施茜，吳園園，楊洋

（上海交通大學醫(yī)學院附屬仁濟醫(yī)院，分子醫(yī)學研究院，上海 200127）

1 從經(jīng)典生物學到合成生物學

生命經(jīng)過億萬年的自然選擇，已經(jīng)進化成為高度復雜、高度動態(tài)、高度集成的體系，對于生命奧秘的認識與研究是人類在科學道路上最近發(fā)生的事情，雖然成果斐然，但仍任重道遠。人類在與自然界的接觸中，歷經(jīng)了從認識、理解，到改造甚至創(chuàng)造世界的過程。經(jīng)典生物學作為人們認識與理解世界的階段，往往從現(xiàn)象和表型出發(fā)，探求生命是什么與為什么：自林奈至達爾文，物種間靜態(tài)的相似性和動態(tài)的進化聯(lián)系得以描述和闡釋；自孟德爾至摩爾根，生物體性狀背后的基因本質(zhì)得以揭示，而其物質(zhì)基礎(chǔ)也呼之欲出；沃森和克里克通過對DNA 結(jié)構(gòu)的正確認識，為基因找到了分子載體，使得生命科學的大廈終于可以與物理和化學科學的大廈連通。分子生物學的時代接踵而至，無論是從基于生物催化劑“酶”的生化反應(yīng)出發(fā)還是從經(jīng)典有機化學的反應(yīng)機制出發(fā)，人類對于DNA的合成、復制、剪切和連接等操作都漸漸駕輕就熟直至爐火純青。而相應(yīng)地，在人類進行世界改造與創(chuàng)造的追求驅(qū)使下，以設(shè)計與構(gòu)造為出發(fā)點的新的生物學研究模式也進入了快車道。

隨著經(jīng)典生物學對自然界認知的不斷深入，合成生物學（synthetic biology）的概念應(yīng)運而生（圖1）?！昂铣缮飳W”的名詞首次出現(xiàn)于1910 年Stéphane Leduc 的著作中，在接下來的100 年里逐步萌芽并不斷發(fā)展：從20 世紀60 年代Jacob 和Monod 乳糖操縱子的經(jīng)典研究，對利用分子組分組裝新系統(tǒng)的大膽設(shè)想［1］，到21 世紀初Nature雜志報道的通過結(jié)合大腸桿菌的基因合成的兩種基因線路［2-3］，再到最近劍橋生物學家們設(shè)計合成的命名為“Syn61”的首個人造大腸桿菌［4］，合成生物學已經(jīng)將人類帶入了改造世界和創(chuàng)造世界的新征程。合成生物學是利用工程學思想，由生物學、物理學、化學和計算機科學等多學科進行交叉，以重編改造天然體系或設(shè)計合成新的生物體系為目標的新興學科，主要通過基因拼接或分子組裝，構(gòu)建生物學配件和體系以模擬甚至在某些場景下替代自然生命體系。合成生物學被認為是面向未來的學科，從資本市場表現(xiàn)來看，合成生物行業(yè)正在走向爆發(fā)期，根據(jù)2020 年CB Insights 公司分析數(shù)據(jù)顯示，2019 年全球合成生物學市場規(guī)模達53 億美元。預計到2024 年，與2019 年相比，合成生物學市場規(guī)模的年復合增長率將增長28.8%，達到189億美元［5］。合成生物學的迅速崛起將人類對于生命的認知、改造和創(chuàng)造能力提升到了一個全新的層次，也為解決一些全球性重大問題提供了重要途徑，并且將在生命健康、食品、環(huán)境、能源等諸多方面有廣泛應(yīng)用。

圖1 經(jīng)典生物學與合成生物學研究相應(yīng)關(guān)系與側(cè)重點概念圖Fig.1 Schematic diagrams showing the relationship and key concepts of classical biology and synthetic biology

2 DNA 納米技術(shù)：合成生物學的重要支持技術(shù)

合成生物學的支持技術(shù)主要包括人工染色體合成技術(shù)、人工蛋白組件設(shè)計合成技術(shù)、基因合成、編輯與測序技術(shù)、微流控技術(shù)、計算機建模與分子模擬技術(shù)等，它們幫助構(gòu)建標準化的生物元件，并在合成系統(tǒng)中逐級利用這些生物元件［6］。本文著重介紹的DNA 納米技術(shù)是一種人為設(shè)計并“自下而上”構(gòu)建核酸納米結(jié)構(gòu)的技術(shù)，這里的DNA 分子被用作結(jié)構(gòu)材料，而非遺傳信息載體。由于在納米級別的精確可控性，使得利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建“標準化”“模塊化”的工具，以至未來利用這些工具構(gòu)建工程化平臺成為可能。DNA納米技術(shù)在多個場景下服務(wù)于合成生物學，例如進行生物大分子的有序裝配，構(gòu)建細胞元件、生物裝置和生化系統(tǒng)模擬甚至替代自然生命體系，構(gòu)建核酸納米藥物和腫瘤疫苗，從而推動合成生物學底層技術(shù)的進步，很大程度上激發(fā)了其市場的增長勢能，將人類對生命的認識和改造能力提升到一個全新的層次。由此可見，DNA 納米技術(shù)已經(jīng)成為合成生物學中不可或缺的重要盟友。

DNA 納米技術(shù)自1982 年Nadrian Seeman［7］創(chuàng)立至今，已經(jīng)經(jīng)歷了40 年的蓬勃發(fā)展，并且在生物、醫(yī)學、材料、化學等領(lǐng)域具有極其廣泛的應(yīng)用［8］。2006 年DNA 折紙術(shù)［9］的出現(xiàn)降低了DNA納米結(jié)構(gòu)的設(shè)計難度，提升了其可編程性，從而大大拓展了DNA 納米技術(shù)的應(yīng)用場景［10］。DNA折紙術(shù)的基本原理是基于堿基互補配對原則，使用上百條稱作訂書釘鏈（staple strand）的短鏈DNA 將一條稱作腳手架鏈（scaffold strand）的長鏈DNA折疊為預先設(shè)計的形狀，如正方形、矩形、三角形、星星和笑臉等形狀［9］［圖2（a）］。在隨后十余年的發(fā)展中，DNA 折紙術(shù)在結(jié)構(gòu)維度、結(jié)構(gòu)曲率、拓撲編織、動態(tài)控制以及模塊化超組裝方面［11-15］［圖2（b）、（c）］不斷取得突破，實現(xiàn)了更精細、更巨大、更復雜結(jié)構(gòu)的組裝。

圖2 DNA折紙術(shù)基本原理及其發(fā)展（標尺：50 nm）（a）DNA折紙術(shù)原理及二維組裝［9］；（b）三維組裝與彎曲控制［11］；（c）曲面設(shè)計與網(wǎng)狀編織［12-13］Fig.2 Basic principle of DNA origami and its development(Scale bar:50 nm)(a)Principle for the 2D assembly of DNA origami[9];(b)3D structure assembly with the bending control[11];(c)Design for curved surface and DNA gridiron[12-13]

近年來，以DNA 折紙術(shù)為代表的DNA 納米技術(shù)被逐步應(yīng)用于合成生物學研究，并且具有以下獨特優(yōu)勢：①高度可設(shè)計性，由于基于堿基互補配對原則進行自組裝，可以很容易地通過核酸鏈的設(shè)計來控制結(jié)構(gòu)的構(gòu)象，目前已經(jīng)可以實現(xiàn)一維到三維［16-18］、平直到彎曲［11-12］、孤立到復合［10，19］結(jié)構(gòu)的自組裝；②精確可尋址性，DNA 納米結(jié)構(gòu)還可以作為模板進一步指導其他納米材料的精準組裝，并且對數(shù)量、位置、距離等關(guān)鍵參數(shù)進行納米級精確控制，這些納米材料可以是無機材料，如金納米顆粒（Au nanoparticle，AuNP）［20］，也可以是生物大分子，如核酸［21］、蛋白［16］、磷脂［22］等；③生物親和性，由于DNA 是天然存在的生物大分子，在構(gòu)建納米結(jié)構(gòu)用于醫(yī)學診斷和疾病治療時具有低免疫原性、低毒性等優(yōu)勢，因此在生物醫(yī)學領(lǐng)域具有較為廣泛的應(yīng)用前景；④模塊化組裝，通過模塊化組裝，可以大大提高結(jié)構(gòu)尺度，為在合成生物學的應(yīng)用提供了新的可能性。例如，DNA 磚塊是可以作為模塊的短鏈DNA，通過編程將它們像樂高積木那樣搭扣拼裝，可以將這些DNA 磚塊組裝成精確的形狀［23］，用于構(gòu)建（0.1～1）×109Da 的三維結(jié)構(gòu)［24］。近日，meta-DNA（元-DNA）策略的出現(xiàn)極大地推動了DNA 結(jié)構(gòu)的模塊化組裝，其組裝方式類似于短DNA 鏈的自組裝，可用于構(gòu)建更多宏觀規(guī)模的DNA 結(jié)構(gòu)，尺度可達亞微米-微米級［25］，甚至進行鏈置換反應(yīng)［26］，未來有望在合成生物學和光電子學方面進行應(yīng)用。

3 DNA納米技術(shù)服務(wù)于合成生物學

3.1 利用框架核酸實現(xiàn)生物大分子的有序裝配

DNA 納米技術(shù)由于具有高度的可設(shè)計性和空間可尋址性，已經(jīng)成熟地應(yīng)用于對無機材料進行有序裝配，例如AuNP、碳納米管、高分子聚合物等。AuNP 可以通過與巰基修飾的DNA 形成硫金鍵結(jié)合在DNA 納米結(jié)構(gòu)上，實現(xiàn)在一維、二維或三維的DNA 框架上數(shù)量、位置可控的排列［27］。碳納米管通過末端修飾或中段綁定，也可以在DNA納米結(jié)構(gòu)上實現(xiàn)可控角度、位置的組裝［28-30］，甚至可以在酶的催化下實現(xiàn)固定長度的切割［31］。此外，聚（2，5-二烷氧基）對苯乙烯-DNA 刷狀聚合物［32］、聚多巴胺［33］等也可以在DNA折紙結(jié)構(gòu)上實現(xiàn)定位與排列。

除了無機材料和人工高分子材料，DNA 納米結(jié)構(gòu)也大量應(yīng)用于生物大分子的有序裝配。由于能夠精確控制裝配材料的數(shù)量、距離和方向，DNA 納米結(jié)構(gòu)在對生物大分子進行有序裝配方面具有極大的優(yōu)勢。以下將從分子類型的角度，分別介紹基于DNA 折紙結(jié)構(gòu)的核酸裝配、蛋白裝配和磷脂裝配等方向的進展。

3.1.1 核酸裝配

DNA 折紙結(jié)構(gòu)自身的核酸屬性為其作為模板對靶分子核酸片段的進一步裝配提供了便捷條件，利用折紙結(jié)構(gòu)特定位置上訂書釘鏈延伸出相應(yīng)序列，即可通過分子雜交的方法實現(xiàn)溶液中靶標核酸分子（包括DNA 和RNA）的識別與結(jié)合。2005 年，Lund 等［21］設(shè)計了3×3 的納米網(wǎng)格，并在每個網(wǎng)格節(jié)點伸出的9 nt的黏性末端上各雜交一段不同的寡核苷酸鏈作為該節(jié)點的標簽，應(yīng)用鏈親和素標記的方法實現(xiàn)了原子力顯微鏡（atomic force microscopy，AFM）下對節(jié)點的精確定位。Ke 等［34］利用DNA 折紙術(shù)構(gòu)建了矩形核酸探針模塊，表面伸出的單鏈DNA 片段能夠通過“V 字形”連接的方法與溶液中的RNA 形成DNA-RNA 雜交鏈，從而實現(xiàn)了RNA 在納米尺度的有序裝配［圖3（a）］，被用于多種RNA序列的無標記檢測。

圖3 核酸分子裝配及應(yīng)用（a）RNA識別陣列［34］；（b）DNA機器與分子搬運［46］Fig.3 Assembly and applications of nucleic acid molecules(a)RNA recognition array[34];(b)DNA machines and molecular handling[46]

由于核酸互補雜交反應(yīng)是基于多重氫鍵和堿基堆疊的多弱相互作用，因此可以根據(jù)核酸鏈的長度和序列進行精準細致的調(diào)節(jié)，這一優(yōu)勢為核酸的動態(tài)結(jié)合提供了基礎(chǔ)，并用于構(gòu)建納米條形碼、分子計算機和分子步行器（DNA walker）。實現(xiàn)動態(tài)組裝的第一種方式是利用短鏈DNA 瞬時概率性的互補雜交，在DNA 納米結(jié)構(gòu)模板的特定位置實現(xiàn)熒光閃爍，通過對熒光閃爍的持續(xù)記錄、信號疊加以及基于泊松分布的位置計算，該位置可以以納米級別的分辨率呈現(xiàn)出來，這一全新技術(shù)被稱為DNA-PAINT（DNA points accumulation for imaging in nanoscale topography），它為超分辨熒光顯微成像技術(shù)家族增添了新鮮血液?；贒NA-PAINT 技術(shù)，哈佛大學Lin 等［35］在一條含平行6 條雙鏈螺旋的DNA 長棒上通過三色熒光構(gòu)建了簡易的條形碼系統(tǒng)，在混合熒光的應(yīng)用下實現(xiàn)了216種獨立條碼的高分辨成像。

基于DNA的分子計算是動態(tài)DNA納米技術(shù)的前沿領(lǐng)域，其基礎(chǔ)是鏈置換反應(yīng)，該反應(yīng)起始于目標結(jié)構(gòu)的單鏈區(qū)（toehold），加入的啟動鏈可以通過分支遷移取代掉預先雜交DNA 鏈，置換下的DNA 鏈又可以作為下個鏈取代反應(yīng)的啟動鏈。Seelig 等［36］首先基于鏈取代反應(yīng)設(shè)計了邏輯門，包括與門（AND）、或門（OR）和非門（NOT）。隨后，Qian和Winfree［37］在此基礎(chǔ)上設(shè)計了一種新的邏輯門，由130 條DNA 鏈構(gòu)成，可以實現(xiàn)四位二進制數(shù)的開方運算。上述DNA 計算往往基于若干條寡核苷酸鏈彼此之間結(jié)合或解體的競爭過程，而其表征依賴于熒光信號的增強或衰減曲線的解讀，因此并不利于直觀觀察。DNA 結(jié)構(gòu)組裝技術(shù)為DNA計算的可視化提供了新思路，當DNA模塊間的組裝行為被邏輯運算法則所規(guī)定的時候，其運算結(jié)果可以以圖案的形式展現(xiàn)。在過去幾年中，Qian 的團隊通過正方形DNA 折紙模塊的邊界信息編輯，實現(xiàn)了隨機迷宮［38］、蒙娜麗莎、公雞、電子線路等圖樣的組裝［14］；利用“模塊置換反應(yīng)”（tile displacement）讓DNA 自行運行井字格游戲（tic-tac-toe game）［39］；利用“贏者通吃”的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)策略實現(xiàn)了基于DNA 邏輯線路的圖像識別［40］。2019 年，Winfree 和哈佛大學的尹鵬［41］合作利用355 條單鏈DNA 模塊實現(xiàn)了連續(xù)邏輯線路的生長和圖像化，這些邏輯線路可以攜載6 個bit 的算法，進行隨機游走、乘法、排序、選舉等操作，并將數(shù)字化的結(jié)果直接以組裝出的條帶在原子力顯微鏡下呈現(xiàn)出來。這些進步展示了抽象算法與具象分子組裝之間的完美契合，也代表了一類基于DNA模板的核酸裝配的發(fā)展方向。

DNA 分子步行器是可以沿著特定路線或軌道行走的DNA 納米結(jié)構(gòu)?；谇拔乃龅逆溨脫Q反應(yīng)，DNA 結(jié)構(gòu)通過不同結(jié)構(gòu)域在軌道上的先后結(jié)合和解體，即可實現(xiàn)步進式的定向運動。早在2004 年，Sherman 等［42］即通過分步加入DNA 鏈，實現(xiàn)了兩足結(jié)構(gòu)在既定的線性軌道上前進或后退。Gu 等［43］利用類似的原理在DNA 折紙結(jié)構(gòu)的模板上實現(xiàn)了一個三角形結(jié)構(gòu)的步進控制，并在步進過程中完成了結(jié)構(gòu)搭載和釋放金納米顆粒貨物的應(yīng)用。另一類自動步進器拋開了復雜低速的鏈置換反應(yīng)，而是通過酶切反應(yīng)消耗軌道上的核酸燃料驅(qū)動結(jié)構(gòu)運動。Tian 等［44］設(shè)計了一種包含DNA酶的DNA 納米結(jié)構(gòu)，可以不斷地從底物分子（RNA）中提取化學能，并利用這種能量來推動DNA 裝置在一維軌道上的單向運動。基于相同原理，Lund 等［45］設(shè)計了一款分子蜘蛛（molecular spider），可以通過感應(yīng)和修飾二維DNA 折紙上的底物分子的軌跡，來實現(xiàn)包括“起始”“跟隨”“轉(zhuǎn)彎”“停止”的定向運動。值得注意的是，上述裝置由于在運動過程中擦除了軌道，從而無法逆向或可控運行，是一類一次性運動器件。而2017 年Qian 和Winfree 課題組［46］設(shè)計的新型分子機器利用雙腳在二維模板上交替站穩(wěn)的策略，一定程度上犧牲了分子機器運動的定向性，但實現(xiàn)了軌道的無損使用［圖3（b）］。采用這一系統(tǒng)分子機器仍然可以在隨機游走的過程中，利用結(jié)合能力差異將分子貨物從起始點分選并運送到目的地。

3.1.2 蛋白裝配

在細胞表面以及細胞內(nèi)，蛋白的協(xié)同作用并不是空間上隨機的，它們往往需要一定的空間排布和種類數(shù)量才可以高效行使功能。然而，以往的技術(shù)在納米級對蛋白進行有序裝配存在相當大的困難，而DNA 可以和蛋白進行有效結(jié)合，這樣利用DNA 納米結(jié)構(gòu)的可尋址性，可以在預先設(shè)計的位置進行修飾，完成對蛋白的精確排布，操作較為簡單。

目前，對DNA 進行蛋白裝配的方法主要包括非共價偶聯(lián)和共價偶聯(lián)（表1）。非共價偶聯(lián)主要利用DNA 上修飾的配體和蛋白之間的相互作用形成DNA-蛋白復合物，主要包括以下方式：生物素-鏈親和素［47］、Ni-NTA-Histag［48］、抗體-抗原［49］、核酸適配體-蛋白［50］、DNA結(jié)合蛋白［51］（例如鋅指蛋白）、RNA-病毒蛋白［52］、DNA-衣殼蛋白［53］等。非共價偶聯(lián)的優(yōu)點是具有可逆性，然而在特定狀態(tài)下，這種結(jié)合并不穩(wěn)定，這就需要共價偶聯(lián)的方式獲得更加穩(wěn)定的DNA-蛋白復合物。共價偶聯(lián)的方式又分為非特異性的和特異性的。N-琥珀酰亞氨基3-（2-吡啶基二硫代）-丙酸鹽［N-succinimidyl 3-（2-pyridyldithio）-propionate，SPDP］［54］和磺基丁二酰亞胺-4-（N-馬來亞胺甲基）-環(huán)己烷-1-羧酸酯［Nsuccinimidyl 3-（2-pyridyldithio）-propionate，Sulfo-SMCC］［55］作為小分子交聯(lián)劑，可以通過連接蛋白質(zhì)表面的賴氨酸殘基和DNA 上的巰基將蛋白質(zhì)和DNA 進行非特異性共價偶聯(lián)。而進行特異性共價偶聯(lián)則通常會引入一個tag蛋白，tag蛋白通過融合到目標蛋白來提供自催化反應(yīng)位點，用以和小分子標記的DNA 進行反應(yīng)。常用的tag 蛋白包括人O6-烷基鳥嘌呤-DNA 烷基轉(zhuǎn)移酶（SNAP-tag）［56］和鹵代烷脫鹵酶［57］（Halo-tag）。

表1 蛋白裝配的分類Tab.1 Classification of protein assembly

解決了修飾問題，人們便可以通過設(shè)計DNA框架，精確控制蛋白類研究對象的種類、數(shù)量、間距等重要參數(shù)，實現(xiàn)對蛋白位置和功能的調(diào)控。Voigt 等［58］構(gòu)建了矩形DNA 納米結(jié)構(gòu)，并在選定位置的訂書釘鏈上進行生物素修飾，這樣單個化學鍵的形成或斷裂將導致生物素-鏈親和素復合物的附著或去除，這一過程可以運用AFM 進行表征，通過不同的蛋白分子排布，實現(xiàn)對單分子化學反應(yīng)的表征。Rinker 等［59］將多親和力的核酸適配體裝配在矩形DNA 納米結(jié)構(gòu)上，它們可以作為“鉗子”來捕獲和展示納米陣列上的凝血酶分子，并通過AFM 研究了“鉗子”寬度對捕獲效率的影響，加深了對適配體-蛋白相互作用的認識。擺臂（swinging arm）是許多天然存在的多酶復合物中多步催化轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵功能部分，它能通過柔性接頭（linker）共價連接于酶復合物上，從而使底物分子在復合物的多個活性位點之間直接轉(zhuǎn)移。而利用DNA 納米技術(shù)可以實現(xiàn)對這些位點距離的精確調(diào)控，這種納米級別對位置參數(shù)的控制是其他技術(shù)較難達到的。Fu等［60］將葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6pDH） 和蘋果酸脫氫酶（malic dehydrogenase，MDH）裝配在DX 結(jié)構(gòu)模塊（double crossover tile）兩端，并在其中間放置了輔酶NAD+修飾的人工擺臂，實現(xiàn)了這兩種脫氫酶之間的氫化物轉(zhuǎn)移和級聯(lián)反應(yīng)效率的提高，并且可以利用DNA 納米結(jié)構(gòu)的可尋址性，精確控制關(guān)鍵參數(shù)（包括位置、化學計量和酶間距離）以獲得最佳活性。Ke等［61］進一步引入乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）并將該體系拓展放置在矩形的DNA 折紙結(jié)構(gòu)上，把輔酶NAD+參與的兩套酶聯(lián)反應(yīng)路徑以前置G6pDH酶為中心向兩側(cè)排列，通過鏈置換反應(yīng)把NAD+擺臂選擇性錨定在不同的路徑上，即可相應(yīng)開啟該酶聯(lián)通路［圖4（a）］。這些研究利用DNA 納米技術(shù)對蛋白進行精確裝配，推動了蛋白功能研究甚至級聯(lián)生化反應(yīng)的功能研究，為酶促反應(yīng)的精細研究和調(diào)控提供了全新的平臺。

3.1.3 磷脂裝配

除了對核酸和蛋白質(zhì)進行有序裝配，對于磷脂這一雙親性生物大分子，DNA納米框架可以實現(xiàn)對誘導生長出的人工脂質(zhì)體大小、形狀的精確控制。2016年，Yang等［62］利用剛性DNA納米環(huán)指導磷脂分子作為種子（seed）進行有序裝配，隨后利用透析法在納米環(huán)內(nèi)誘導生長出大小可控、均一化的人工脂質(zhì)體［圖4（b）］，提供了新的脂質(zhì)雙層膜指導形成的方法，為囊泡運輸和藥物遞送的研究提供了有價值的研究工具。利用同樣的誘導脂質(zhì)體生長的方法，還可以通過調(diào)節(jié)DNA 框架的幾何結(jié)構(gòu)以完成對其中納米囊泡形狀的精確控制。Zhang等［63］構(gòu)建了模塊化的DNA 納米籠，通過改變納米籠的排列和構(gòu)象，誘導生長出了串珠、管狀、螺旋狀、環(huán)管狀的人工脂質(zhì)膜結(jié)構(gòu)。相比三維球狀的脂膜結(jié)構(gòu)，平面可視化的二維平面膜（納米脂盤）在膜蛋白的顯微研究方面有著巨大的工具優(yōu)勢，而大面積的二維平面脂膜制備始終是一個難題。針對這一問題，哈佛大學的Zhao 等［64］利用環(huán)狀剛性的DNA納米框架定位組裝了一圈小納米盤并誘導它們生長充滿了環(huán)內(nèi)的二維平面，形成90 nm 直徑的巨大納米脂盤，并應(yīng)用于通道蛋白VDAC-1和脊髓灰質(zhì)炎病毒的展示和成像［圖4（c）］。上述進展顯示了DNA 納米結(jié)構(gòu)框架在制備、調(diào)控生物膜體系方面所具有的重要價值和應(yīng)用潛力。

圖4 蛋白組裝與磷脂組裝（a）酶促反應(yīng)介導與調(diào)控［61］；（b）可控尺寸囊泡組裝［62］；（c）二維磷脂膜組裝［64］Fig.4 DNA nanoframe-directed assembly of proteins and phospholipids(a)DNA swing arm and regulation on cascade enzymatic reactions[61];(b)Vesicles with controllable sizes[62];(c)Two-dimensional lipid bilayer assembly[64]

3.2 利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建仿生細胞元件、生物裝置和生化系統(tǒng)

合成生物學的一個重要研究任務(wù)是模擬自然界已有的生物學配件和體系，甚至在某些場景下替代自然生命體系。然而，由于細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的復雜性和各種生化活動的時空復合性，僅依靠傳統(tǒng)技術(shù)對其模擬具有很大的困難。而DNA納米技術(shù)由于在納米級別的精確可控性，在模擬細胞的很多生物配件例如核孔、人工膜通道、網(wǎng)格蛋白等方面具有獨特的優(yōu)勢；并且由于利用DNA納米技術(shù)可以對生物大分子進行有序裝配，使其對構(gòu)建具有復合結(jié)構(gòu)的生物裝置和系統(tǒng)，模擬體內(nèi)生物過程、體內(nèi)合成體系具有較強的應(yīng)用潛力。下文將從組裝仿生細胞元件、模擬生物過程和構(gòu)建生化系統(tǒng)三個方面進行介紹。

3.2.1 組裝仿生細胞元件

核孔是核質(zhì)與細胞質(zhì)進行物質(zhì)交換的重要通道，結(jié)構(gòu)相當復雜，內(nèi)徑約40 nm，內(nèi)部有一定數(shù)量無序的核孔蛋白（nucleoporins，nups），它們富含苯丙氨酸（FG）氨基酸殘基，又稱為FG-nups。為模擬天然核孔結(jié)構(gòu)的大小和形態(tài)，F(xiàn)isher 等［55］構(gòu)建了內(nèi)徑為46 nm 的DNA 納米環(huán)，該結(jié)構(gòu)向內(nèi)伸出多個錨定序列，可以再連接8個、16個、24個或32 個FG-nups［圖5（a）］，應(yīng)用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）和AFM對該人工核孔進行表征，深入研究了該人工核孔中FG 結(jié)構(gòu)域的拷貝數(shù)和構(gòu)型對“核孔”結(jié)構(gòu)的影響，對探討核孔結(jié)構(gòu)通透性的建立有著重要的價值。類似的，Ketterer 等［65］設(shè)計了內(nèi)徑為34 nm 的人工核孔，該結(jié)構(gòu)向內(nèi)伸出不同數(shù)量的FG-nups或者其親水突變體，探討了數(shù)量和親水突變體對核孔內(nèi)部蛋白密度和電導率的影響。

圖5 構(gòu)建仿生細胞元件（a）模擬核孔復合體［55］；（b）模擬細胞骨架蛋白［70］Fig.5 Mimic and construction of cell elements(a)Simulation of the nuclear pore complex [55];(b)Simulation of cytoskeleton protein and network [70]

另一DNA 納米結(jié)構(gòu)在仿生細胞元件上的重要應(yīng)用是構(gòu)建人工膜通道。天然的膜通道多由蛋白質(zhì)構(gòu)成，結(jié)構(gòu)精巧，可以進行細胞內(nèi)外的小分子和離子的被動擴散或者主動運輸。目前，研究人員試圖利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建人工膜通道，用來模擬天然離子通道，甚至向細胞內(nèi)進行分子運輸。2012 年，Langecker 等［66］設(shè)計了由54 條平行DNA螺旋束構(gòu)成的人工離子通道，通過膽固醇修飾可以使頭部的桶狀結(jié)構(gòu)固定在人造脂質(zhì)雙層膜上，中央6條螺旋束圍成的莖狀結(jié)構(gòu)則穿過膜結(jié)構(gòu)，在單通道電生理測量中該結(jié)構(gòu)具有與天然離子通道類似的響應(yīng)，然而該結(jié)構(gòu)未在活細胞上進行測試。近 期 ， Lü 等［67］構(gòu) 建 了 硫 代 磷 酸（phosphorothioate，PPT）修飾的人工膜通道，該結(jié)構(gòu)由6 條DNA 螺旋束圍成，內(nèi)徑為2 nm，并證實這種結(jié)構(gòu)可以將離子和小分子抗腫瘤藥物分別運輸至神經(jīng)細胞和腫瘤細胞中，成功模擬了生物分子跨活細胞膜轉(zhuǎn)運的過程。除了上述兩項代表性工作，近年來大量基于DNA 納米結(jié)構(gòu)的人工跨膜孔道體系被構(gòu)建出來，英國倫敦大學學院的Howorka 課 題 組［68］在2021 年 初 的 一 篇Nature Protocol文章中細致綜述了各類孔道的跨膜機制和設(shè)計制備原則方法，為領(lǐng)域內(nèi)和跨領(lǐng)域研究者進行相關(guān)工具的開發(fā)與應(yīng)用提供了重要的參考。

網(wǎng)格蛋白是一種細胞內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的單元模塊，它具有特征性的三聯(lián)體骨架結(jié)構(gòu)，在細胞內(nèi)吞過程中自組裝形成多面體晶格，逐漸覆蓋在細胞膜上，最終使脂質(zhì)雙層內(nèi)陷并脫離細胞膜［69］。Journot等［70］模擬網(wǎng)格蛋白三聯(lián)體（triskelion）設(shè)計了三臂的DNA 納米結(jié)構(gòu)，利用膽固醇可以將其錨定在脂質(zhì)單分子或者雙分子層上，加入訂書釘鏈后可以誘導其形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［圖5（b）］。利用TEM可以觀察到三臂結(jié)構(gòu)聚集引起的脂質(zhì)單分子層的局部變形，這一過程類似網(wǎng)格蛋白誘導的小凹形成。

3.2.2 模擬生物過程

運用DNA 納米技術(shù)可以構(gòu)建仿生裝置，對生物體內(nèi)大量分子參與的復雜生理過程進行模擬，有助于將復雜的生命現(xiàn)象在體外進行簡單的模式化研究，并且能夠在體外對各種參數(shù)進行精確的控制。大部分生物膜相關(guān)的生理生化反應(yīng)是由膜蛋白驅(qū)動，磷脂雙分子層共同參與的復雜過程。傳統(tǒng)生化研究方法雖然可以得到大致的分子組成信息、環(huán)境信息和初末狀態(tài)信息，并提出一定的合理假設(shè)，但對于真實狀態(tài)的分子時空排布與變構(gòu)、磷脂膜的應(yīng)變過程等信息的獲取無能為力。耶魯大學的Lin Chenxiang 課題組近年來做出了一系列重要工作，利用DNA 納米結(jié)構(gòu)為上述問題的研究提供了全新的工具。

膜融合是一種重要的生命現(xiàn)象，可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感性因子附著型的蛋白受體（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor，SNARE）在這一過程中起到了關(guān)鍵作用。SNARE 蛋白復合體由三種蛋白構(gòu)成：質(zhì)膜蛋白（t-SNAREs）Synaxin 1、25kDa 的突觸小體相關(guān)蛋白（STX1 和SNAP25A）和囊泡蛋白（v-SNARE）synaptobrevin-2（VAMP2）。Xu 等［71］構(gòu)建了DNA 納米環(huán)，通過錨定序列可以將一定數(shù)量的VAMP2 和脂質(zhì)固定在納米環(huán)上并指向環(huán)的內(nèi)部，并且設(shè)計了一對DNA系鏈（tether）v-tether和t-tether 來模擬天然的系鏈蛋白，修飾DNA v-tether小型單層膜囊泡 （small unilamellar vesicles，SUV）可以通過疏水作用組裝到納米環(huán)上，這樣能夠和修飾了DNA t-tether 的支持脂質(zhì)雙層（supported lipid bilayers，SBL）組成生物裝置來模擬SNARE 蛋白介導的錨定和膜融合的過程［圖6（a）］，該研究證明了僅僅一兩對SNARE 復合物足以誘導膜融合反應(yīng)的發(fā)生。

圖6 模擬生物過程和生化體系（a）模擬蛋白錨定和膜融合［71］；（b）囊泡成管［74］；（c）RNA擠出納米工廠［75］；（d）自組裝合成衣殼蛋白［52］；（e）自主調(diào)控凝血系統(tǒng)［77］；（f）肌動蛋白運動［78］Fig.6 Mimic king biological reactions and biochemical systems(a)Simulation of SNAREs protein-induced membrane fusion[71];(b)Mimicking BAR protein-induced membrane tubulation [74];(c)Producing RNA in a nanofactory[75];(d)Assembly TMV capsid protein on the DNA template [52];(e)Autonomous regulation of the thrombin dependent coagulation[77];(f)Simulation of the G-actin movement [78]

兩片鄰近的磷脂膜之間發(fā)生磷脂分子的交換傳遞現(xiàn)象也是一種重要而神秘的生理現(xiàn)象，通常發(fā)生在膜接觸的部位。為了研究這些特定位點的脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白的作用機理，Bian等［72］構(gòu)建了DNA折紙結(jié)構(gòu)，可以精確控制兩個脂質(zhì)體之間的距離，并應(yīng)用該結(jié)構(gòu)研究了突觸結(jié)合蛋白樣線粒體脂質(zhì)結(jié)合蛋白（synaptotagmin-like mitochondrial lipidbinding protein，SMP）結(jié)構(gòu)域的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移，發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)轉(zhuǎn)移可以發(fā)生在超過SMP 二聚體長度的距離上，符合脂質(zhì)運輸?shù)拇┧竽Ｐ汀?/p>

成管過程在細胞內(nèi)吞、病毒出芽和胞質(zhì)分裂中扮演著重要的角色。多種膜變形蛋白可以感知并且產(chǎn)生膜曲率，從而幫助細胞膜成管［73］。為模擬動力蛋白（dynamins）和內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復合體（endosomal sorting complex required for transport，

ESCRT）聚合成螺旋結(jié)構(gòu)包裹脂質(zhì)微管的過程，Grome 等［74］構(gòu)建了DNA 折紙卷曲（curls）用來誘導大型單層膜囊泡（large unilamellar vesicles，LUV）的成管［圖6（b）］。這種DNA 卷曲能夠自組裝成類似Snf7 的長絲狀螺旋結(jié)構(gòu)，并且在其內(nèi)表面修飾兩親性肽來模擬Snf7的N段ANCHR螺旋用以增強其膜親和性。

3.2.3 構(gòu)建生化體系

從工程化的角度看，生物體內(nèi)部有著各種復雜的生理生化體系負責物質(zhì)合成、結(jié)構(gòu)組裝、信號調(diào)控和能量輸出等具體任務(wù)。利用DNA 納米技術(shù)，模擬生命在體外構(gòu)建人工體系是非常有趣的方向，不但有助于加深對天然體系的認識，也為諸如人工細胞等復雜仿生體系的構(gòu)建提供可用模塊。

2020 年，Hahn 等［75］設(shè)計了一款RNA 擠出納米工廠（nanofactory），可以對RNA 進行完整的滾環(huán)轉(zhuǎn)錄和加工。他們構(gòu)建了外部直徑為60 nm 的DNA 折紙桶裝結(jié)構(gòu)作為“廠房”，內(nèi)部“機器”在其中按一定空間構(gòu)象排列［圖6（c）］。內(nèi)部的“機器”包括：①RNA產(chǎn)生單元，由DNA模板和RNA聚合酶組成，進行滾環(huán)轉(zhuǎn)錄，平均每30 min 能夠產(chǎn)生100 個拷貝的目標RNA；②RNA 加工單元，RNA 內(nèi)切酶可以進一步將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從聚合體切割為單體，從而使加工效率提高30%。納米工廠提供了一種RNA 轉(zhuǎn)錄和加工的體外模型，用以研究RNA 分子排列對其功能的影響，并且為體外生產(chǎn)RNA以外的其他材料提供了新思路。

為模仿病毒衣殼蛋白的合成過程，研究人員又設(shè)計了體外蛋白合成體系，將DNA 納米結(jié)構(gòu)作為模板，可以在其上雜交RNA 鏈，用于合成衣殼蛋白并完成自組裝。2018年，Zhou等［52］構(gòu)建了棒狀、三角形和三腳架DNA 納米結(jié)構(gòu)，并將煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus，TMV）基因組來源的RNA 鏈通過錨定位點連接在這些結(jié)構(gòu)上，這段RNA 序列上包含了裝配序列的起始段，可以原位介導衣殼蛋白的合成，而衣殼蛋白會自組裝為圓柱體結(jié)構(gòu)［圖6（d）］。該研究為精確設(shè)計并合成DNA-蛋白復合結(jié)構(gòu)提供了新的路徑。在此研究的基礎(chǔ)上，Zhou 等［76］又設(shè)計了動態(tài)組裝TMV 衣殼蛋白的體系，通過間隔設(shè)計錨定位點，可以將TMA-RNA 按照預先設(shè)計的方式固定在DNA 納米結(jié)構(gòu)上，而錨定位點的延長鏈中包含了可以進行鏈置換反應(yīng)的toehold 區(qū)域，加入信號鏈則觸發(fā)RNA 鏈的釋放，進而能夠進行衣殼蛋白的原位組裝，若RNA 未成功釋放，則組裝中止，該體系探討了實現(xiàn)可編程DNA-蛋白復合結(jié)構(gòu)動態(tài)組裝的可能性。

凝血系統(tǒng)是高等生物體內(nèi)非常復雜和達到精致平衡的體系，其調(diào)節(jié)失衡將導致血栓或溶血兩個方向的致命后果。Yang 等［77］利用一種桶狀DNA 納米結(jié)構(gòu)模板（結(jié)構(gòu)部）搭建了一組由凝血酶傳感器、閾值控制和凝血抑制劑生成器三個模塊組成的自主調(diào)控系統(tǒng)（計算部）［圖6（e）］，可以通過調(diào)節(jié)傳感模塊和閾值模塊的比例，在模擬生物血漿的環(huán)境中實現(xiàn)對抗凝激活濃度的任意調(diào)節(jié)，并為該體系在不同醫(yī)療場景中對凝血酶活性自主調(diào)控開啟了可能性。

肌小節(jié)是肌纖維收縮的基本功能單位，由肌球蛋白構(gòu)成（myosins），可以自組裝成粗肌絲，可以在高度結(jié)構(gòu)化的晶格中與基于肌動蛋白（actin）的細肌絲相互作用。在模擬天然粗肌絲的形態(tài)方面，F(xiàn)ujita 等［78］構(gòu)建了棒狀DNA 納米結(jié)構(gòu)，并將肌球蛋白IIa通過linker連接在結(jié)構(gòu)上，這樣可以在有限的空間內(nèi)直接觀察力產(chǎn)生過程中肌動蛋白頭部的運動［圖6（f）］。他們發(fā)現(xiàn)頭部擴散時，會與肌動蛋白發(fā)生弱相互作用，隨后像布朗棘輪一樣優(yōu)先與前部區(qū)域緊密結(jié)合。在牢固結(jié)合后，兩級杠桿臂擺動主要在第一步停止，偶爾會反轉(zhuǎn)方向。利用該裝置可以實現(xiàn)對多個參數(shù)進行精確控制，例如傾斜步數(shù)、杠桿角度、弱相互作用的結(jié)合和分離動力學，以及空間不對稱性。

綜上，DNA 納米組裝結(jié)構(gòu)在指導生物大分子組裝并構(gòu)建仿生元件、過程、體系方面有著獨特優(yōu)勢，因此DNA 納米技術(shù)在合成生物學領(lǐng)域具有巨大的發(fā)展前景和應(yīng)用潛力。

4 生物醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用

4.1 藥物遞送

裸露的治療藥物（包括小分子和生物分子藥物），溶解性較低，對酶和化學降解的穩(wěn)定性較差，具有一定副作用和毒性，且往往難以越過生物屏障，因此大多數(shù)時候無法在體內(nèi)發(fā)揮其全部療效［79］。近年來，DNA 納米結(jié)構(gòu)由于具有結(jié)構(gòu)可控性和生物親和性，在開發(fā)藥物遞送方面有非常大的優(yōu)勢，可以用于增加載藥量、延長體內(nèi)循環(huán)時間，從而獲得更好的療效［79-80］。

從可控性角度看，具有開關(guān)功能的DNA 納米結(jié)構(gòu)可以在一定條件下打開并釋放內(nèi)容物，因此在藥物靶向遞送方面有著很大的應(yīng)用潛力。2012 年，Douglas 等［81］構(gòu)建的一種邏輯門控的DNA 納米機器人，可以將負載的分子藥物遞送給靶細胞。該機器人為六角套筒形的結(jié)構(gòu)，分子藥物通過共價修飾連接到結(jié)構(gòu)內(nèi)部，兩對核酸適配體-互補序列分別修飾在機器人前部兩側(cè)，組成一套“與”計算的邏輯門控體系，只有當兩個核酸適配體都和抗原結(jié)合才能打開結(jié)構(gòu)，暴露其中的有效載荷［圖7（a）］。

從載藥角度，DNA 納米結(jié)構(gòu)已被成功用于小分子藥物、siRNA 等分子的搭載［79］。阿霉素（doxorubicin，DOX）是一種常用的小分子藥物，具有抗腫瘤的作用，然而它的脫靶效應(yīng)會導致心肌損傷，因此選用合適的遞送方式非常重要。而DOX 具有插層作用，能夠插入到DNA 中并降低其扭轉(zhuǎn)應(yīng)力［82］，并且搭載到DNA 納米結(jié)構(gòu)上的方式也較為簡單［83］。小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）是一個20～25 個核苷酸的雙鏈RNA，主要參與RNA 干擾，可以特異性地沉默靶基因用于基因治療［84］。siRNA 引起的免疫反應(yīng)較小，然而最大的問題是體內(nèi)的穩(wěn)定性較低，可以利用DNA 納米結(jié)構(gòu)搭載siRNA 增加其穩(wěn)定性［85］。siRNA 可以通過與DNA 納米結(jié)構(gòu)伸出的錨定序列雜交［86-87］連接到結(jié)構(gòu)上。此外，還可以同時在DNA 納米結(jié)構(gòu)上搭載多種藥物進行聯(lián)合治療。例如，Liu 等［88］構(gòu)建了三角形的DNA 納米結(jié)構(gòu)，同時搭載了腫瘤治療基因P53 和小分子藥物DOX，可用于多藥耐藥性腫瘤人乳腺癌MCF-7R細胞系的聯(lián)合治療，在體內(nèi)體外均能有效抑制腫瘤增長，且無明顯全身毒性。

近年來，研究人員利用不同形狀的DNA 納米結(jié)構(gòu)進行了大量細胞遞送研究，例如三角形［88-89］、矩形［87］、棒狀［90-91］、納米管［87］、納米籠［92-93］、四面體［94-95］、立方體［96-97］、八面體［92］、二十面體［98］等。DNA 納米結(jié)構(gòu)可以通過內(nèi)吞途徑或非內(nèi)吞途徑進入細胞，內(nèi)吞途徑主要包括吞噬作用、網(wǎng)格蛋白依賴型內(nèi)吞、小窩蛋白依賴型內(nèi)吞和巨胞飲［79］。通過加入抑制劑阻斷通路的方法可以對結(jié)構(gòu)進入細胞的途徑進行探索［94］。然而，細胞攝取DNA納米結(jié)構(gòu)的具體機制仍有待進一步研究。

影響DNA 納米結(jié)構(gòu)細胞遞送的主要因素包括：細胞類型［99］、結(jié)構(gòu)形狀［100］、結(jié)構(gòu)大小［90］、結(jié)構(gòu)剛性［101］、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性［102］和靶向分子修飾等［103］。因此，可以通過對結(jié)構(gòu)的優(yōu)化設(shè)計達到增加細胞攝取的目的。此外，還可以通過修飾病毒衣殼蛋白增加DNA 納米結(jié)構(gòu)的細胞遞送效率。Mikkil? 等［104］構(gòu)建了大小為72 nm×92 nm 的矩形DNA 折紙結(jié)構(gòu)，豇豆褪綠斑駁病毒（cowpea chlorotic mottle virus， CCMV） 的 衣 殼 蛋 白（capsid proteins，CP）可以通過靜電作用自組裝于結(jié)構(gòu)上，并將結(jié)構(gòu)包裹其中，形成DNA 折紙-CP復合體［圖7（b）］，應(yīng)用共聚焦顯微鏡觀察結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)染人胚腎293（human embryonic kidney，HEK）細胞，可以發(fā)現(xiàn)與裸露的折紙結(jié)構(gòu)相比，DNA 折紙-CP復合物的細胞遞送效率提高了13倍。

Perrault 等［105］模擬有包膜的球狀病毒結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了直徑約50 nm 的DNA 八面體結(jié)構(gòu)（DNAnano-octahedron，DNO），其中脂質(zhì)修飾的寡核苷酸可以與結(jié)構(gòu)上的48 個DNA 錨定序列雜交，并在結(jié)構(gòu)外部有序排列，隨后運用透析法可以誘導生成磷脂膜包裹的DNA 納米結(jié)構(gòu)［圖7（c）］。與無包膜的DNO相比，有包膜的DNO展現(xiàn)出較低的免疫應(yīng)答和更慢的體內(nèi)降解速度。

圖7 在生物醫(yī)學領(lǐng)域應(yīng)用（a）邏輯門控DNA納米機器人［81］；（b）病毒衣殼蛋白修飾DNA納米結(jié)構(gòu)［104］；（c）仿病毒磷脂膜包裹DNA納米結(jié)構(gòu)［105］Fig.7 Applications in biomedicines(a)Logic-gate controlled DNA nanorobot[81];(b)Viral capsid protein modified DNA nanostructure[104];(c)Virus-inspired membrane-coated DNA nanostructure[105]

DNA 納米結(jié)構(gòu)可以通過修飾核酸適配體或靶向性配體增加藥物的選擇性，減少脫靶效應(yīng)。Ma 等［106］將anti-HER2 核酸適配體加載到四面體DNA 納米結(jié)構(gòu)上，該結(jié)構(gòu)可以特異性靶向HER2陽性的SK-BR-3人乳腺癌細胞，通過誘導HER2介導的結(jié)構(gòu)內(nèi)吞和溶酶體降解，從而降低細胞膜表面的HER2表達，最終誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞生長。Ge等［93］利用靶向配體修飾棒狀DNA納米結(jié)構(gòu)，用于構(gòu)建抗體-藥物結(jié)合體（antibody-drug conjugate，ADC），配體2-［3-（1，3-二羧基丙基）-脲基］戊 二 酸（2-［3-（1，3-dicarboxy propyl）-ureido］pentanedioic acid，DUPA）可以與前列腺特異性膜抗原（prostate-specifc membrane antigen，PSMA）結(jié)合，將搭載DOX 的ADC 特異性地遞送到PSMA陽性的LNCaP人前列腺癌細胞系。

4.2 腫瘤治療

搭載抗腫瘤藥物（如Dox、siRNA 等）進行細胞遞送是常用的腫瘤治療的解決方案，在前面藥物遞送一節(jié)已經(jīng)做過介紹。除此以外，國家納米科學中心丁寶全教授課題組利用DNA 納米機器進行腫瘤血管栓塞和腫瘤疫苗開發(fā)，為腫瘤治療提供了新思路。2018 年，該課題組設(shè)計了一種DNA 納米機器人，可以在檢測到腫瘤標志物的部位精確給藥［107］，在這種DNA納米管狀結(jié)構(gòu)的內(nèi)部通過小分子交聯(lián)劑sulfo-SMCC 連接了一定數(shù)量的凝血酶，“鎖定序列”是靶向腫瘤標志物的核酸適配體，可以特異性識別腫瘤血管標志物核仁素（nucleolin）。在核酸適配體與腫瘤部位的核仁素結(jié)合后，結(jié)構(gòu)展開為矩形，凝血酶暴露于血液中，從而誘導血管內(nèi)的血栓形成和腫瘤壞死。2021年，丁教授課題組又構(gòu)建了一種管狀DNA 納米結(jié)構(gòu)用以開發(fā)腫瘤疫苗［108］，其內(nèi)部裝配了相同比例的一種抗原（OVA多肽）和兩種toll-樣受體激動劑（dsRNA 和CpG DNA），當結(jié)構(gòu)進入抗原提呈細胞（antigen presenting cells，APC）的溶酶體時，pH 的降低使“鎖定序列”構(gòu)象改變，結(jié)構(gòu)展開為矩形，暴露的抗原和佐劑會誘導APC 成熟，誘發(fā)強烈的腫瘤特異性T 細胞免疫，疫苗產(chǎn)生的長期T 細胞免疫應(yīng)答，可以有效地保護小鼠免受腫瘤的再次侵襲。然而，關(guān)于DNA 納米結(jié)構(gòu)應(yīng)用于藥物遞送和腫瘤治療方面的研究目前主要集中于細胞和動物層面，離臨床應(yīng)用還有一段距離，主要有幾個方向需要尋求突破：①降低結(jié)構(gòu)成本，實現(xiàn)批量制備；②獲得人體產(chǎn)生效應(yīng)所需劑量；③獲得結(jié)構(gòu)人體代謝相關(guān)數(shù)據(jù)；④評估在人體內(nèi)產(chǎn)生的免疫反應(yīng)。

5 挑戰(zhàn)與展望

綜上所述，DNA 納米結(jié)構(gòu)由于具有高度可設(shè)計性、精確可尋址性、生物親和性等特性，在納米級別的可控合成方面體現(xiàn)出獨特優(yōu)勢，已經(jīng)成為合成生物學重要的支持技術(shù)。本文詳細介紹了如何利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進行核酸、蛋白和磷脂的有序裝配，從而實現(xiàn)生物大分子在一維、二維或三維的DNA 框架上數(shù)量、位置可控的排列；如何利用DNA 納米技術(shù)構(gòu)建仿生細胞元件、生物過程和生化體系，包括模擬核孔、人工膜通道、網(wǎng)格蛋白等細胞配件，模擬膜融合、脂質(zhì)轉(zhuǎn)移、細胞膜成管等生命現(xiàn)象，以及構(gòu)建RNA 合成、病毒蛋白合成、凝血系統(tǒng)等復雜仿生體系；如何利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進行藥物遞送和腫瘤治療，并探討了搭載藥物種類、影響遞送效率的因素、增加靶向性的方法，以及在腫瘤血管栓塞、腫瘤疫苗開發(fā)方面的應(yīng)用。過去10 年中，DNA 納米技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展已經(jīng)不再滿足于從工程學的角度，追求結(jié)構(gòu)設(shè)計的新穎性和完善性，而是爆發(fā)式地向生命科學和醫(yī)學應(yīng)用的方向，提出內(nèi)在變革與不斷進步的要求。在探索實現(xiàn)這些具體需求的過程中，研究者們不斷地進行著向自然學習和作用于自然的反復迭代，逐步積累了越來越多的仿生構(gòu)建和功能化制備的知識與經(jīng)驗，相關(guān)成果也為化學生物學、合成生物學、分子醫(yī)學等領(lǐng)域注入了全新的血液，開啟了相當積極的探索。同時，我們也清楚地看到，利用DNA 納米結(jié)構(gòu)進一步合成、模擬、調(diào)控生物體系的過程中仍存在著較多改善的空間，例如：如何在已經(jīng)組裝完成的DNA 納米結(jié)構(gòu)上，一定程度地恢復和利用DNA 攜載遺傳信息能力；如何在提高結(jié)構(gòu)設(shè)計修飾復雜性的同時，保持人工體系的簡潔和生產(chǎn)的高效；如何在保證DNA 納米結(jié)構(gòu)合成效率的同時，擴大規(guī)模生產(chǎn)和降低材料成本；以及如何在細胞內(nèi)完成結(jié)構(gòu)的生產(chǎn)組裝等。這些問題為DNA 納米技術(shù)的發(fā)展指出未來研究方向。此外，目前DNA 納米技術(shù)在腫瘤治療的研究大部分停留在細胞和動物層面，在推進臨床轉(zhuǎn)化的道路上仍存在許多亟待解決的問題。例如：如何通過對DNA 納米結(jié)構(gòu)的合理設(shè)計，增加載藥量；如何在體液環(huán)境中保持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，延長體內(nèi)循環(huán)時間；如何評估結(jié)構(gòu)的免疫原性及反復給藥造成的副作用；如何增加靶向性，使得結(jié)構(gòu)在腫瘤部位形成有效聚集；如何通過不同的免疫佐劑修飾，誘發(fā)機體免疫應(yīng)答，進行免疫治療。事實上，大量的研究正在為上述問題的解決尋求積極途徑，例如DNA 納米結(jié)構(gòu)的成本和規(guī)模化制備一直是其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的瓶頸，利用傳統(tǒng)的固相合成法，成本將近180 元/mg，難以進行大規(guī)模合成。利用生物自身的合成體系構(gòu)建生物反應(yīng)器可能是解決這一問題的突破口。目前的研究已經(jīng)可以利用噬菌體和DNA 核酶完成結(jié)構(gòu)所需的長、短單鏈的生產(chǎn)和自組裝，可以將產(chǎn)量提升至克級甚至千克級，選擇活性更強的DNA 核酶則為效率提升指明了方向。而所有進步都將為DNA納米技術(shù)更好地服務(wù)于合成生物學提供助益，隨著DNA 納米技術(shù)結(jié)構(gòu)設(shè)計、功能優(yōu)化、規(guī)模生產(chǎn)等方面的不斷成熟，將有助于打破臨床應(yīng)用壁壘，形成新型產(chǎn)業(yè)化結(jié)構(gòu)。