嚴(yán)偉健，張惠琴，劉麗麗，葉中綠，黃 明，田 川

（廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒童醫(yī)學(xué)中心,廣東湛江 524001）

近些年大氣污染日益嚴(yán)重，以粒徑低于2.5 μm的細(xì)顆粒物(PM2.5)對人體的損害最為嚴(yán)重[1]。PM2.5 能夠直接或間接作用于機體內(nèi)的炎癥細(xì)胞，激活各種炎癥細(xì)胞，引起局部組織或系統(tǒng)炎癥[2]，是損害人體健康的關(guān)鍵機制。而殼寡糖及其衍生物已被證明具有抗炎、免疫刺激、抗腫瘤、促進(jìn)組織再生、抗菌、抗氧化等多種生物學(xué)活性[3-8]。本實驗通過比較殼寡糖干預(yù)前后炎癥模型小鼠Wnt/β-catenin 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，旨在探討殼寡糖是否通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路改善炎癥反應(yīng)。

1 材料和方法

1.1 動物和分組

6～8 周齡SPF 級C57BL/6J 小鼠，共32 只，雄性，身體質(zhì)量為16.1～19.4 g，均由南京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院提供，動物許可證號：SCXK(蘇)2015-0001。按照隨機數(shù)字表法分為空白對照組、模型組（陽性對照組）、殼寡糖組、陰性對照組，每組8只。

1.2 主要試劑與儀器

殼寡糖（分子量＜1 500，純度＞90%，青島博智匯力生物科技有限公司），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Cyclin D1 Rabbit mAb、β-Catenin Rabbit mAb、C-myc Rabbit mAb 均購自Cell Signaling Technology 公司，Western 電泳儀（上海天能公司），OLYMPUS DP71 顯微照相系統(tǒng)（日本OLYMPUS 公司）

1.3 方法

1.3.1 PM2.5 的采集和配備 選擇廣東省湛江市霞山區(qū)人民大道南路段作為PM2.5 采集點，使用QJS-100D 型多級顆粒物采集器采集，將采有細(xì)顆粒物的濾紙剪成約1 cm×1 cm 小塊浸于蒸餾水中，4 ℃超聲振蕩30 min，重復(fù)5 次，洗脫顆粒物，振蕩液經(jīng)8 層紗布過濾，真空冷凍干燥機冷凍干燥，收集干粉，并用生理鹽水配制成200 mg/L的PM2.5懸液，4 ℃保存。

1.3.2 PM2.5 所致炎癥反應(yīng)模型的建立模型組、殼寡糖組小鼠每3 d 染毒1 次，共染毒10 次；余2 組以等量生理鹽水氣管滴注。具體操作為用1 mL 注射器連接4.5 號頭皮針，先抽取0.1 mL 氣體，再按實驗分組，分別取預(yù)先抽好的生理鹽水、200 mg/L的PM2.5懸液各50 μL。待小鼠充分麻醉后進(jìn)行氣管穿刺，模型組及殼寡糖組將PM2.5 懸液從頭皮針中注入氣管，余2 組注入等量生理鹽水。PM2.5 染毒結(jié)束后，殼寡糖組、陰性對照組予小鼠予殼寡糖（600 mg/kg）灌胃，余2組以等量雙蒸水灌胃，每天1次，連續(xù)2周。

1.3.3 樣本采集 （1）肺組織的收集及固定：每組取兩只小鼠左肺放入10%固定中性色福爾馬林固定液中充分固定；余下6 只則放入潔凈1.5 mL EP 管中，于?80 ℃冰箱中保存。（2）骨髓組織的收集及處理：每組取2 只小鼠股骨，去除骨表面附著的肌肉及軟組織，于10%福爾馬林溶液中固定。每組余下6 只則取雙側(cè)股骨及脛骨置于裝有PBS 緩沖液的無菌EP 管中，用鑷子鉗起骨頭的一端，并用注射器吸取PBS 緩沖液沖洗骨髓腔，由一端骨髓腔沖出骨髓組織，再反方向沖出骨髓，直到股骨中呈透明狀態(tài)停止。收集骨髓細(xì)胞懸液于1.5 mL 離心管中，保存于?80 ℃冰箱中。

1.3.4 小鼠組織蛋白提取 稱取各實驗組小鼠的肺組織600 mg 并剪碎。骨髓細(xì)胞懸液計算其細(xì)胞數(shù)后，1 200 r/min 離心5 min，棄上清取沉淀即為骨髓細(xì)胞。肺組織以每10 mg加100 μL裂解液，而骨髓組織則按細(xì)胞數(shù)每1×106/L 加200 μL 充分裂解。裂解后于4 ℃、12 000 r/min 離心15 min 后，棄沉淀，取上清液于潔凈1.5 mL EP 管中，?80 ℃保存。按碧云天BCA 濃度測定試劑盒說明書將提取的蛋白樣品進(jìn)行濃度測定。

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗（Western blotting）將蛋白樣品解凍后，從各組蛋白中取出相同蛋白量，配平至一致濃度，然后按4∶1 加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液(5X)，吹打混勻。放入沸水中，煮5 min，使蛋白變性。配制10%分離膠、5%濃縮膠。上樣后先用80 V的恒壓電壓，待溴酚藍(lán)跑至濃縮膠時，即轉(zhuǎn)為恒壓120 V，約50 min后電泳結(jié)束。取出待轉(zhuǎn)膜樣品凝膠，組裝成“三明治”夾層，設(shè)定轉(zhuǎn)膜恒定電流250 mA，轉(zhuǎn)膜時間為90 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜夾出放于TBS-T中，搖床上搖洗兩次，每次5 min。將膜放入培養(yǎng)皿中，加入5%封閉液，搖床上慢搖封閉1 h。將條帶加入對應(yīng)一抗中，于4 ℃冰箱中孵育過夜。次日，將孵育盒置于搖床上室溫慢搖復(fù)溫1 h；回收一抗，將膜放入TBS-T 中，用搖床搖洗5 次，每次5 min；將目的條帶和內(nèi)參條帶分別放入膠盒中，加入適量二抗封閉液，將孵育盒置于搖床上室溫慢搖1 h 左右。孵完二抗后，回收二抗，將膜夾出，放TBS-T 中，用搖床快搖5 次，每次5 min。在Tanon5200 成像系統(tǒng)中曝光條帶，ImageJ分析各目的蛋白條帶灰度值。

1.3.6 小鼠肺組織石蠟切片制備及HE染色 取各組小鼠的左側(cè)肺置于10%中性福爾馬林中固定48 h 以上，再進(jìn)行乙醇梯度脫水、透明、石蠟包埋、脫蠟、梯度酒精復(fù)水，后進(jìn)行染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)。

1.3.7 小鼠骨髓組織石蠟切片制備及HE染色 每組隨機選取2 只小鼠左側(cè)股骨，用無菌紗布擦去股骨周圍的軟組織，放入10 %中性福爾馬林中固定24 h 以上。進(jìn)行脫鈣、梯度脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊及切片、脫蠟、水洗，后進(jìn)行染色，光鏡下觀察各組小鼠骨髓組織病理形態(tài)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，用GraphPad Prism5統(tǒng)計軟件作圖。計量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用單因素方差分析，方差齊則采用LSD-t檢驗法進(jìn)行多重比較，不齊則用Dunnett’T3 檢驗。以α=0.05 為檢驗水準(zhǔn)，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各處理實驗組小鼠肺組織病理切片、HE染色

空白對照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰，無明顯病理改變。模型組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞彌漫浸潤，肺泡壁明顯增厚，但予殼寡糖灌胃后，病變改善明顯。骨髓組織病理切片顯示空白對照組小鼠骨髓組織切片各細(xì)胞形態(tài)正常，可見少量的巨核細(xì)胞散在分布；模型組小鼠骨髓組織中的巨核細(xì)胞數(shù)量明顯增多；殼寡糖組巨核細(xì)胞較模型組少，稍多于對照組。見圖1、2。

圖1 各組肺組織病理切片（HE染色，×100）

2.2 各組小鼠肺組織及骨髓組織的β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白的表達(dá)水平

通過Western-blot 檢測各組小鼠肺組織的βcatenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白水平，結(jié)果顯示：在內(nèi)參β-actin 整齊的情況下，與空白對照組相比，模型組肺和骨髓組織中β-catenin、c-myc、CyclinD1 蛋白表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而殼寡糖組β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表達(dá)量明顯比模型組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。在肺組織及骨髓組織中，空白對照組與陰性對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、2，圖3、4。

圖3 各組肺組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表達(dá)水平

表1 各組小鼠肺組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表達(dá)水平 (±s)

表1 各組小鼠肺組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1 蛋白表達(dá)水平 (±s)

與空白對照組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01

3 討論

PM2.5 易富集空氣中的有機污染物、有毒重金屬、酸性氧化物、病原體等，且能較長時間停留在空氣中，通過呼吸道進(jìn)入人體，并在肺泡內(nèi)持續(xù)產(chǎn)生損傷，對呼吸系統(tǒng)影響極為嚴(yán)重。本研究通過氣管滴注PM2.5 的方法染毒C57 小鼠建立亞急性炎癥模型，該方法是目前PM2.5 染毒方法中應(yīng)用最廣泛及且經(jīng)濟的方法。目前PM2.5 對各系統(tǒng)的損害作用主要通過誘發(fā)多個臟器發(fā)生炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損害所致。本課題組在前期研究已發(fā)現(xiàn)PM2.5 能引起骨髓組織ROS 產(chǎn)生增多、SOD 酶活性減低，PM2.5 染毒后炎癥細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌水平升高。

圖2 各組骨髓組織病理切片（HE染色，×100）

表2 各組小鼠骨髓組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表達(dá)水平 (±s)

表2 各組小鼠骨髓組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表達(dá)水平 (±s)

與空白對照組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01

圖4 各組骨髓組織β-catenin、c-myc、Cyclin-D1蛋白表達(dá)水平

殼寡糖是目前已知唯一的堿性寡糖，對機體無毒性不良反應(yīng)，有較好的生物相容性和可降解性，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抑制腫瘤生長等作用[3,5]。氣管內(nèi)滴注PM2.5混懸液可誘導(dǎo)小鼠炎癥模型。本研究發(fā)現(xiàn)，氣管滴注PM2.5 懸液后模型組小鼠肺間質(zhì)充滿了炎癥細(xì)胞，肺組織水腫嚴(yán)重，肺泡間隔增厚，而骨髓組織巨核細(xì)胞較空白對照組明顯升高，而殼寡糖給藥后可逆轉(zhuǎn)這一損傷性變化，可見殼寡糖對PM2.5引起的肺和骨髓組織炎癥反應(yīng)有改善作用。

本課題組前期研究已證實長期的PM2.5 暴露會引起骨髓的炎癥反應(yīng)。炎癥是機體的防御反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)對機體各器官及系統(tǒng)起保護作用,但近年來有大量研究指出炎癥反應(yīng)與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有密切聯(lián)系，其兩者是相互調(diào)節(jié)的事件。通過產(chǎn)生局部炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞可釋放多種細(xì)胞因子和生長因子建立和維持腫瘤微環(huán)境[9]。慢性、持續(xù)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致了多種腫瘤的惡變和擴散。Wnt/β-cantnin 為經(jīng)典炎癥信號通路，其靶蛋白β-cantnin、c-myc、CyclinD1在多發(fā)性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤等血液系統(tǒng)惡性疾病中表達(dá)并與預(yù)后相關(guān)。本實驗用PM2.5 亞急性染毒C57 小鼠后，模型組小鼠肺組織和骨髓組織中βcantnin、c-myc、CyclinD1 蛋白表達(dá)均較對照組顯著上升，提示PM2.5 長期暴露后會引起機體Wnt/β-cantnin信號通路的活化，與文獻(xiàn)報道一致[10]。而予殼寡糖干預(yù)后上述指標(biāo)表達(dá)均有所下降，但仍高于空白對照組及陰性對照組，肺組織與骨髓組織均呈現(xiàn)同樣的趨勢，類似的差異在病理切片中及前期對于炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的研究中也觀察到，提示殼寡糖可能抑制該信號通路的活化，并通過抑制wnt/β-cantnin 的活化來改善由PM2.5所致的肺損害和骨髓毒性。

Wnt信號在炎癥及腫瘤發(fā)生、發(fā)展中處于中心位置觀點。各種致病因素不僅可以直接作用于Wnt/βcatenin 信號通路引發(fā)相關(guān)的疾病，還能通過其他通路活化Wnt/β-catenin 信號通路，間接的依靠Wnt/βcatenin 信號通路產(chǎn)生一系列病理生理改變。如急性髓系白血病細(xì)胞通過自分泌wnt3a激活Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致疾病的發(fā)生，故Wnt/β-catenin 信號通路抑制劑有可能成為新一代抗腫瘤的靶向藥物。

綜上所述，殼寡糖可改善由PM2.5誘發(fā)的炎癥反應(yīng)，其機制可能與抑制Wnt/β-cantnin信息通路表達(dá)有關(guān)，本研究初步揭示了殼寡糖改善PM2.5誘發(fā)的炎癥反應(yīng)的分子機制，為殼寡糖進(jìn)一步臨床的開發(fā)應(yīng)用提供了實驗支持。