張艷濤 陳 黎 朱一冰 王淑玲 茍小軍

1.上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院兒科，上海 201999；2.杭州師范大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，浙江杭州 310012

在過去的30 年里，肥胖已成為一種全球流行病。在中國，隨著社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，高熱量、高脂肪的食物在兒童飲食中越來越受歡迎，這些因素已成為兒童肥胖的主要原因。因此，在中國，兒童和青少年的超重和肥胖患病率迅速上升[1]。兒童和青少年的肥胖可能會持續(xù)到成年期，更有可能在年輕時患上糖尿病和心血管疾病等非傳染性疾病[2]。兒童肥胖雖然診斷已明確，但逆轉(zhuǎn)和治療仍十分困難，治療的特效藥物選擇范圍有限，其發(fā)病機制尚不完全清楚[3]。

代謝組學(xué)是一種高通量技術(shù)，目的是鑒定和研究在某些病理代謝反應(yīng)中形成的相關(guān)代謝產(chǎn)物，并了解疾病的分子機制[4]。代謝組學(xué)已成為人們普遍關(guān)注的研究領(lǐng)域，作為疾病的篩查、診斷、治療和預(yù)后的重要手段，得到了廣泛應(yīng)用[5]，例如應(yīng)用于臨床肝性腦病的診斷和治療[6]、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥的早期診斷[7]、阿爾茨海默病的診治[8]、2 型糖尿病的診治[9]。目前，肥胖兒童尿液的代謝表型如何改變，鮮有報道。因此，本研究擬收集其尿液，應(yīng)用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC/MS）技術(shù)研究學(xué)齡期肥胖兒童和健康對照兒童的尿液代謝譜，確定尿液代謝特征和相關(guān)的代謝途徑，闡明學(xué)齡期兒童肥胖發(fā)生的生理病理機制，為預(yù)防和早期診斷學(xué)齡期肥胖兒童提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

N，O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺[N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide][BSTFA+1%TMCS，購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：B0830]；尿素酶[購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，批號：SLBB0100V]；鹽酸甲氧胺[購自梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：M0343]。GC/MS聯(lián)用儀（7890A/5975C，Agilent Technologies）；氣相 毛細管色譜柱（HP-5MS，30 m×250 μm i.d.，0.25 μm，F(xiàn)olsom，CA，USA）。

1.2 研究對象

2018 年3 月至12 月，對上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（以下簡稱“我院”）衛(wèi)生保健科中體檢的學(xué)校名單采用隨機數(shù)字表進行編號，從中隨機選取上海市寶山區(qū)實驗小學(xué)、上海大學(xué)附屬實驗學(xué)校及寶山共富實驗學(xué)校3 所學(xué)校12～15 歲兒童的體檢資料，選出12～15 歲肥胖兒童作為肥胖組（25 名），同時選取一組年齡、性別匹配的正常兒童作為正常組（25 名）。正常組中男12 例，女13 例；平均年齡（13.92±1.09）歲；肥胖組中男15 例，女10 例；平均年齡（14.04±1.08）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞0.05），具有可比性。本研究得到我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準，監(jiān)護人簽署了知情同意書。

1.2.1 肥胖的判定 按照2004 年國際生命科學(xué)學(xué)會中國肥胖問題工作組確定的《中國學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查體重指數(shù)值分類標準》[10]判定。見表1。

表1 中國學(xué)齡兒童青少年超重、肥胖篩查BMI 分類標準（kg/m2）

1.2.2 納入與排除標準 納入標準：①年齡12～15 歲；②智力發(fā)展正常。排除標準：①病理性肥胖（繼發(fā)性肥胖）和其他疾病引起的肥胖綜合征；②有服用影響血糖、血脂和血壓的藥物史；③神經(jīng)系統(tǒng)疾病。

1.3 研究方法

1.3.1 尿液和血清樣本采集 樣本采集前1 d 20 點以后禁食，取晨尿10 ml，3000 r/min 離心（離心半徑13.5 cm）10 min，取上清液分為2 份，-70℃冰箱凍存，待檢測。另外，空腹抽取靜脈血5 ml，于4℃冰箱靜置1 h，3000 r/min 離心（離心半徑13.5 cm）10 min，取上清液分為2 份，-70℃冰箱凍存，用于生化檢測。

1.3.2 生化檢測方法 對照管加入生理鹽水0.1 ml 和混合血清0.4 ml，試驗管編號以后分別加入谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）、葡萄糖（glucose，GLU）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）檢測試劑0.1 ml 和混合血清0.4 ml。采用日立全自動生化儀測定空腹血清GPT、GLU、TG、HDL、LDL 含量。

1.3.3 尿液前處理方法和GC/MS 測試條件 尿液前處理方法和GC/MS 檢測條件，參考本課題組已經(jīng)發(fā)表的文章[11]。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 采用ChromaTOF 軟件對原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，導(dǎo)出三維數(shù)據(jù)矩陣，然后進行除噪音、歸一化等過程。將得到的三維矩陣導(dǎo)入SIMCA-P11.0 軟件中進行代謝譜及代謝物分析。另外，本研究對選擇的25 名肥胖兒童和25 名正常兒童測定了其中有差異的代謝物，并確定了這些代謝物診斷兒童肥胖的價值。采用SPSS 軟件對差異代謝物繪制受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC 曲線）并計算代謝物在曲線下面積（area under the curve，AUC）。ROC 曲線下的面積可簡單、直觀地分析診斷試驗的臨床準確性，AUC 越大，診斷準確性越高，提示該項檢驗的診斷效能越大。一般認為ROC 曲線的AUC＞0.5，具有一定的診斷價值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，比較采用t檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)表示，比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩組一般資料比較

與正常組比較，肥胖組體重、身高、BMI、GPT、TG、LDL 均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01 或P ＜0.05），HDL 顯著降低，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.01）。見圖1。

圖1 兩組一般資料比較

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果與分析

2.2.1 代謝譜分析 為了了解兩組尿液樣本代謝譜的大致區(qū)分情況，采用無監(jiān)督分析法-主成分分析法對兩組尿液代謝譜進行分析。圖2 顯示，兩組尿液樣本的代謝譜基本分離，有個別離群點。為了去除與樣品分類無關(guān)的信息，采用多維統(tǒng)計方法-偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriiminate，PLS-DA）對尿液全譜進行模式判別分析。圖3 顯示，兩組樣本代謝譜分離良好，各自聚集在一起，組內(nèi)的分散度減小，并且該模型具有很高的解釋率和預(yù)測率（R2Y=0.99，Q2Y=0.95）。為了檢驗該模型是否存在過度擬合，重復(fù)性和可靠性是否良好，確保數(shù)據(jù)模型的可靠性，本研究進行了排序?qū)嶒?。圖4 顯示，R2和Q2的截距分別為0.55 和-0.064，Q2的截距為負值，模型有效。以上結(jié)果提示，該模型具有較高的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

圖2 肥胖組和正常組尿液主成分分析法得分圖

圖3 肥胖組和正常組尿液偏最小二乘法判別分析得分圖

圖4 100 次排序?qū)嶒灲Y(jié)果

基于PLS-DA 模型，依據(jù)權(quán)重系數(shù)VIP＞1（圖5），兩組變量間行t 檢驗，P ＜0.05，獲得差異性代謝物。利用NIST 數(shù)據(jù)庫和標準品數(shù)據(jù)庫（Wiley Registry）進行代謝物鑒定，鑒定了38 個代謝物，并考察了代謝物相對濃度的變化趨勢，見表2。

表2 肥胖組和正常組尿液間的差異代謝物

圖5 肥胖組和正常組尿液代謝V-Plot 圖

2.2.2 生物標志物的篩選 38 個代謝物ROC 曲線下面積計算結(jié)果顯示，18 個代謝物包括纈氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸鹽、異亮氨酸、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸、尿烷酸ROC 曲線下面積均＞0.5，而且P ＜0.05，可作為早期預(yù)測兒童肥胖的重要指標。見圖6、表3。

表3 尿液代謝物預(yù)測兒童肥胖的ROC 曲線分析結(jié)果

圖6 受試者操作特征工作曲線

2.2.3 代謝通路分析 將纈氨酸、草酸、苯乙胺、枯酸、甘油、磷酸鹽、異亮氨酸、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、肌酸、酪氨酸、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸、尿烷酸導(dǎo)入在線系統(tǒng)—MetaboAnalyst 中進行代謝通路分析。將閾值設(shè)置為0.10[12]，高于0.10，認為該代謝通路是潛在的代謝通路。本研究有5 種潛在的代謝通路包括（a）苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；（b）苯丙氨酸代謝；（c）甘油脂代謝；（d）酪氨酸代謝；（e）組氨酸代謝。見圖7。

圖7 MetPA 軟件鑒定的代謝通路分析圖

3 討論

本研究基于GC/MS 代謝組學(xué)技術(shù)，建立了肥胖組與正常組尿液代謝譜分析模型，證實了學(xué)齡期肥胖兒童具有的尿液代謝特征，鑒定出纈氨酸、草酸、苯乙胺等18 個代謝物，可作為診斷學(xué)齡期兒童肥胖的尿液中的潛在標志物?；贛etaboAnalyst 進行了代謝通路分析，學(xué)齡期肥胖兒童尿液中有5 種紊亂的代謝通路包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；苯丙氨酸代謝；甘油脂代謝；酪氨酸代謝；組氨酸代謝。

本研究發(fā)現(xiàn)纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸在肥胖組尿液中顯著升高，尤其纈氨酸相對濃度增加非常顯著。纈氨酸和異亮氨酸屬于支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAAs），BCAAs 可以促進葡萄糖的攝取和骨骼肌蛋白質(zhì)的合成，還可以被氧化以提供機體的能量[13]。此外，BCAAs與胰島素抵抗（insulin resis tance，IR）之間有著密切的關(guān)系，BCAAs 水平的升高可能會導(dǎo)致IR[14]。與肥胖相關(guān)的BCAAs 濃度升高的病因尚不完全清楚，一種可能性是肥胖患者飲食中的BCAAs 含量較高，引起IR，相反，IR 可能導(dǎo)致胰島素抑制BCAAs 水平的生理功能喪失[15]。營養(yǎng)過剩會增加BCAAs 的濃度，影響胰島素敏感性和分泌，肥胖與兒童和青少年BCAAs 濃度升高有關(guān)，BCAAs 分解代謝增加可能是生命早期出現(xiàn)的營養(yǎng)過剩的后果之一，可能導(dǎo)致胰島素作用的改變[15]。酪氨酸是蛋白質(zhì)的組成部分，也是細胞功能的替代能源。肝臟是酪氨酸降解發(fā)生的主要器官，可產(chǎn)生糖異生和生酮的中間體或前體，酪氨酸代謝紊亂與多種疾病有關(guān)[16]。肝脂質(zhì)代謝失調(diào)是導(dǎo)致IR 的危險因素，酪氨酸水平與空腹胰島素相關(guān)，酪氨酸也與肝臟的脂肪蓄積有關(guān)[17]。本研究中肥胖兒童TG 和LDL 均較正常兒童顯著升高，也驗證了這一點，提示學(xué)齡期肥胖兒童患者具有更明顯的脂代謝紊亂，可能與IR 有關(guān)。

本研究代謝組學(xué)顯示參與苯丙氨酸代謝的物質(zhì)苯乙胺，在肥胖組中顯著升高。苯乙胺是一種內(nèi)源性天然單胺生物堿，具有刺激作用，可導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)（多巴胺和5-羥色胺）的釋放。苯乙胺與胺相關(guān)受體結(jié)合，從而抑制多巴胺、5-羥色胺和去甲腎上腺素的再攝取[18]。肥胖癥是由能量消耗和能量攝入之間的失衡引起，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的激素、肽和神經(jīng)遞質(zhì)在肥胖中具有潛在的作用，其通過傳入和傳出信號調(diào)節(jié)能量攝入和消耗。許多中樞作用神經(jīng)遞質(zhì)通過調(diào)節(jié)食物攝入和/或能量消耗而參與能量穩(wěn)態(tài)。例如參與調(diào)節(jié)食物攝入量和能量消耗的神經(jīng)遞質(zhì)——5-羥色胺，存在于特定的弓形促黑素皮質(zhì)素神經(jīng)元中，這些弓形促黑素皮質(zhì)素血清素受體通過改變進食行為來調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)[19]。學(xué)齡期肥胖兒童尿液中苯乙胺升高提示其食物攝入和能量消耗失衡，這些表現(xiàn)可能與神經(jīng)遞質(zhì)的代謝異常有潛在聯(lián)系。

本研究中學(xué)齡期肥胖兒童尿液中甘油的含量顯著增加，提示患者體內(nèi)存在脂質(zhì)代謝的紊亂。甘油參與了甘油脂代謝，而甘油脂代謝屬于脂質(zhì)代謝。肥胖是以脂肪組織異常沉積和脂質(zhì)代謝紊亂為特征的代謝性疾病。脂肪組織可以合成和分泌多種脂肪細胞因子，并調(diào)節(jié)葡萄糖和脂質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，脂肪細胞因子分泌紊亂是導(dǎo)致肥胖人群IR 的重要病理環(huán)節(jié)[20-21]。據(jù)報道，給予肥胖兒童運動和飲食綜合干預(yù)可以改善其脂質(zhì)代謝，增加保護性脂肪細胞因子的分泌，抑制有害的脂肪細胞因子的分泌，并提高其胰島素的敏感性[22]。

兒童肥胖是全球最具挑戰(zhàn)性的公共衛(wèi)生問題之一，兒童肥胖除了增加傳統(tǒng)的心臟代謝危險因素外，還會嚴重阻礙腎臟功能[23]。小兒肥胖患者的高尿酸血癥與代謝受損呈正相關(guān)[24]。尿酸是嘌呤氧化代謝分解的終產(chǎn)物，最終在腎臟排泄[25]。高尿酸血癥與多種疾病相關(guān)，肥胖是高尿酸血癥的重要危險因素，高尿酸血癥的發(fā)生率在肥胖人群中較高，原因可能是肥胖體質(zhì)攝入過多的熱量，為嘌呤合成提供了足夠的能量并增加了尿酸的合成[26]。本研究中肥胖兒童尿液中尿酸的濃度顯著增加，可能與患者的肥胖體質(zhì)有關(guān)。肌酸水平的上調(diào)也可能與體內(nèi)腎小球濾過率的降低相關(guān)。另外，本研究發(fā)現(xiàn)草酸、枯酸、磷酸鹽、蘇糖酸、胡椒酸、胸腺嘧啶、鄰苯二酚、景天庚酮糖、甘露醇、粘液酸、煙酸等代謝物變化顯著，這些物質(zhì)的生物學(xué)內(nèi)涵文獻報道較少，今后，還需要進一步的研究。

總之，本研究采用GC/MS 技術(shù)對學(xué)齡期肥胖兒童和正常兒童的尿液進行檢測，結(jié)合模式識別分析了學(xué)齡期肥胖兒童尿液的代謝特征，篩選出了纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸等多種與學(xué)齡期兒童肥胖相關(guān)的潛在生物標志物。學(xué)齡期兒童肥胖的發(fā)生機制可能與苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，苯丙氨酸代謝，甘油脂代謝，酪氨酸代謝，組氨酸代謝等代謝異常有關(guān)。