近期，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所/生物安全大科學(xué)研究中心的門冬課題組與中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所張先恩課題組合作在ACS Catalysis上發(fā)表的研究性文章“Self-Assembled Enzymatic Nanowires with a ‘Dry and Wet’ Interface Improvethe Catalytic Performance of Januvia Transaminase in Organic Solvents”報(bào)道了一項(xiàng)以自組裝蛋白質(zhì)為載體，構(gòu)建有機(jī)相下高催化活性固定酶的研究工作［7］。作者制備了一種具有親水-疏水復(fù)合界面性質(zhì)的自組裝酶納米線，可用于有效提高酶在有機(jī)相中的催化性能（圖1）。Zhang等指出，與其他酶固定化的手段相比，利用具有自組裝特性的蛋白為載體的酶固定化手段不僅可以實(shí)現(xiàn)酶的精準(zhǔn)定向固定，還可基于蛋白質(zhì)表面性質(zhì)易修飾的特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)固定化酶界面生物化學(xué)性質(zhì)的精確調(diào)制，大幅提高了固定化酶的環(huán)境適宜性。相關(guān)研究成果將為提高有機(jī)介質(zhì)中酶分子催化活性和穩(wěn)定性提供重要參考價(jià)值。

圖1 Januvia轉(zhuǎn)氨酶納米線的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)及有機(jī)相高效底物催化示意圖Fig.1 Design of Januvia transaminase nanowires for biocatalysis in organic solvents

在該項(xiàng)工作中，作者選用釀酒酵母蛋白Sup35作為酶固定化載體。Sup35 是一種淀粉樣蛋白，其朊蛋白結(jié)構(gòu)域在體外能自組裝形成淀粉樣蛋白纖維。Sup35 可以通過與蛋白配體的基因融合來構(gòu)建功能化的納米載體，隨后基于蛋白質(zhì)自組裝機(jī)制形成具有交替性親疏水界面的納米線，為負(fù)載酶提供一種兩親性的微環(huán)境［8］。在示例性實(shí)驗(yàn)中，作者將合成西他列汀（糖尿病治療藥物）的關(guān)鍵酶Januvia轉(zhuǎn)氨酶（JTA）與Sup35 自組裝結(jié)構(gòu)域（前61 個(gè)氨基酸）相融合，構(gòu)建融合蛋白Sup35-JTA；然后利用Sup35 的自組裝特性，進(jìn)一步構(gòu)建JTA 納米線。研究證明，蛋白質(zhì)的融合及自組裝過程并不會(huì)影響底物與酶之間的親和作用，與游離的JTA 相比［（7.088±0.351）×10?3s?1］，JTA 納米線的酶催化活性［（33.610 ± 2.406）×10?3s?1］提高了3.7 倍以上，90%轉(zhuǎn)化率所需時(shí)間由游離JTA的24 h縮短到4.5 h以下。

文章進(jìn)一步對(duì)JTA納米線在有機(jī)相中催化活性提高的機(jī)理進(jìn)行了闡述。作者指出， JTA 納米線顯現(xiàn)出一定程度的丁達(dá)爾現(xiàn)象，能夠很好地溶解在緩沖液中，是一種介于溶液和膠體狀態(tài)的納米材料。與游離的JTA 相比，JTA 納米線中酶與Sup納米線相互作用形成了兩親性復(fù)合界面，可以明顯提升固定酶的疏水性質(zhì)?；诖?，JTA 納米線呈現(xiàn)出與疏水性的Sup納米線相似的結(jié)合疏水分子的能力。另一方面，測(cè)試結(jié)果顯示與游離JTA 相比，JTA納米線的表觀米氏常數(shù)（Km）并沒有發(fā)生明顯的變化。因此，作者推斷JTA納米線催化活性的提升源自于JTA 納米線結(jié)構(gòu)的親水-疏水雜合性質(zhì)，這一特性改善了酶和底物間的相互作用，具體可能包括以下兩方面：首先，JTA 本身是一種親水性蛋白質(zhì)，其催化活性高度依賴于自身三維活性構(gòu)象的穩(wěn)定性，而結(jié)合水分子是保持酶活性構(gòu)象的必要條件之一。酶分子通過與水分子間的非共價(jià)作用（氫鍵相互作用、范德華相互作用等），使酶的最低自由能達(dá)到一個(gè)極小值，進(jìn)而維持酶的穩(wěn)定狀態(tài)。一旦維持酶分子活性結(jié)構(gòu)的水分子被去除，酶分子與水分子間的相互作用消失，酶活性構(gòu)象則易發(fā)生改變，從而發(fā)生酶失活［9］。由Sup35和JTA組成的納米線表面富含極性氨基酸，可以很好地結(jié)合水分子， 為JTA 納米線提供較好的親水微環(huán)境，從而提高固定在蛋白質(zhì)納米線表面酶的穩(wěn)定性，親水性微環(huán)境還可以進(jìn)一步提高固定化JTA 的溶解性。其次，催化效率（Kcat/Km）數(shù)據(jù)顯示，由Sup35納米線形成的疏水微環(huán)境可以誘導(dǎo)疏水性底物普羅西格列汀酮向JTA 納米線表面擴(kuò)散，在提高底物局域濃度的同時(shí)也能增強(qiáng)底物與酶的接觸能力，進(jìn)而最大限度地提高反應(yīng)速率和催化效率。作者在文章中還指出，與游離酶相比，JTA納米線酶不僅具有更高的酶活性，而且還具有更好的熱穩(wěn)定性、pH 穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑適應(yīng)性，表現(xiàn)出更優(yōu)異的綜合催化性能。

自組裝蛋白納米結(jié)構(gòu)作為一種新興的酶固定化支撐基質(zhì)，具有廣闊的應(yīng)用前景。由于通過基因操縱和融合蛋白的自組裝可以實(shí)現(xiàn)對(duì)載體表面酶的固定位點(diǎn)的精確操控，因而相比于常見的化學(xué)修飾固定法，蛋白質(zhì)自組裝策略能夠更大程度地保持酶的本征催化能力；同時(shí)，與基于有機(jī)/無機(jī)支撐基質(zhì)的納米酶相比，蛋白質(zhì)載體界面的物理化學(xué)性質(zhì)具有更強(qiáng)的可設(shè)計(jì)性，可通過靈活改變蛋白質(zhì)載體的結(jié)構(gòu)和微環(huán)境，增強(qiáng)固定酶的催化活力和應(yīng)用普適性；此外，自組裝酶促納米結(jié)構(gòu)的特定界面可通過成熟的蛋白質(zhì)工程來實(shí)現(xiàn)，具備工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的潛力。總而言之，以自組裝蛋白質(zhì)為載體的酶固定化策略可為多類型工業(yè)生產(chǎn)催化劑的開發(fā)提供有利的新思路。