曹維偉，魏中鋒，李 嬌，劉 博，王文秀

（1.壽光市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局畜牧業(yè)發(fā)展中心，壽光 262700；2.山東省菏澤市動物疫病預(yù)防控制中心，菏澤 274000；3.山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600；4.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，濱州 256600）

鴨病毒性肝炎（duck viral hepatitis, DVH）是雛鴨的一種急性、致死性傳染病，傳播迅速，一周齡以內(nèi)的雛鴨非常易感，死前呈“角弓反張”姿勢，病死雛鴨剖檢主要表現(xiàn)為肝臟病變和出血，是當(dāng)前危害全球養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一[1-4]。DVH的致病源主要有鴨甲肝病毒（Duck hepatitis A virus, DHAV）、鴨星狀病毒1型（Duck astrovirus 1, DAstV-1）和鴨星狀病毒2型（Duck astrovirus 2,DAstV-2），其中以鴨甲肝病毒的感染最為普遍，危害也最為嚴(yán)重[5-7]。DHAV為小RNA病毒科禽肝病毒屬成員，病毒基因組為單股正鏈RNA病毒，具有三種血清型（Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型）和三種基因型（A型、B型和C型），血清Ⅰ型（傳統(tǒng)Ⅰ型）、血清Ⅱ型（臺灣新型）和血清Ⅲ型（韓國新型）分別對應(yīng)基因A型、基因B型和基因C型，目前我國主要流行DHAV-A和DHAV-C，我國內(nèi)陸地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)DHAV-B的流行[8-10]。山東壽光地區(qū)因具有飼料來源豐厚、飼養(yǎng)傳統(tǒng)良好、氣候適宜等優(yōu)勢，肉鴨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)一直比較發(fā)達(dá)，但近年來隨著壽光地區(qū)肉鴨養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的規(guī)?；焖侔l(fā)展，鴨苗異地流通加劇，DHAV的發(fā)生率逐步提高，DHAV的流行已嚴(yán)重阻礙壽光養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。本研究對2019-2021年采集于山東壽光地區(qū)規(guī)模化鴨場疑似DHAV感染的臨床病料樣品進(jìn)行了RT-PCR檢測、病毒分離鑒定及VP1基因序列分析，闡明了壽光地區(qū)DHAV的感染和流行情況，為我國DHAV的綜合防控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物 無DHAV母源抗體的10日齡鴨胚、1日齡健康櫻桃谷鴨，均購自壽光天輝種禽場。

1.2 主要試劑與疫苗 病毒基因組RNA提取試劑盒購自北京百泰克生物科技有限公司；一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒、DL-2000 DNA marker、pMD18-T載體均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料樣品的采集與處理 于2019-2021年采集于山東壽光地區(qū)規(guī)?；唸鲆伤苹加蠨HAV感染的雛鴨病料樣品共計(jì)8份，8份臨床病例的雛鴨發(fā)病日齡均在3～21日齡，剖檢病死雛鴨可見肝臟均有點(diǎn)狀出血，取病死雛鴨的肝臟樣品按1∶5比例加入滅菌生理鹽水研磨處理，研磨后的組織勻漿經(jīng)12 000 ×g離心15 min，吸取上清液用于PCR檢測和病毒分離。

1.4 臨床病料的RT-PCR檢測

1.4.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)DHAV-A和DHAV-C的雙重RT-PCR鑒別檢測引物（表1），引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

表1 本研究使用引物Table 1 Primers used in this study

1.4.2 一步法RT-PCR檢測 按照病毒基因組RNA提取試劑盒的使用說明書依次提取8份病料樣品的基因組RNA，按照參考文獻(xiàn)[11]中的一步法RT-PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

1.5 病毒分離 將PCR擴(kuò)增為陽性的組織病料樣品進(jìn)行病毒分離，取離心后的臨床病料樣品上清液2.0 mL，用0.45 μm濾器過濾除菌，每份組織病料樣品接種10日齡鴨胚10枚，0.1 mL/胚，接種后24 h內(nèi)的死亡鴨胚棄去，觀察至120 h，死胚隨時放置4℃冰箱冷藏保存，120 h后收集所有死亡鴨胚尿囊液，并觀察鴨胚的病變情況。用上述同樣的試驗(yàn)方法在鴨胚上連續(xù)傳三代。

1.6 分離毒株病毒含量測定 取分離毒株的第三代鴨胚尿囊液，利用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，每一個稀釋度接種5枚10日齡鴨胚，0.1 mL/胚，孵育觀察至接種后144 h，記錄各稀釋度鴨胚死亡情況，按照Reed-Mench方法計(jì)算分離毒株對鴨胚的半數(shù)致死量（embryo median lethal dose, ELD50）。

1.7 分離毒株致病性試驗(yàn) 將50只1日齡健康櫻桃谷鴨隨機(jī)分為5組，每組10只雛鴨，試驗(yàn)1組～4組分別接種分離毒株0.1 mL（含100 ELD50）；試驗(yàn)5組為對照組，接種滅菌生理鹽水0.1 mL。接種后觀察14 d，記錄各組雛鴨的發(fā)病和死亡情況。

1.8 分離毒株VP1基因序列分析

1.8.1 VP1基因引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)DHAV-C VP1基因序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含整個VP1基因的特異性引物（VP1F3：5'-GGTGATTCCAATCAGC-3'，VP1R3：5'-TTCAATTTCCAAATGG-3'），預(yù)期擴(kuò)增片段大小為720 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

1.8.2 VP1基因PCR擴(kuò)增 分別提取分離毒株的病毒基因組RNA，利用一步法RT-PCR試劑盒擴(kuò)增VP1基因，一步RT-PCR反應(yīng)體系為：2×Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，酶0.5 μL，RNA 4 μL，總體系補(bǔ)充至25 μL。一步RT-PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 40 min；95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。RT-PCR擴(kuò)增結(jié)束后回收VP1基因片段，連接到pMD-18T載體上，送寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測序鑒定。

1.8.3 VP1基因遺傳進(jìn)化樹分析 從GenBank網(wǎng)站下載部分DHAV-C毒株序列，利用DNAStar生物學(xué)軟件將擴(kuò)增的VP1基因序列與GenBank中登錄的幾株DHAV-C基因序列分別進(jìn)行核苷酸同源性比較分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 臨床病料的RT-PCR檢測結(jié)果 如圖1所示，8份臨床病料樣品經(jīng)DHAV-A和DHAV-C雙重一步法RT-PCR檢測，共擴(kuò)增DHAV-C陽性病料4份，未擴(kuò)增出DHAV-A陽性病料。

圖1 臨床病料的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RT-PCR amplification results of clinical materials

2.2 病毒分離結(jié)果 4份DHAV-C陽性病料樣品接種10日齡鴨胚后均出現(xiàn)規(guī)律性死亡，死亡時間集中在接種后48～72 h，剖檢死亡鴨胚可見胚體出血，鴨胚肝臟表面有點(diǎn)狀出血點(diǎn)。依次無菌收集第三代鴨胚尿囊液，分別命名為SG1、SG2、SG3、SG4。

2.3 分離毒株病毒含量測定結(jié)果 按Reed-Muench法測定SG1、SG2、SG3、SG4分離毒株對鴨胚的ELD50分別為10-6.83/0.1 mL、10-6.50/0.1 mL、10-6.32/0.1 mL、10-6.83/0.1 mL。

2.4 分離毒株致病性試驗(yàn)結(jié)果 各處理組的雛鴨發(fā)病和死亡情況如表2所示，4株分離毒株攻擊的試驗(yàn)雛鴨在攻毒后24 h開始出現(xiàn)精神萎靡不振、嗜睡等臨床表現(xiàn)，隨后陸續(xù)開始出現(xiàn)死亡，死亡主要發(fā)生在攻毒后48～96 h，死亡的雛鴨呈現(xiàn)“角弓反張”姿勢，剖檢死亡雛鴨可見肝臟出血明顯。至攻毒后168 h，未死亡的發(fā)病雛鴨精神狀態(tài)逐步開始恢復(fù)，但生長緩慢。SG1、SG2、SG3、SG4分離毒株攻擊雛鴨的死亡率分別為70%、70%、60%、80%。表明SG1、SG2、SG3、SG4分離毒株均為高致病性毒株，以SG4分離毒株對雛鴨的致病性最強(qiáng)。

表2 試驗(yàn)雛鴨發(fā)病和死亡情況Table 2 Morbidity and mortality of experimental ducklings

2.5 分離毒株VP1基因序列分析結(jié)果 如圖2所示，SG1、SG2、SG3、SG4分離毒株的VP1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在720 bp處均有特異性擴(kuò)增條帶，片段大小均與試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。根據(jù)SG1、SG2、SG3、SG4毒株的VP1基因測序結(jié)果，結(jié)合GenBank中登錄的部分DHAV-CVP1基因序列，利用DNAStar生物學(xué)軟件進(jìn)行核苷酸同源性比較和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果可知，SG1、SG2、SG3、SG4分離毒株與GenBank中登錄的DHAV-C核苷酸同源性為91.9%～99.6%，與序列號為KC191693.1、GQ485311、KC191690.1、KC191694.1、EU877916的DHAV親緣關(guān)系較近，處于進(jìn)化樹的同一個分支（圖3、圖4）。

圖2 分離毒株VP1基因的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 RT-PCR amplification results of VP1 gene of isolated strain

圖3 分離毒株VP1基因核苷酸同源性比較Fig.3 Comparison of nucleotide homology of VP1 gene of isolated strains

圖4 分離毒株VP1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.4 phylogenetic tree analysis of VP1 gene of isolated strain

3 討論

DHAV在我國養(yǎng)鴨密集地區(qū)的發(fā)生與流行給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，DHAV已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅養(yǎng)鴨業(yè)的重要病毒性傳染病，加強(qiáng)DHAV的流行病學(xué)監(jiān)測和提高綜合防控能力已迫在眉睫。2012年之前我國DHAV的主要流行基因型為基因A型，近年來隨著DHAV-A疫苗和卵黃抗體的大面積推廣應(yīng)用，DHAV-A的流行逐步得到了控制，發(fā)病率逐步降低。但由于DHAV的各基因型之間無交叉保護(hù)作用，臨床中推廣應(yīng)用DHAV-A疫苗和卵黃抗體無法抵抗DHAV-C的感染，導(dǎo)致近年來DHAV-C的發(fā)病率逐步增加，陳琳琳等[12]采用PCR方法對采集于四川省、河南省、山東省、廣東省等地區(qū)26個鴨群的60份疑似DHAV感染病料樣本進(jìn)行了DHAV-A和DHAV-C的病原學(xué)檢測，表明基因C型陽性感染率為30%，基因A型陽性感染率僅為18.3%，四川省、河南省、山東省、廣東省等地區(qū)26個鴨群中以基因C型為主要流行基因型。本研究采用RT-PCR方法對2019-2021年采集于山東壽光地區(qū)規(guī)?；唸鲆伤苹加蠨HAV感染的8份雛鴨病料樣品進(jìn)行了DHAV-A和DHAV-C的病原學(xué)檢測，共檢出陽性病料4份，其全部為基因C型，說明DHAV-C是山東壽光地區(qū)的主要流行基因型，與陳琳琳等[12]的研究結(jié)果表現(xiàn)出了一致性。以上流行病學(xué)監(jiān)測表明，基因C型已經(jīng)替代基因A型成為我國DHAV流行的優(yōu)勢基因型，當(dāng)前以基因A型為主的DHAV綜合防控措施已不能滿足臨床疫病的防控需要，應(yīng)加強(qiáng)以基因C型為主的DHAV綜合防控措施。

DHAV的全基因組包含5'UTR、3'UTR、一個開放閱讀（open reading frame, ORF）和poly（A）尾巴四部分，其中VP1蛋白是ORF酶解產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)蛋白，是小RNA病毒的核衣殼蛋白，位于核衣殼蛋白的外部，含有B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位，具有多種優(yōu)勢抗原表位，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，是最主要的免疫原性蛋白，VP1基因的突變會導(dǎo)致病毒抗原性的變化，導(dǎo)致病毒發(fā)生免疫逃逸，產(chǎn)生新的流行毒株，VP1基因變異規(guī)律被廣泛認(rèn)為是研究DHAV遺傳變異的重要依據(jù)[13-15]。通過對VP1基因進(jìn)行遺傳變異分析，可以掌握分離毒株的流行規(guī)律，為制定DHAV的綜合防控措施提供科學(xué)依據(jù)，鑒于此，本研究利用VP1基因序列分析對分離到的4株分離毒株進(jìn)行了分子水平上的鑒定，結(jié)果表明4分離毒株與GenBank中登錄的DHAV-C的核苷酸同源性為91.9%～99.6%，與近幾年國內(nèi)流行的DHAV-C親緣關(guān)系較近，從分子水平上證明4株分離毒株均為DHAV-C。所以，應(yīng)定期進(jìn)行DHAV的分離鑒定及基因序列分析，了解DHAV流行毒株的變異情況，做好DHAV的流行病學(xué)監(jiān)測，防止?jié)撛诘倪z傳變異導(dǎo)致病毒逃逸而引發(fā)疫病的暴發(fā)和流行[4]，為指導(dǎo)臨床生產(chǎn)及疾病防控提供參考從而加強(qiáng)DHAV的綜合防控。

本研究通過對臨床疑似病例的RT-PCR檢測和病毒分離鑒定，成功分離到4株DHAV-C，4株分離毒株與GenBank中登錄的DHAV-C VP1基因核苷酸同源性為91.9%～99.6%，與近幾年國內(nèi)流行的DHAV-C親緣關(guān)系較近，為我國DHAV的綜合防控措施的制定提供了參考依據(jù)。