張 悅 ，艾偉誠(chéng) ，王 斐 ，梁 婉 ，謝思思 ，華 琳 ，李春輝 ，彭 忠 ，吳 斌

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 生豬健康養(yǎng)殖協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；2. 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院感染與控制中心，長(zhǎng)沙 410008）

艱難梭菌（Clostridioides difficile，也被稱作Clostridium difficile）是一種革蘭氏陽(yáng)性、厭氧、產(chǎn)芽孢桿菌，也可感染人和多種動(dòng)物，引起多種腸道疾病，如腹瀉、偽膜性腸炎、巨型結(jié)腸等[1]。毒素是艱難梭菌的主要毒力因子，艱難梭菌可分泌產(chǎn)生兩種大分子毒素，即毒素A和毒素B，分別由tcdA和tcdB基因編碼[2]。此外，在臨床上還發(fā)現(xiàn)有部分分離株（≤20%）可以編碼產(chǎn)生第三種毒素，即二元毒素（binary toxin, CDT）[3]。盡管臨床數(shù)據(jù)顯示能編碼產(chǎn)生CDT的艱難梭菌引起的感染復(fù)發(fā)情況較不產(chǎn)生CDT的菌株要嚴(yán)重，然而當(dāng)前對(duì)于CDT在艱難梭菌感染過(guò)程中的具體機(jī)制依然不清楚[4]。CDT主要由兩種基因cdtA和cdtB編碼產(chǎn)生[5]。

艱難梭菌感染（Clostridioides difficile infection,CDI）在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家十分嚴(yán)重，僅在美國(guó)，每年由于CDI導(dǎo)致的腸炎病例就超過(guò)500 000例，造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)4.36～30億美元[6]?？股匾廊皇桥R床上治療CDI最有效的方式之一，然而目前被推薦用于治療CDI的抗生素僅包括甲硝噠唑（Metronidazole, MTZ）、萬(wàn)古霉素（Vancomycin,VAN）和非達(dá)霉素（Fidaxomicin, FDX）[7]。其中一個(gè)很重要的原因在于艱難梭菌對(duì)許多臨床上用于治療細(xì)菌感染的抗生素天然具有抗性[8]，并且抗生素的使用被認(rèn)為是導(dǎo)致CDI發(fā)生的一個(gè)最重要的風(fēng)險(xiǎn)因素[9]。盡管已有研究顯示艱難梭菌可以廣泛定殖于人和多種動(dòng)物的腸道中并致病[1]，然而當(dāng)前國(guó)內(nèi)外關(guān)于艱難梭菌的研究主要集中在人醫(yī)領(lǐng)域。盡管目前還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)艱難梭菌從人傳染給動(dòng)物的直接證據(jù)，然而國(guó)外已有研究表明豬源艱難梭菌和人源艱難梭菌之間可能具有共同的來(lái)源[10]。因此，開(kāi)展動(dòng)物源尤其是食源性動(dòng)物源艱難梭菌的研究具有十分重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義，但相關(guān)的研究在國(guó)內(nèi)還幾乎處于空白。本研究針對(duì)來(lái)源于我國(guó)部分地區(qū)疑似患有腸炎的病豬糞便樣品進(jìn)行艱難梭菌的分離鑒定，并對(duì)所分離的菌株進(jìn)行耐藥性測(cè)試和全基因組重測(cè)序，為了解豬源艱難梭菌的病原學(xué)及分子生物學(xué)特征奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、菌種及試劑 97份疑似患有腸炎的病豬糞便樣品收集于湖北省和廣東省部分規(guī)?；i場(chǎng)，保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｈ嗽雌D難梭菌LC693（GenBank登錄號(hào)：NCXL00000000）為一株同時(shí)產(chǎn)毒素A、毒素B和二元毒素（A+B+CDT+）的艱難梭菌[11]，在本研究中用作對(duì)照。胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）購(gòu)自美國(guó)BD公司；無(wú)支原體新生牛血清購(gòu)自浙江天杭生物科技有限公司。2× Taq Master Mix DNA聚合酶、2× Taq Master Mix Kit購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；Quick-Load 100 bp DNA Ladder購(gòu)自美國(guó)NEB公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；糞便基因組提取試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA公司；抗生素包括頭孢菌素（FOX）、氯霉素（CHL）、萬(wàn)古霉素（VAN）、利福西明（RFX）、克林霉素（CLI）、莫西沙星（MXF）、氨芐西林（AMP）、頭孢曲松鈉（CRO）、甲硝噠唑（MTZ）、非達(dá)霉素（FDX）購(gòu)自美國(guó)Sigma有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[12]合成用于檢測(cè)艱難梭菌16S rDNA基因、毒素A的編碼基因tcdA、毒素B的編碼基因tcdB以及二元毒素編碼基因cdtA和cdtB的5重PCR方法所用的引物（表1），引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 本研究中所使用的引物列表Table 1 Primers used in this study

1.3 糞便樣品中艱難梭菌的分離鑒定 按照說(shuō)明書(shū)利用糞便基因組提取試劑盒處理糞便樣品并提取糞便基因組DNA，以所提取的DNA為模板，根據(jù)文獻(xiàn)[12]的報(bào)道，利用5重PCR方法對(duì)艱難梭菌16Sr DNA基因、毒素編碼基因tcdA、tcdB以及cdtA和cdtB進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，引物6.25 μL（終濃度見(jiàn)表1），ddH2O5.25 μL，模板DNA 1 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性50 s，54℃退火40 s，72℃延伸50s，共35個(gè)循環(huán)；最后在72℃ 條件下延伸3 min。PCR產(chǎn)物利用3%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳分析；利用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取人源艱難梭菌LC693的基因組作為陽(yáng)性對(duì)照。將艱難梭菌毒素編碼基因PCR檢測(cè)為陽(yáng)新的糞便樣品經(jīng)75%乙醇溶液處理后，取適量液體在含有10%新生牛血清的TSA平板上劃線置于厭氧罐中于37℃培養(yǎng)約48 h，待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的單菌落，挑取顏色為灰白色，表面粗糙，呈不規(guī)則形狀，邊緣不整齊，并具有特殊氣味的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，同時(shí)提取細(xì)菌的基因組DNA利用上述5重PCR方法作進(jìn)一步的確認(rèn)。

1.4 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床及實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（clinical & laboratory standards institute, CLSI）頒布的《細(xì)菌藥敏試驗(yàn)規(guī)范》（CLSI-M100-S25）中的微量肉湯稀釋法（broth microdilution）對(duì)所分離的艱難梭菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)；藥敏結(jié)果參考CLSIM100-S25的規(guī)定耐藥折點(diǎn)進(jìn)行判定；對(duì)于CLSIM100-S25中未給出判定標(biāo)準(zhǔn)的藥物則依據(jù)EUCAST或者已發(fā)表的文獻(xiàn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定。

1.5 HuB01的全基因組重測(cè)序 將提取的艱難梭菌的基因組DNA送往北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq Xten（Illumina Inc, San Diego, USA），對(duì)得到的下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾處理，去除reads兩端低質(zhì)量堿基（質(zhì)量值設(shè)置為20）及長(zhǎng)度過(guò)低的reads（默認(rèn)設(shè)為50 bp），同時(shí)去除N堿基達(dá)到一定比例的reads（默認(rèn)設(shè)為10 bp）以及與Adapter之間overlap超過(guò)一定閾值（默認(rèn)設(shè)為15 bp）的reads，最后去除duplication污染后得到有效數(shù)據(jù)（clean data）。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾以及質(zhì)量控制之后的有效數(shù)據(jù)利用SPAdes（version 3.9.0）軟件進(jìn)行de novo組裝后獲取高質(zhì)量的Contig片段，并進(jìn)行補(bǔ)洞和優(yōu)化，最后得到基因組草圖序列。利用prokka（version 1.12）軟件，按照NCBI原核基因組注釋規(guī)程（NCBI prokaryotic genome annotation pipeline）的要求對(duì)所有基因組序列進(jìn)行注釋?；贜R、PHI、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO、Pfam等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)編碼基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)；分別利用VFDB數(shù)據(jù)庫(kù)及CADB數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)基因組中的毒力基因和耐藥基因進(jìn)行預(yù)測(cè)；此外，由CGView軟件完成艱難梭菌全基因組環(huán)狀圖的繪制；將全基因組序列提交至Clostridium difficile MLST database（https://pubmlst.org/cdifficile/）進(jìn)行序列型（sequence type,ST）的界定。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測(cè)及細(xì)菌的分離培養(yǎng) 針對(duì)所采集到的97份糞便樣品進(jìn)行艱難梭菌16S rDNA、tcdA、tcdB、cdtA和cdtB的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有80份樣品為16S rDNA陽(yáng)性，其中包括2份樣品為tcdA和tcdB陽(yáng)性；所有糞便樣品中均未檢測(cè)到CDT編碼基因cdtA和cdtB。將tcdA和tcdB為陽(yáng)性的糞便樣品經(jīng)處理后接種含有10%新生牛血清的TSA平板，置于厭氧罐中于37℃培養(yǎng)約48 h，待長(zhǎng)出肉眼可見(jiàn)的單菌落，挑取顏色為灰白色，表面粗糙，呈不規(guī)則形狀，邊緣不整齊，并具有特殊氣味的菌落進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，在油鏡下觀察可見(jiàn)到藍(lán)紫色的桿菌（圖1），說(shuō)明所分離的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。提取所分離菌株的基因組DNA，利用5重PCR進(jìn)行鑒定，能夠檢測(cè)到艱難梭菌的16S rDNA基因、tcdA和tcdB（圖2）。上述結(jié)果說(shuō)明艱難梭菌被成功分離，將所分離的艱難梭菌命名為HuB01。

圖1 HuB01的染色結(jié)果（×400）Fig.1 Gram staining of HuB01 (×400)

圖2 HuB01基因組經(jīng)5重PCR鑒定的結(jié)果Fig.2 The results of HuB01 genomic DNA detected by 5-plex PCR

2.2 藥物敏感性測(cè)試 用微量肉湯稀釋法測(cè)定HuB01對(duì)頭孢菌素、氯霉素、萬(wàn)古霉素、利福西明、克林霉素、莫西沙星、氨芐西林、頭孢曲松鈉、甲硝噠唑、非達(dá)霉素10種抗生素的敏感性，結(jié)果顯示，HuB01對(duì)頭孢菌素、氯霉素、克林霉素、氨芐西林、頭孢曲松鈉耐藥，對(duì)莫西沙星和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出中度耐藥，而對(duì)利福西明、甲硝噠唑、非達(dá)霉素敏感（表2）。

表2 10種常用 抗生素對(duì)HuB01的最小抑菌濃度（MIC）Table 2 Minimum inhibitory concentrations (MICs) of 10 kinds of antibiotics on HuB01

2.3 HuB01全基因組特征 針對(duì)HuB01進(jìn)行全基因組重測(cè)序，結(jié)果顯示HuB01的全基因組大小3 929 112 bp，平均GC含量為28.31%（表3、圖3），編碼3691個(gè)蛋白、63個(gè)tRNA和10個(gè)rRNA（表3）。3691個(gè)基因中含有31個(gè)耐藥基因（表4）和164個(gè)毒力相關(guān)基因；將HuB01的全基因組提交至MLST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示HuB01為ST11。

表3 HuB01的全基因組特征Table 3 Genome characteristics of HuB01

表4 HuB01中所含的耐藥基因Table 4 Predicted antimicrobial resistance genes in the genome of HuB01

圖4 HuB01基因組圈Fig.4 Circular presentation of the genome of C. diff i cile HuB01

3 討論

本次研究共采集到97份糞便樣品，經(jīng)5重PCR方法檢測(cè)，其中80份樣品能檢測(cè)到艱難梭菌的16S rDNA基因，80份樣品中有78份樣品檢測(cè)結(jié)果為僅16S rDNA陽(yáng)性，說(shuō)明在豬群中非產(chǎn)毒艱難梭菌的攜帶情況比較常見(jiàn)。80份16S rDNA基因?yàn)殛?yáng)性的樣品中有兩份樣品表現(xiàn)為艱難梭菌毒素A和毒素B編碼基因呈陽(yáng)性，說(shuō)明在豬群中也存在產(chǎn)毒艱難梭菌，這部分菌株應(yīng)引起重視。下一步將針對(duì)所分離的產(chǎn)毒艱難梭菌的致病力進(jìn)行評(píng)估。在本研究中未在豬的糞便樣品檢出艱難梭菌的二元毒素編碼基因。需要指出的是，攜帶二元毒素的產(chǎn)毒艱難梭菌在人醫(yī)臨床上也較為少見(jiàn)，檢出率約為20%[3]。

本研究對(duì)從豬場(chǎng)發(fā)病豬的糞便中分離的一株產(chǎn)毒艱難梭菌HuB01，藥敏試驗(yàn)的結(jié)果顯示HuB01對(duì)頭孢菌素、氯霉素、克林霉素、氨芐西林、頭孢曲松鈉耐藥，對(duì)莫西沙星和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出中度耐藥，對(duì)利福昔明、甲硝噠唑、非達(dá)霉素敏感，提示豬源艱難梭菌的耐藥性十分嚴(yán)重，并呈現(xiàn)多重耐藥。在本次研究中艱難梭菌對(duì)甲硝噠唑敏感，對(duì)萬(wàn)古霉素呈現(xiàn)中度耐藥。需要指出的是當(dāng)前臨床上被推薦作為治療CDI的抗生素僅包括甲硝噠唑、萬(wàn)古霉素和非達(dá)霉素[7]。耐萬(wàn)古霉素艱難梭菌的出現(xiàn)將使得治療CDI的可用抗生素變得更少。HuB01對(duì)萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出中度耐藥不排除和豬場(chǎng)使用萬(wàn)古霉素有關(guān)。此外，針對(duì)HuB01進(jìn)行全基因組重測(cè)序并進(jìn)行耐藥基因分析發(fā)現(xiàn)，在HuB01的基因組中攜帶有與萬(wàn)古霉素、氯霉素、喹諾酮類等抗性相關(guān)的耐藥基因（表4），這些基因的存在可能介導(dǎo)了HuB01對(duì)相關(guān)抗生素的抗性。

本研究所分離鑒定的一株艱難梭菌為ST11型。有報(bào)道顯示，在豬群中流行的高毒力艱難梭菌RT078的序列型也為ST11[14-15]，然而豬源RT078/ST11艱難梭菌產(chǎn)二元毒素，與在北美地區(qū)人醫(yī)臨床流行的艱難梭菌高毒力RT027/ST1型菌株具有相似的毒素產(chǎn)生水平[16-17]。有趣的是，本研究中所分離的ST11菌株HuB01不含有二元毒素編碼基因。下一步研究將一方面對(duì)HuB01進(jìn)行核糖體分型從而確定其核糖體基因型，另一方面將對(duì)HuB01的致病性進(jìn)行評(píng)估，進(jìn)而更全面地了解HuB01的病原學(xué)特征。

綜上所述，本研究從來(lái)源于湖北和廣東部分規(guī)?；i場(chǎng)疑似患有腸炎的病豬糞便樣品分離出一株艱難梭菌HuB01，該菌株攜帶毒素編碼基因tcdA和tcdB，不攜帶二元毒素編碼基因cdtA和cdtB；藥敏試驗(yàn)顯示HuB01對(duì)頭孢菌素、氯霉素、克林霉素、氨芐西林、頭孢曲松鈉耐藥，對(duì)莫西沙星和萬(wàn)古霉素表現(xiàn)出中度耐藥，對(duì)利福昔明、甲硝噠唑、非達(dá)霉素敏感；針對(duì)HuB01進(jìn)行全基因組重測(cè)序，結(jié)果顯示HuB01的全基因組大小為3.93 Mb，平均GC含量為28.31%，基因組中含有多個(gè)耐藥基因，基于全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)HuB01為ST11；本研究將為豬源艱難梭菌的病原學(xué)及分子生物學(xué)特征的研究奠定基礎(chǔ)。