林俍良，潘海強，丁 航，馬衛(wèi)列，張志珍 （廣東醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室，廣東東莞 523808）

動脈粥樣硬化是心血管疾病的病理基礎，其早期特征以巨噬細胞脂質(zhì)代謝功能障礙導致的泡沫細胞形成為主要標志，是引發(fā)心血管疾病發(fā)生和患者死亡的主要原因[1]。載脂蛋白A-1（apoA-1）是高密度脂蛋白的重要結構蛋白組分，在機體脂質(zhì)代謝過程中具有介導泡沫細胞膽固醇外流、維持機體膽固醇穩(wěn)態(tài)、抗動脈粥樣硬化的作用[2]。研究表明，apoA-1 能介導泡沫細胞內(nèi)累積的膽固醇以囊泡形式胞吐至細胞外，有多種蛋白質(zhì)參與該膽固醇囊泡轉運過程[3]。分泌載體膜蛋白2（SCAMP2）是一種進化上保守的含有4 個跨膜區(qū)的膜整合蛋白，主要在胞內(nèi)分泌囊泡及質(zhì)膜上表達，以復合物形式參與胞吐/胞吐過程，在調(diào)節(jié)囊泡轉運及細胞分泌過程中發(fā)揮關鍵作用[4]。Ras 相關蛋白（Ras-related protein）Rab8a 是參與細胞膜轉運和囊泡運輸?shù)恼{(diào)控因子[5]。在巨噬細胞中，Rab8a 參與控制細胞表面蛋白的轉運和循環(huán)，如基質(zhì)金屬蛋白酶、腺苷三磷酸結合盒轉運體A1 等[6]。然而，SCAMP2 和Rab8a 是否參與apoA-1 介導的泡沫細胞內(nèi)膽固醇囊泡轉運以及它們是否具有相互作用，目前尚不清楚。我們前期從Jackson實驗室引進SCAMP2基因敲除的雜合子小鼠，并成功繁殖獲得同一品系的野生型C57BL/6NJ小鼠[7]。本實驗將提取野生型小鼠腹腔巨噬細胞，建立泡沫細胞模型，分析SCAMP2 和Rab8a的表達情況及二者之間的相互作用。

1 材料和方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器 熒光定量PCR 儀（德國Roche公司）；電泳及電轉移裝置（美國Bio-Rad 公司）；5417R 高速臺式離心機（德國Eppendorf 公司）；C400 成像系統(tǒng)（美國Azure Biosystems 公司）；SYNERGY H1 酶標儀（美國Biotek 公司）；TCS SP8 共聚焦熒光顯微鏡（德國Zeiss公司）。

1.1.2 實驗動物與材料 野生雄性C57BL/6NJ 小鼠（種鼠C57BL 品系的C57BL/6NJ-Scamp2em1J小鼠購自美國Jackson 實驗室，庫存號：028970）按照SPF 級動物飼養(yǎng)標準于廣東醫(yī)科大學實驗動物中心進行飼養(yǎng)繁殖。RPMI 1640 培養(yǎng)基購自Invitrogen 公司；胎牛血清購自Gibco 公司；乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL）購自安徽經(jīng)科生物技術有限公司；apoA-1 和Protein A/G 磁珠購自Sigma 公司；細胞總RNA 抽提試劑Trizol 購自Thermo Fisher 公司；逆轉錄和定量PCR 試劑盒購自Takala 公司；羊抗兔SCAMP2 多克隆抗體、羊抗鼠Rab8a 單克隆抗體和β-tubulin 抗體購自Proteintech 公司；二抗及熒光二抗購自上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠腹腔巨噬細胞的分離與培養(yǎng) 雄性8 周齡SPF級C57BL/6NJ小鼠禁食過夜后，頸椎脫臼法處死，腹腔注射5 mL 預冷的RPMI 1640 培養(yǎng)基，按摩腹壁5 min 后收集腹腔內(nèi)富集的巨噬細胞。1 500 r/min離心8 min，棄上清，用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸細胞，接種于6 孔板（1.2×106個細胞/孔），在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，用RPMI 1640 空白培養(yǎng)基輕輕沖洗2～3 次，去除未貼壁細胞，培養(yǎng)板上的貼壁細胞即為實驗所用的原代巨噬細胞。

1.2.2 建立泡沫細胞模型 提取的腹腔巨噬細胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用空白培養(yǎng)基洗2 次，加入含有50 mg/L 乙?；兔芏戎鞍祝╝cLDL）0.2% BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)基孵育48 h，誘導巨噬細胞轉變?yōu)榕菽毎?/p>

1.2.3 apoA-1 處理與實驗分組 巨噬細胞源性泡沫細胞用空白培養(yǎng)基洗2 次，用含0.2% BSA 的RPMI 1640 培養(yǎng)基平衡12 h，加入10 mg/L 的apoA-1 作用12 h。實驗中未做任何處理的原代巨噬細胞作為對照組；加入acLDL 誘導48 h 轉變的泡沫細胞即為acLDL 組；加入apoA-1 處理12 h 的泡沫細胞即為apoA-1組。

1.2.4 qRT-PCR 實驗 上述不同處理組細胞分別用核酸提取試劑Trizol 提取細胞總RNA，6 孔板每孔加入1 mL Trizol進行裂解。使用Takala逆轉錄試劑盒，將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，隨后用Takala試劑盒進 行qPCR 分 析。PCR 擴增程序為：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，循環(huán)40 次；95 ℃、10 s、65 ℃、60 s、97℃、1 s。以GAPDH 為內(nèi)參，計算SCAMP2 和Rab8a mRNA 相對表達量。SCAMP2、Rab8a、GAPDH 引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成，序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot 實驗 提取的腹腔巨噬細胞鋪入6 孔板（1.2×106個細胞/孔），用50 mg/L acLDL 處理48 h，再用10 mg/L apoA-1作用12 h，對照組不做任何處理。提取不同處理組細胞總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。用10%SDS-PAGE 凝膠將等量的蛋白稀釋樣品進行電泳分離；電泳結束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)在4 ℃、110 V 恒壓下轉移90 min 至PVDF 膜；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別加入SCAMP2、Rab8a、β-tubulin 一抗（1:1 000 稀釋），4 ℃孵育過夜；用1×TBST洗膜3 次，每次10 min，加入相應的二抗（1:2 000 稀釋），室溫孵育1 h；用1×TBST 洗膜3 次，每次10 min；采用Azure Biosystems C400成像系統(tǒng)進行曝光顯影。

1.2.6 免疫共沉淀（Co-IP）實驗 提取腹腔巨噬細胞鋪入10 cm培養(yǎng)皿（7×106個細胞），經(jīng)acLDL和apoA-1處理后，加入500 μL 預冷的含PMSF 的RIPA（弱）蛋白裂解緩沖液，冰上裂解細胞30 min；收集細胞，12 000 r/min、4 ℃離心5 min，收集上清液。每組細胞的裂解產(chǎn)物取50 μL 作為陽性對照（input組），剩余裂解產(chǎn)物平均分成2 份，分別加入2 μg 的免疫球蛋白作為陰性對照（IgG組）和相應SCAMP2、Rab8a、β-tubulin抗體（IP 組），置于4 ℃冰箱交聯(lián)。交聯(lián)過夜后加入30 μL protein A/G 磁珠，常溫交聯(lián)2 h，再次拉下免疫復合物，用裂解緩沖液洗滌。每個樣品加入30 μL 的2×SDS緩沖液，蛋白變性后進行Western blot分析。

1.2.7 免疫熒光（IF）實驗 提取的腹腔巨噬細胞鋪24孔板進行細胞爬片（1.5×105個細胞/孔）。不同處理組的細胞用4%多聚甲醛室溫固定20 min；1×PBS 漂洗3 次，每次5 min，加入含5%BSA 的PBS 緩沖液進行封閉，搖床1 h；加入SCAMP2 抗體、Rab8a 抗體（1:200 稀釋），4 ℃孵育過夜；1×PBS 漂洗3 次，每次時間5 min，加入熒光二抗（1∶1 000 稀釋）室溫孵育1 h；加DAPI 染液200 μL，室溫避光1 min，洗板3 次后封片，使用TCS SP8 共聚焦熒光顯微鏡觀察SCAMP2 和Rab8a的定位和表達情況。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用GraphPad Prism 6.02 軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析及LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 SCAMP2和Rab8基因表達分析

與對照組相比，acLDL 誘導的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2 mRNA 表達增強（P＜0.01）；與acLDL 組相比，apoA-1處理的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2 mRNA表達進一步升高（P＜0.01），見圖1A。用apoA-1 處理泡沫細胞后Rab8a mRNA 表達水平升高，與對照組和acLDL組相比，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見圖1B。

圖1 qRT-PCR檢測巨噬細胞內(nèi)SCAMP2和Rab8a mRNA的表達水平

2.2 SCAMP2和Rab8a的蛋白表達分析

Western blot 分析顯示，apoA-1 處理的泡沫細胞組SCAMP2 和Rab8a 的蛋白表達，與對照組和acLDL組相比均明顯增強，結果見圖2A。與acLDL 組相比，apoA-1處理組SCAMP2蛋白表達升高了38.5%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2B；與acLDL 組相比，apoA-1 處理組Rab8a 蛋白表達升高了30.8%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2C。

圖2 巨噬細胞內(nèi)SCAMP2和Rab8a的蛋白表達分析

2.3 SCAMP2與Rab8a在巨噬細胞內(nèi)的相互作用

免疫共沉淀結果表明，內(nèi)參β-tubulin在兩種抗體處理的不同組細胞中表達量基本一致（圖3A）。與對照組相比，acLDL誘導的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2蛋白與Rab8a蛋白形成復合物，而加入apoA-1介導泡沫細胞膽固醇外流過程中，SCAMP2 蛋白與Rab8a 蛋白的相互作用增強，見圖3B的IP組。

圖3 SCAMP2與Rab8a在巨噬細胞內(nèi)的相互作用分析

2.4 SCAMP2與Rab8a在巨噬細胞內(nèi)的共定位

對不同處理組的巨噬細胞進行免疫熒光染色，結果見圖4。相比于對照巨噬細胞，泡沫細胞內(nèi)SCAMP2（綠色熒光）和Rab8a（紅色熒光）表達均增強。當用apoA-1 處理泡沫細胞介導膽固醇外流時，SCAMP2 和Rab8a 的熒光強度進一步增加，而且兩種蛋白在細胞膜上聚集，二者在細胞質(zhì)膜處的共定位（黃色熒光）表達增強。

圖4 SCAMP2和Rab8a在巨噬細胞內(nèi)的定位觀察

3 討論

分泌載體膜蛋白（SCAMPs）是高爾基體及后高爾基體循環(huán)轉運中的一類載體蛋白，調(diào)控細胞內(nèi)運輸和信號轉導。SCAMPs 家族有5 個成員，即SCAMP1～5，參與細胞內(nèi)囊泡的運輸及細胞內(nèi)物質(zhì)到細胞膜表面的轉運，能加速細胞膜重構，影響胞吞和胞吐融合孔的形成、穩(wěn)定及擴張[8]。SCAMP2 作為分泌囊泡的標記物，早期研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動物細胞中能夠與磷脂酸肌醇4,5-二磷酸（PIP2）相互作用，調(diào)節(jié)囊泡的胞吐過程[9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，SCAMP2 通過其疏水性肽段CWYRPIYKAFR 與PIP2之間發(fā)生靜電相互作用，可抑制胞外分泌[10]。但SCAMP2 是否參與apoA-1 介導的泡沫細胞內(nèi)膽固醇囊泡轉運目前報道較少。為此，我們首先提取小鼠腹腔巨噬細胞，貼壁培養(yǎng)后加入acLDL，誘導形成巨噬細胞源性泡沫細胞。在此基礎上，用apoA-1 進行處理介導泡沫細胞膽固醇外流，分析SCAMP2 在細胞內(nèi)的表達改變。研究發(fā)現(xiàn)，acLDL誘導形成的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2的mRNA 和蛋白水平均升高，提示SCAMP2 參與了apoA-1介導的泡沫細胞膽固醇轉運過程。

Ras 相關蛋白（Rab）是屬于GTP 酶超家族的一類單分子蛋白質(zhì)，大約有70 種，在細胞內(nèi)囊泡運輸過程中發(fā)揮重要作用[11]。Rab GTP 酶充當分子開關，由鳥嘌呤核苷酸交換因子激活后，與GDP 結合的無活性Rab 轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP-Rab 結合形式，并募集特異的效應蛋白，進而調(diào)控囊泡的形成、融合及與質(zhì)膜錨定[12]。小GTP 酶Rab8 在膜轉運中起著重要作用，在分泌途徑中，Rab8 調(diào)節(jié)細胞囊泡從反面高爾基體到質(zhì)膜的運輸，調(diào)節(jié)囊泡與質(zhì)膜的融合，控制胞吐活性[13]。Rab8 包 括Rab8a 和Rab8b 兩種亞型[6]，能調(diào)控細胞膜轉運和囊泡運輸過程。有研究發(fā)現(xiàn)Rab8a 介導的胞內(nèi)脂滴增大可能在帕金森發(fā)病機制中起重要作用[14]，并且Rab8a的72位磷酸化在脂滴融合和增大中發(fā)揮作用[15]。然而，Rab8a 在巨噬泡沫細胞內(nèi)膽固醇囊泡運輸中的作用目前研究較少。我們的實驗發(fā)現(xiàn)，Rab8a mRNA 和蛋白水平在acLDL 誘導形成的泡沫細胞內(nèi)升高，當用apoA-1 處理后，泡沫細胞內(nèi)Rab8a mRNA 和蛋白水平進一步升高，提示Rab8a 參與了apoA-1介導的泡沫細胞膽固醇囊泡轉運過程。

為了分析SCAMP2 蛋白與Rab8a 蛋白在巨噬細胞內(nèi)是否具有相互作用，我們分別用Rab8a 抗體和SCAMP2 抗體在巨噬細胞、泡沫細胞和apoA-1 處理的泡沫細胞的蛋白裂解液中富集蛋白復合物，分析顯示acLDL 誘導的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2 蛋白與Rab8a蛋白形成復合物，提示二者存在相互作用。當用apoA-1處理泡沫細胞后，SCAMP2與Rab8a的相互作用增強，說明兩種蛋白以復合物形式參與了膽固醇的轉運過程。為了進一步驗證這一結果，我們采用免疫熒光實驗分析SCAMP2 蛋白和Rab8a 蛋白在細胞內(nèi)的表達及定位情況。與免疫共沉淀結果一致，通過激光共聚焦顯微鏡觀察到acLDL 誘導的泡沫細胞內(nèi)SCAMP2 的綠色熒光和Rab8a 的紅色熒光增強，而且二者相互作用形成復合物，出現(xiàn)疊加的黃色熒光。apoA-1 處理泡沫細胞后，綠色熒光和紅色熒光進一步增強，并且在細胞質(zhì)膜處出現(xiàn)了更強的黃色熒光，說明兩種蛋白在細胞膜上的共定位。本實驗結果證實了SCAMP2 與Rab8a 在巨噬細胞源性泡沫細胞中具有相互作用，二者以復合物形式參與apoA-1 介導的泡沫細胞內(nèi)膽固醇囊泡轉運，但兩種蛋白之間是否具有直接相互作用及其作用的機制需進一步研究。