劉漢勝

（甘肅省會(huì)寧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測管理站，會(huì)寧 730799）

羊腸道病毒?。╟aprine enterovirus disease,CEVD）是由羊腸道病毒（Caprine enterovirus，CEV）引起羊的以危害呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)癥狀為主要特征的一種急性傳染病[1-2]，為近年來新發(fā)現(xiàn)的動(dòng)物傳染病，我國最早于2014年在致死率達(dá)50%以上發(fā)生嚴(yán)重腹瀉的羊群中首次檢測到CEV，并完成了毒株的分離和基因測序[3-4]。根據(jù)魯桂俠等[5-7]分別對河北省、河南省、山東省的流行病學(xué)調(diào)查顯示，近幾年來CEV在我國羊群中的流行比較嚴(yán)重，直接導(dǎo)致了羊生產(chǎn)性能和養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益的下降，也給我國羊病尤其是羊腹瀉性疫病的防控工作增加了難度，也在一定程度上阻礙了我國養(yǎng)羊業(yè)的可持續(xù)和高質(zhì)量發(fā)展。但當(dāng)前對于CEV致病機(jī)制、生物學(xué)特性等方面的研究尚處于起步階段，且缺乏有效的疫苗和診斷試劑，導(dǎo)致CEV的綜合防控工作較難開展。當(dāng)前分離鑒定CEV現(xiàn)地流行毒株，并研究流行毒株的理化特性、遺傳特征、致病性，對CEV致病機(jī)制和發(fā)病機(jī)理等基礎(chǔ)性研究、CEV疫苗和診斷試劑研發(fā)等應(yīng)用性研究均具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

2021年春，甘肅省某羊場暴發(fā)一種以嚴(yán)重腹瀉、精神萎靡、逐漸消瘦為主要臨床癥狀的疫病，應(yīng)用多種抗生素治療均無效果，經(jīng)基層獸醫(yī)臨床診斷為疑似CEV感染。為確診此次疫病的致病原，為該羊場疫病防控提供技術(shù)支持，同時(shí)掌握CEV流行毒株的生物學(xué)特性和致病性，本研究進(jìn)行了CEV的分離鑒定、序列分析、生物學(xué)特性、致病性等研究，旨在獲得CEV現(xiàn)地流行毒株，掌握CEV流行毒株的理化特性、遺傳特征和致病性，為CEV致病機(jī)制、新型疫苗、診斷試劑等研究奠定基礎(chǔ)，為我國CEV的綜合防控提供參考依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 臨床病料樣品的采集與處理 采集發(fā)病羊群的新鮮糞便樣品，低溫、快速運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室。

1.2 細(xì)胞、載體、分子生物學(xué)試劑 Vero細(xì)胞系購自上海哈靈生物科技有限公司；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體、一步法RT-PCR擴(kuò)增試劑盒均購自TaKaRa公司；病毒基因組RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 病毒分離培養(yǎng) 將采集的新鮮糞便樣品溶解于3倍體積滅菌磷酸鹽緩沖液中，搗碎、碾磨，經(jīng)12 000×g離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，接種單層Vero細(xì)胞，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，早、中、晚分別觀察細(xì)胞病變情況，待75%以上細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲病毒，盲傳6代。

1.4 分離毒株病毒含量（median tissue culture infective dose, TCID50）測定 將分離毒株依次做10倍倍比稀釋（10-1～10-10），各稀釋度分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的單層Vero細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔，根據(jù)各稀釋度的細(xì)胞病變孔數(shù)和未病變孔數(shù)，按照Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

1.5 分離毒株生物學(xué)特性檢測

1.5.1 酸堿敏感性檢測 將分離毒株依次加入到pH值為3.0、5.0、7.0、9.0、10.0的培養(yǎng)液中，37℃作用2 h后，接種Vero細(xì)胞，測定TCID50。

1.5.2 氯仿敏感性檢測 將分離毒株加入到終濃度為20%的氯仿中，4℃作用12 h，將有機(jī)相棄去后，接種Vero細(xì)胞，測定TCID50。

1.5.3 乙醚敏感性檢測 將分離毒株加入到終濃度為20%的乙醚中，4℃作用12 h，反復(fù)吹打至乙醚揮發(fā)干凈后，接種Vero細(xì)胞，測定TCID50。

1.5.4 溫度敏感性檢測 將分離株病毒依次在37℃、56℃、65℃、80℃作用1 h后，接種Vero細(xì)胞，測定TCID50。

1.6 分離毒株5'-UTR基因序列分析

1.6.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank中登錄的CEV 5'-UTR基因序列（登錄號：MN598038.1）設(shè)計(jì)1對引物（F：5'-CGTGGCGCTAGTGC-3'，R：5'-TCCGCCTCCAACTTAC-3'），其預(yù)期擴(kuò)增片段大小約為575 bp，引物由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.6.2 病毒基因組RNA提取 利用病毒基因組RNA提取試劑盒提取分離毒株的基因組RNA。

1.6.3 RT-PCR擴(kuò)增 利用合成的引物對提取的分離毒株基因組RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。一步法RT-PCR擴(kuò)增體系為：2×Buffer 12.5 μL，酶0.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，RNA 2.5 μL，ddH2O 9 μL。一步法RT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?0℃ 30 min；95℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，54℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.6.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆與序列分析 膠回收并純化RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后連接至pMD18-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，送北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司測序，利用DNAStar生物學(xué)軟件對測得序列與GenBank中登錄的CEV 5'-UTR基因序列進(jìn)行同源性比較分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.7 分離毒株致病性檢測

1.7.1 試驗(yàn)分組 將日齡、體重均相似的20只健康羔羊隨機(jī)分為2組（攻毒組和對照組），攻毒組的10只羔羊接種分離毒株，對照組10只羔羊接種滅菌生理鹽水，接種方式均為肌肉注射，接種劑量均為0.1 mL/只，隔離飼養(yǎng)，觀察14 d。

1.7.2 臨床癥狀觀察 每日觀察試驗(yàn)羔羊的臨床表現(xiàn)，及時(shí)記錄食欲、精神狀態(tài)、腹瀉以及死亡等情況。

1.7.3 排毒情況檢測 參照1.6中的PCR擴(kuò)增方法對試驗(yàn)羔羊的每日糞便樣品進(jìn)行CEV病原檢測，掌握排毒情況。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離培養(yǎng)結(jié)果 將臨床糞便樣品接種單層Vero細(xì)胞后，在前2代未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，至第三代開始出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變，隨著傳代次數(shù)的增加，細(xì)胞出現(xiàn)病變的規(guī)律性逐步增強(qiáng)，至盲傳6代后細(xì)胞表現(xiàn)出圓縮、拉網(wǎng)、折光性增強(qiáng)等典型的細(xì)胞病變（圖1），無菌收獲第6代病毒，將其命名為GS株，-80℃保存。

圖1 臨床糞便樣品引起的細(xì)胞病變（250×）Fig.1 Cytopathy caused by clinical fecal samples (250×）

2.2 分離毒株病毒含量（TCID50）測定結(jié)果 分離毒株經(jīng)10-1～10-10倍比稀釋后分別接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的單層Vero細(xì)胞，各稀釋度導(dǎo)致Vero細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞病變孔數(shù)和未病變孔數(shù)如表1所示，按照Reed-Muench法計(jì)算分離毒株的TCID50為10-6.88/ 0.1 mL。

表1 分離毒株病毒含量（TCID50）測定結(jié)果Table 1 Determination results of virus content (TCID50) of isolated strains

2.3 分離毒株生物學(xué)特性檢測結(jié)果 分離毒株生物學(xué)特性檢測結(jié)果如表2所示，分離毒株對酸性（pH值為3.0、5.0）不敏感，對堿性（pH值為9.0、10.0）較敏感，即分離毒株耐酸不耐堿；分離毒株經(jīng)過氯仿和乙醚處理后病毒含量未見明顯降低，分離毒株有機(jī)溶劑不敏感；分離毒株對溫度較敏感，在56℃即完全失活。

表2 分離毒株生物學(xué)特性檢測結(jié)果Table 2 Biological characteristics test results of isolated strains

2.4 分離毒株5'-UTR基因序列分析結(jié)果 分離毒株的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段約為575 bp，與試驗(yàn)預(yù)期相符。將分離毒株5'-UTR基因序列與GenBank中登錄的CEV 5'-UTR基因序列進(jìn)行同源性比較分析，并構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3、圖4所示，分離毒株與6株G種羊腸道病毒核苷酸同源性較高，同源性為90.8%～100%，其中與羊腸道病毒CEV-JL14株（GenBank登錄號：KU297674.1）5'-UTR基因核苷酸同源性為100%，與E種和F種羊腸道病毒核苷酸同源性較低，在進(jìn)化樹中分離毒株與羊腸道病毒CEV-JL14株（GenBank登錄號：KU297674.1）、CEV-JLLS34株（GenBank登錄號：MN598033.1）、CEVJL-LS165株（GenBank登錄號：MN598035.1）、C E V-J L-L S 1 7 4株（G e n B a n k登錄號：MN598036.1）、CEV-SD-S68株（GenBank登錄號：MN598040.1）、CEV-NMG-F37株（GenBank登錄號：MN598041.1）的同源關(guān)系較近，進(jìn)化樹處于同一分支，都屬于G種腸道病毒，與E種腸道病毒、F種腸道病毒屬于不同的分支，進(jìn)而從分子水平證實(shí)分離毒株為G種羊腸道病毒。

圖2 RT-PCR檢測結(jié)果Fig.2 RT-PCR results

圖3 分離毒株5'UTR核苷酸同源性比較分析結(jié)果Fig.3 Comparative analysis results of nucleotide homology of 5'UTR isolated strains

圖4 分離毒株5'-UTR基因進(jìn)化樹分析結(jié)果Fig.4 Evolutionary tree analysis results of 5 '- UTR gene of isolated strains

2.5 分離毒株致病性檢測結(jié)果 每日觀察試驗(yàn)羔羊的臨床表現(xiàn)，結(jié)果如表3所示，攻毒組的10只羔羊在攻毒后第3 d陸續(xù)開始表現(xiàn)出食欲下降、精神萎靡、腹瀉等臨床癥狀，臨床癥狀在攻毒后第8 d陸續(xù)開始減輕，試驗(yàn)期間共計(jì)有8只羔羊表現(xiàn)出臨床癥狀，發(fā)病率達(dá)80%，攻毒組羔羊未出現(xiàn)死亡。利用PCR擴(kuò)增方法對試驗(yàn)羔羊的每日糞便樣品進(jìn)行CEV病原檢測，結(jié)果如表4所示，利用PCR方法對試驗(yàn)羔羊的每日糞便進(jìn)行檢測，在攻毒后第2 d攻毒組羔羊糞便中即可檢測到CEV病原，在攻毒后第6 d CEV陽性檢出率已達(dá)到100%，至攻毒后第14 d CEV陽性檢出率仍然達(dá)到100%，表明攻毒后羔羊一直向體外排毒。

表3 攻毒羔羊臨床癥狀觀察結(jié)果Table 3 Observation results of clinical symptoms of virus challenged lambs

表4 攻毒羔羊排毒情況檢測結(jié)果Table 4 Test results of detoxification of virus challenged lambs

3 討論

CEV為近幾年新出現(xiàn)的羊易感病毒病，關(guān)于其致病機(jī)制、細(xì)胞適應(yīng)性、理化特性、遺傳特征的研究報(bào)道相對較少，Zhu等[8]研究表明牛腸道病毒能在Vero細(xì)胞中增殖，故本研究借鑒牛腸道病毒的分離培養(yǎng)方法，利用Vero細(xì)胞系進(jìn)行CEV的分離培養(yǎng)，結(jié)果表明臨床新鮮糞便樣品接種Vero細(xì)胞后，經(jīng)盲傳6代后出現(xiàn)細(xì)胞圓縮、拉網(wǎng)、折光性增強(qiáng)等典型細(xì)胞病變，按照Reed-Muench法測定分離毒株的TCID50達(dá)10-6.88/0.1 mL，具有較高的抗原滴度。進(jìn)一步通過生物學(xué)特性檢測表明病毒具有耐酸不耐堿、對有機(jī)溶劑不敏感、不耐熱等理化特性。在眾多腸道病毒中動(dòng)物主要易感E種、F種和G種腸道病毒，而5'-UTR基因是各種腸道病毒分型的首選基因[9-12]，本研究通過測定分離毒株的5'-UTR基因序列發(fā)現(xiàn)，分離毒株與我國2014年分離毒株CEV-JL14的同源性最高，處于進(jìn)化樹的同一分支，從分子水平證明分離到的CEV毒株為G種羊腸道病毒?？傊?，本試驗(yàn)成功分離到了一株G種羊腸道病毒，并掌握了該毒株的細(xì)胞適應(yīng)性、理化特性和遺傳特征，首次確定了甘肅省腹瀉羊群存在G種羊腸道病毒感染，為豐富我國CEV流行病學(xué)資料提供了參考資料，為研制CEV新型疫苗與診斷試劑奠定了堅(jiān)實(shí)的物質(zhì)基礎(chǔ)。

在本研究中，分離毒株攻擊的羔羊在攻毒后第2 d可在糞便中檢測到CEV，至攻毒后第14 d CEV檢出率仍為100%，攻毒后羔羊一直在向體外排毒，但在臨床表現(xiàn)方面，攻毒的10只羔羊只有8只表現(xiàn)出食欲下降、精神萎靡、腹瀉、逐漸消瘦等癥狀，發(fā)病率達(dá)80%，未出現(xiàn)羔羊死亡。表明分離毒株可在羔羊體內(nèi)繁殖復(fù)制，但其并未能引起羔羊死亡，這與臨床中CEV可引發(fā)的50%病死率存在較大差異，分析其產(chǎn)生的原因主要有以下兩方面：一方面，CEV不同毒株的毒力存在較大差異，由其引起的病死率也將存在較大差異；另一方面，CEV在臨床中常常與其他致病原存在混合感染，王應(yīng)龍等[13]研究表明青海省海東市腹瀉藏羊中CEV與牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus, BVDV）、羊邊界病病毒（Border disease virus, BDV）的混合感染率分別為4.12%、3.13%，張群等[14]研究表明吉林省和內(nèi)蒙古地區(qū)羊群中CEV與小反芻獸疫病毒（peste des petits ruminants virus, PPRV）的混合感染率為6.60%，由此推測臨床中CEV與其他致病原的混合感染增加了CEV的致病性。本研究結(jié)果表明分離毒株對羔羊具有一定的致病性，為CEV致病機(jī)制研究、CEV綜合防控措施的制定提供了參考依據(jù)。