牛晨霞，王 豪，農(nóng)作榮，全東群，曾 悅，任同偉，王玉旭，王景隆，劉 暢，陳 櫻，歐陽(yáng)康，黃偉堅(jiān)，韋祖樟

（廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 動(dòng)物傳染病與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530005）

A型塞內(nèi)卡病毒（Senecavirus A, SVA）是一種無(wú)包膜、單股正鏈RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）塞內(nèi)卡病毒屬，與心病毒屬（Cardiovirus）最接近。SVA是一種新發(fā)的傳染性病原體，可引起豬原發(fā)性皰疹?。?SIVD）和流行性短暫性新生兒死亡。塞內(nèi)卡病毒最早于2002年發(fā)現(xiàn)于人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞系（PER.C6）的細(xì)胞培養(yǎng)污染物中[1]，早期的SVV-001表現(xiàn)出對(duì)具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的腫瘤細(xì)胞的快速、有效和選擇性殺傷，對(duì)正常細(xì)胞缺乏毒性，可有效治療具有神經(jīng)內(nèi)分泌特性的轉(zhuǎn)移性腫瘤，例如小細(xì)胞肺癌和許多類(lèi)型的小兒實(shí)體癌[2-3]。早期分離的SVA原型毒株對(duì)豬并無(wú)明顯的致病性，但在2007年加拿大運(yùn)往美國(guó)的發(fā)生豬水皰病的豬中，以及2012年美國(guó)印第安納州報(bào)道的引起6月齡豬群出現(xiàn)相關(guān)豬水皰癥狀的豬中檢測(cè)到SVA，進(jìn)而推測(cè)SVA感染可能與水皰性疾病相關(guān)[4]。2015年，美國(guó)多個(gè)州暴發(fā)豬水皰性疾病，新生仔豬死亡率達(dá)30%～70%，通過(guò)動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)，證明了易感豬中SVA感染與水皰病之間存在因果關(guān)系[5]。截至目前，加拿大、美國(guó)、巴西[6]、泰國(guó)[7]、中國(guó)[8]、哥倫比亞[9]、越南[10]等多個(gè)國(guó)家均暴發(fā)了SVA疫情，且流行范圍正在不斷擴(kuò)大。2015年我國(guó)廣東[11]地區(qū)首次報(bào)道了SVA疫情，隨后湖北省[12]、黑龍江省[13]、河南省和福建省[14]等省的患病豬場(chǎng)相繼檢出SVA，說(shuō)明SVA在我國(guó)豬場(chǎng)中呈逐漸流行趨勢(shì)。

SVA所致臨床癥狀與口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus, FMDV）、豬水皰病病毒（Swine vesicular disease virus, SVDV）、水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus, VSV）等疾病在臨床上難以區(qū)分。可根據(jù)臨床癥狀進(jìn)行初步診斷，確診還需要實(shí)驗(yàn)室的進(jìn)一步檢測(cè)診斷。目前已經(jīng)用于診斷SVA的實(shí)驗(yàn)室方法包括病毒分離、病毒中和試驗(yàn)、競(jìng)爭(zhēng)ELISA、常規(guī)RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光RT-PCR（rRT-PCR）等方法[15-16]。

2018年1月，廣西某規(guī)?；i場(chǎng)豬只發(fā)生水皰性疾病，母豬發(fā)燒、厭食、口鼻及蹄部出現(xiàn)水皰癥狀，并伴有產(chǎn)房仔豬猝死，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒、豬水皰病病毒等常見(jiàn)病原均為陰性，而SVA RNA檢測(cè)為陽(yáng)性。本研究從發(fā)病豬群采集的水泡液病料中分離得到了SVA，采用RT-PCR擴(kuò)增、基因序列測(cè)定、TCID50和間接免疫熒光等方法對(duì)其進(jìn)行了鑒定。本研究為SVA在廣西地區(qū)的流行病學(xué)、診斷方法研究、疫苗的開(kāi)發(fā)和綜合防控奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 病料與細(xì)胞：臨床病料樣品為2018年1月采自廣西某豬場(chǎng)疑似SVA感染的妊娠母豬和育肥豬的水泡液；豬腎細(xì)胞系（PK-15）由廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動(dòng)物傳染病室保存。高糖 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自賽默飛世爾有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒、DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；pMD-18T、DL2000 DNA marker 購(gòu)自大連TaKaRa公司；Prep體液病毒DNA / RNA Mini Prep Kit購(gòu)自百賽生物有限公司。

1.2 病毒的RT-PCR鑒定 取收集的病料樣品水泡液按照試劑說(shuō)明書(shū)步驟提取病毒核酸，參考楊彩娟等[17]設(shè)計(jì)1對(duì)檢測(cè)引物（SVV-2682-F：5′-TTCCACTCCACCGACAACG-3′；SVV-3224-R：5′-GATACCTTCCCACCCTTGC-3′）擴(kuò)增SVA基因組約542 bp。PCR反應(yīng)體系（25μL）為：Taq DNA聚合酶12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板3 μL，ddH2O 7.5 μL。同時(shí)，采用RT-PCR方法以同樣的反應(yīng)體系檢測(cè)FMDV[18]、SVDV[18]、VSV[19]和VESV[20]，并設(shè)置陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，共32個(gè)循環(huán)。RT-PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 病毒的分離及傳代培養(yǎng) 將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的病料樣品水泡液以適量的無(wú)菌PBS稀釋并離心去除沉淀物，取上清液，以0.22 μm的濾器過(guò)濾除菌后接種于長(zhǎng)勢(shì)良好的PK-15細(xì)胞，在37℃、5%CO2的條件下孵育1 h，棄上清液，加入含2%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，放置37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變。待70%細(xì)胞發(fā)生病變后收取上清液，將收取的上清液接種于新的PK-15細(xì)胞，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照組（即未接毒的正常細(xì)胞）每日觀察細(xì)胞病變。依照上述方法進(jìn)行盲傳及觀察。

1.4 病毒基因組的擴(kuò)增及序列測(cè)定 與其他小RNA病毒科成員相似，SVA基因組只有一個(gè)開(kāi)放性閱讀框，編碼一個(gè)多聚蛋白，并在蛋白酶作用下裂解成多個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，其中VP1是病毒主要的抗原蛋白，也被認(rèn)為是小RNA病毒科免疫原性最強(qiáng)的蛋白。為了研究本實(shí)驗(yàn)所得到的分離株VP1的特點(diǎn)，對(duì)連續(xù)盲傳的各代次的細(xì)胞培養(yǎng)液抽取總RNA，采用RT-PCR方法檢測(cè)SVA。根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的SVV-001（DQ641257）全基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（SVA-VP1-F：5′-cagGTATA Ctccaccgacaacgctgagac-3′；SVA-VP1-R：5′-ctgCC TGCAGGttgcatcagcatcttttgcttg-3′）用于擴(kuò)增VP1段，獲得預(yù)期大小約為 812 bp的片段。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物克隆至pMD-18T載體后送北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 遺傳進(jìn)化分析 將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST搜索比對(duì)，與從GenBank中整理的VP1基因序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，應(yīng)用MEGA 5.10軟件進(jìn)行VP1的系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰位相接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，并以Bootstrap值（1000）來(lái)評(píng)估進(jìn)化樹(shù)的可靠性。

1.6 病毒的TCID50測(cè)定 在重組病毒TCID50測(cè)定前從液氮中復(fù)蘇PK-15細(xì)胞于T75細(xì)胞瓶中，待T75細(xì)胞瓶中細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，將細(xì)胞均勻的傳代于96孔細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)時(shí)，棄掉原有的10% FBS DMEM培養(yǎng)基，使用PBS輕輕洗滌3次，使用2%FBS DMEM對(duì)SVAGX02的P4代次病毒液進(jìn)行連續(xù)倍比稀釋?zhuān)?0-1～10-8），將稀釋好的病毒依次加入96孔板中，每孔100 μL，每個(gè)稀釋梯度設(shè)置8個(gè)重復(fù)，在陰性對(duì)照孔中加入2% FBS DMEM后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察并記錄出現(xiàn)細(xì)胞病變的孔，連續(xù)觀察數(shù)天直至不再有新的細(xì)胞病變出現(xiàn)，最后統(tǒng)計(jì)每個(gè)稀釋梯度出現(xiàn)病變的孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算出病毒的TCID50。

1.7 間接免疫熒光試驗(yàn)（immunological fluorescence assay, IFA） 將BHK-21細(xì)胞傳代至6孔板中，待BHK-21細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，棄去6孔板的培養(yǎng)基，使用PBS將6孔板輕輕洗滌3次，將SVAGX02的P4代上清液50倍稀釋后，取300 μL稀釋后的細(xì)胞上清液接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，每12 h觀察一次細(xì)胞病變，待6孔板的細(xì)胞出現(xiàn)典型細(xì)胞病變時(shí)，收集細(xì)胞上清液保存于-80℃，使用PBS輕輕洗滌6孔板3次，之后在每個(gè)細(xì)胞孔中加入1 mL冰甲醇，將6孔板放置于-20℃ 10 min或4℃ 30 min以固定細(xì)胞。固定完成后，棄去6孔板中冰甲醇，使用PBS磷酸緩沖液輕輕洗滌3次，每孔加入500 μL已配制完成的1.0% BSA，放置于室溫中孵育30 min。之后用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入兔源多克隆抗體（1∶500稀釋?zhuān)瑢?shí)驗(yàn)室制備）作為一抗，37℃孵育2 h，以FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG作為為二抗37℃孵育0.5 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下進(jìn)行間接免疫熒光檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 SVA病料樣品的RT-PCR鑒定 從病料樣品的囊泡液中提取病毒核酸，采用RT-PCR方法，利用檢測(cè)引物SVV-2682-F/ SVV-3224-R擴(kuò)增片段約為542 bp，大小與預(yù)期相符（圖1），而其他水皰病原及陰性對(duì)照未見(jiàn)到擴(kuò)增條帶。

圖1 RT-PCR 檢測(cè)病料樣品中的SVAFig.1 Detection of SVA in tissue sample by RT-PCR

2.2 SVA的分離及傳代培養(yǎng) 將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病料樣品囊泡液過(guò)濾除菌后接種PK-15細(xì)胞，盲傳至第6代，培養(yǎng)48 h后開(kāi)始出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，表現(xiàn)為細(xì)胞變圓，細(xì)胞面粗糙，死細(xì)胞浮在表面，而對(duì)照組細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，未出現(xiàn)任何病變（圖2）。

圖2 分離株感染PK-15細(xì)胞的細(xì)胞病變Fig.2 Cytopathic effect of PK-15 cells infected with SVAGX02 isolate

2.3 SVA VP1基因組的擴(kuò)增及測(cè)定分析 從盲傳的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取病毒RNA，采用 RT-PCR方法，利用特異性引物SVA-VP1-F/SVA-VP1-R擴(kuò)增片段約812 bp的目的片段（圖3）。

圖3 RT-PCR 擴(kuò)增細(xì)胞培養(yǎng)液中的SVA VP1基因Fig.3 Detection of SVA VP1 gene in cell culture fluid by RT-PCR

將PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)入pMD-18T載體后送華大基因測(cè)序，得到VP1基因測(cè)序結(jié)果（792 bp）。將測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行BLAST搜索，得到與其高度相似的其他SVA VP1序列。將測(cè)序結(jié)果與從GenBank中整理的35條基因序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從進(jìn)化樹(shù)可看出，分離株與傳統(tǒng)毒株SVV-001距離最遠(yuǎn)，處于兩個(gè)完全不同的分組，而與2017年廣東分離株處于較近的分支。因此，推測(cè)本研究所得分離株可能是由廣東分離株演變而來(lái)，也進(jìn)一步說(shuō)明了導(dǎo)致各地暴發(fā)水泡疫情的SVA在不斷地演變。

2.4 病毒的TCID50檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)Reed-Muench法及病毒液在PK-15細(xì)胞的病變情況，計(jì)算病毒液的TCID50，得到SVAGX02 P4代次的TCID50為10-6.75/mL，說(shuō)明病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制良好。

圖4 SVAGX02 的 VP1 基因核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on SVA VP1 gene

圖5 SVAGX02間接免疫熒光鑒定結(jié)果Fig.5 IFA identification of SVAGX02 strain infected BHK-21 cells

2.5 間接免疫熒光鑒定結(jié)果（IFA） 將P4代次SVAGX02的病毒液接種BHK-21細(xì)胞，用實(shí)驗(yàn)室制備的多克隆抗體和FITC山羊抗兔IgG二抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)。結(jié)果顯示接種P4代次細(xì)胞培養(yǎng)物的BHK-21細(xì)胞出現(xiàn)明顯的綠色特異性熒光，而對(duì)照組正常的BHK-21細(xì)胞在熒光顯微鏡下未觀察到熒光。

3 討論

自20世紀(jì)80年代起，塞內(nèi)卡病毒一直在美國(guó)的豬群中流行，直到2007年SVV被證實(shí)是加拿大運(yùn)往美國(guó)的豬發(fā)生豬原發(fā)性水皰病的致病病原引起，以及2012年美國(guó)印第安納州報(bào)道的引起6月齡豬群出現(xiàn)相關(guān)豬水皰癥狀的病原，自此，SVA引起廣泛的關(guān)注。SVA潛伏期為4～5 d，發(fā)病率和死亡率受豬群年齡、來(lái)源和地理分布等因素影響存在一定的差異。本病發(fā)生無(wú)明顯的季節(jié)性，但春秋兩季發(fā)病率偏高。目前尚無(wú)感染了SVA的豬場(chǎng)再次暴發(fā)豬水皰病的報(bào)道。在傳播媒介上，據(jù)Joshi等[21]的調(diào)查，鼠、蒼蠅等均檢測(cè)到了SVA，其可能在SVA傳播中起重要作用。目前，SVA感染已在廣東省、湖北省、福建省、河南省、黑龍江省和廣西壯族自治區(qū)出現(xiàn)，所造成的經(jīng)濟(jì)危害并不十分嚴(yán)重，但是隨著時(shí)間的推移，不排除其在我國(guó)豬群中呈流行趨勢(shì)，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)較大損害的可能。從本研究中的VP1基因的分析結(jié)果可以看出，分離得到的SVA毒株與已報(bào)道的2017年從廣東省分離的SVA毒株處于較近的進(jìn)化分支，這表明相近的時(shí)間點(diǎn)和較近地理位置在SVA株的流行上具有一定的相關(guān)性。本研究中SVA的成功分離和鑒定對(duì)廣西壯族自治區(qū)地區(qū)流行病學(xué)研究、診斷試劑開(kāi)發(fā)和疫苗研制具有重要的意義。