楊 悅，卞宏生，王艷艷，于 爽，李廷利，黃莉莉

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

狀態(tài)性焦慮是指某一特定情境引起的短暫情緒狀態(tài)，與交感神經(jīng)系統(tǒng)活動暫時增強有關(guān)[1]。而睡眠與情緒大腦之間存在密切關(guān)系，睡眠-覺醒行為通過不同腦區(qū)各類核團的相互制約來調(diào)控[2]。臨床研究表明，患有焦慮癥的人出現(xiàn)睡眠障礙癥狀的風(fēng)險更高[3]，同時睡眠不足將導(dǎo)致狀態(tài)性焦慮水平增加[4]。Ramos等[5]提出的Triple test裝置是將經(jīng)典的曠場(open field，OF)、高架十字迷宮(elevated plus maze，EPM)和明暗穿梭箱(light/dark box，LDB)物理整合，不僅用于狀態(tài)性焦慮模型的復(fù)制和評價，還可用于藥物篩選和檢測與焦慮相關(guān)的遺傳差異[6]。且經(jīng)本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，其復(fù)制的狀態(tài)性焦慮模型小鼠存在明顯的探究行為抑制與HPA軸亢進[7]，但該模型下小鼠睡眠-覺醒周期的變化尚不明確。為進一步了解狀態(tài)性焦慮與睡眠-覺醒行為之間的關(guān)系，在Triple test裝置復(fù)制小鼠狀態(tài)性焦慮模型基礎(chǔ)上，利用皮層腦電記錄與分析技術(shù)觀察狀態(tài)性焦慮對小鼠睡眠-覺醒周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康雄性ICR小鼠18只，SPF級，體質(zhì)量(25～30)g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥物安全評價中心。許可證號：SCXK(黑)2013-004。

1.2 實驗條件小鼠飼養(yǎng)于獨立通氣籠(IVC)中，恒定光照條件(早7 ∶00照明，晚19 ∶00熄燈)，光照強度：300 lux。室溫：(23±1) ℃，相對濕度：(55±5)%。按體質(zhì)量分籠飼養(yǎng)(6只/籠)并自由攝取食水。

行為測試環(huán)境：相對濕度：(55±5)%；環(huán)境溫度：(22±2) ℃；環(huán)境噪音≤ 40 dB；實驗期間，所有光照均來自Triple Test實驗裝置的光源，光照強度：LDB明箱：750 lux，LDB暗箱：20 lux，EPM：15 lux，OF：10 lux

屏蔽室監(jiān)測環(huán)境：恒溫(24±1) ℃、恒濕(55±10)%、恒定光照條件(早7 ∶00照明，晚19 ∶00熄燈)的屏蔽室中進行，監(jiān)測環(huán)境通氣、隔音。

1.3 主要儀器設(shè)備RU25H5型獨立通氣籠IVC(蘇杭科技器材有限公司)；51600型小鼠腦立體定位儀(美國Stoelting公司)；MP150型十六導(dǎo)生理信號記錄儀(美國BIOPAC公司)；三重復(fù)合裝置(自制；Triple test)。

1.4 狀態(tài)性焦慮小鼠模型復(fù)制與行為學(xué)評價

1.4.1狀態(tài)性焦慮小鼠模型復(fù)制 Triple test實驗裝置[6]由OF、EPM、LDB整合而成(Fig 1)，OF由白色木板構(gòu)成包括55 cm(L)×55 cm(W)的底板(等分為25個方格，中央?yún)^(qū)9格，周邊區(qū)16格)和30 cm(H)的圍墻。EPM由黑色木板構(gòu)成，包括5 cm(L)×30 cm(W)×15 cm(H)的相對閉臂和5 cm(L)×30 cm(W)的相對開臂，開臂有0.5 cm防掉落的邊緣突起，EPM閉臂兩側(cè)分別通過5 cm×5 cm的開口連通OF和LDB。LDB由白板和黑板構(gòu)成，包括27 cm(L)×27 cm(W)×27 cm(H)的明箱和27 cm(L)×18 cm(W)×27 cm(H)的暗箱，分隔明暗兩側(cè)的是27 cm(W)×30 cm(H)的隔板，隔板底部中央有5 cm×5 cm的開口可連通。整個裝置提升至距離地面0.5 m。

Fig 1 Triple test

制備方法：模型于每日13 ∶00-18 ∶00進行。將實驗動物提前30 min分單籠置于Triple Test裝置所在環(huán)境中適應(yīng)。實驗開始時，提取鼠尾，將實驗動物置于OF正中央格背朝OF開口一側(cè)釋放同時開始計時，每只動物自由探索裝置15 min。實驗結(jié)束后取出實驗動物，放回原籠，運回飼養(yǎng)室，并用10%酒精清潔箱體，去除異味及動物排泄物。

1.4.2行為學(xué)評價指標(biāo)及判斷標(biāo)準(zhǔn) 通過錄像采集或計算每只小鼠在Triple test裝置中15 min的如下行為參數(shù)：

OF：中央格運動時間(OF inner time)：

四肢全部進入到中央9格區(qū)的總時間

中央格運動時間%(OF inner time %)：

EPM：開臂停留時間(EPM open time)：

四肢全部進入開臂的總時間

開臂停留時間%(EPM open time %)：

開臂進入次數(shù)(EPM open entries)：

四肢全部進入開臂的頻次之和

開臂進入次數(shù)%(EPM open entries%)：

LDB：明箱停留時間(LDB time in light)：

四肢全部進入明區(qū)的總時間

暗箱停留時間(LDB time in black)：

四肢全部進入暗區(qū)的總時間

明箱停留時間%(LDB time in light %)：

穿梭運動次數(shù)(LDB transitions)：

四肢全部從一區(qū)跨入另一區(qū)頻次之和

1.5 小鼠的腦電記錄與分析

1.5.1小鼠皮層腦電電極與肌電電極埋置 實驗動物先用水合氯醛經(jīng)腹腔注射麻醉后，將其固定于腦立體定位儀上。用碘酒棉將小鼠頭頂浸潤消毒。電極埋置：無菌暴露顱骨，酸蝕劑去除組織筋膜，鹽水清潔顱骨表面后于前囟前1 mm，額骨中線旁開1.5 mm；人字縫前1 mm，頂骨中線旁開1.5 mm處分別插入2根腦電電極，使接觸硬腦膜，并用牙托粉進行固定。術(shù)后將小鼠置于有機玻璃籠內(nèi)單籠飼養(yǎng)恢復(fù)1周，自由攝取食水，并連續(xù)3 d經(jīng)腹腔注射青霉素。

1.5.2小鼠腦電圖(electroencephalogram，EEG)和肌電圖(electromyogram，EMG)分析判斷標(biāo)準(zhǔn) 恢復(fù)期后小鼠置于屏蔽室，將頭部插座與十六導(dǎo)生理記錄儀相連，調(diào)試設(shè)備，描記EEG和EMG信號，Sleep Sign 3.0軟件分析(10s/幀)，監(jiān)測指標(biāo)的記錄和判斷如下：

(1)覺醒時間(Wake)和覺醒所占比例(Wake%)：EEG信號呈現(xiàn)不規(guī)則的低幅度高頻波動；EMG呈現(xiàn)高幅波動(Fig 2)。

Fig 2 Awakening

(2)非快動眼睡眠時間(NREMS)和非快動眼睡眠時相所占比例(NREMS%)：EEG呈現(xiàn)高振幅慢波和特征性的紡錘波；EMG明顯減弱(Fig 3)。

Fig 3 Non-rapid eye movement sleep

(3)快動眼睡眠時間(REMS)和快動眼睡眠時相所占比例(REMS%)：EEG呈現(xiàn)低幅高頻θ波；EMG基本消失(Fig 4)。

Fig 4 Rapid eye movement sleep

1.6 狀態(tài)性焦慮小鼠睡眠-覺醒周期的變化實驗動物經(jīng)皮層腦電埋置術(shù)后恢復(fù)，按上述測試條件，將小鼠移至腦電描記室，連接電極插座，連續(xù)描記24 h的EEG和EMG信號，以作為模型復(fù)制前腦電圖的基線對照。腦電圖描記后次日的13：00進行小鼠狀態(tài)性焦慮造模(d 1)，每只鼠測試15 min，測試完成后再次連接十六導(dǎo)生理記錄儀，連續(xù)描記24 h的腦電圖。每日1次，連續(xù)7 d。

2 結(jié)果

2.1 狀態(tài)性焦慮小鼠的行為學(xué)評價

2.1.1狀態(tài)性焦慮小鼠OF中的行為學(xué)變化 結(jié)果見Fig 5。OF中行為學(xué)評價結(jié)果表明，與造模d 1相比，狀態(tài)性焦慮小鼠OF中央運動時間d 4、5、7明顯減少(P<0.05；P<0.01)，OF中央運動時間% d 3-5明顯降低(P<0.05；P<0.01)，呈現(xiàn)OF中探究行為的抑制。

Fig 5 Time and its % time spent in central area of OF

2.1.2狀態(tài)性焦慮小鼠EPM中的行為學(xué)變化 結(jié)果見Fig 6。EPM中行為學(xué)評價結(jié)果表明，與造模d 1相比，狀態(tài)性焦慮小鼠開臂進入時間及時間%、開臂進入次數(shù)及次數(shù)%均呈逐日上升趨勢，d 4開始均具顯著變化(P<0.01)。

Fig 6 Time and its % time spent in open arms of EPM, number of open arm entries and its % entries n=18)

2.1.3狀態(tài)性焦慮小鼠LDB中的行為學(xué)變化 結(jié)果見Fig 7。LDB中行為學(xué)評價結(jié)果表明，與造模d 1相比，狀態(tài)性焦慮小鼠明箱運動時間及時間%、穿梭運動次數(shù)在d 5～7均明顯增加(P<0.05，P<0.01)。暗箱運動時間于d 2(P<0.01)、d 4(P<0.05)明顯增加。

Fig 7 Time spent and frequency of transitions of LDB n=18)

2.2 狀態(tài)性焦慮小鼠睡眠-覺醒周期的變化

2.2.1狀態(tài)性焦慮小鼠睡眠-覺醒時間的變化 結(jié)果見Fig 8。腦電圖分析結(jié)果表明，與基線睡眠相比，狀態(tài)性焦慮小鼠Wake時間明顯延長，同時NREM睡眠時間明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，REM睡眠時間偶見明顯延長(P<0.05)。且相比于夜間，日間覺醒-睡眠時間的改變更加明顯。

Fig 8 Changes in awakening-sleep time in mice with state n=18)

2.2.2狀態(tài)性焦慮小鼠覺醒-睡眠時相的變化 結(jié)果見Fig 9。腦電圖分析結(jié)果表明，與基線睡眠相比，狀態(tài)性焦慮小鼠Wake時間比例明顯增加，同時NREMS時間比例明顯下降(P<0.05,P<0.01)，REMS時間比例偶見明顯升高(P<0.05)。且相比于夜間，日間覺醒-睡眠時相的改變更加明顯。

Fig 9 Changes in awakening-sleep phase in mice with state anxiety n=18)

3 討論

焦慮癥和睡眠障礙之間往往存在著緊密聯(lián)系，失眠是廣泛性焦慮癥的一個癥狀標(biāo)準(zhǔn)，且睡眠不足可能賦予患焦慮癥及相關(guān)疾病的風(fēng)險[8-9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，Triple test裝置復(fù)制的狀態(tài)性焦慮小鼠呈現(xiàn)明顯的焦慮樣行為伴有HPA軸失調(diào)，但未對狀態(tài)性焦慮小鼠的睡眠活動進行監(jiān)測。因此，本實驗應(yīng)用Triple test裝置復(fù)制小鼠狀態(tài)性焦慮模型，同時進行腦電圖描記，探討狀態(tài)性焦慮對睡眠-覺醒周期的影響。

焦慮動物模型的復(fù)制方法諸多，在非條件化動物模型中OF、EPM和LDB最為常見，當(dāng)前的觀點認為圍繞OF、EPM、LDB間焦慮指標(biāo)的相互關(guān)系很少，行為變量的主成分分析體現(xiàn)在不同的因素上，表明不同測試反映了情感的不同維度，那么應(yīng)用單獨的測試來評估情緒是不夠全面的，而一系列不同的測試又存在先前測試經(jīng)驗對后續(xù)測試的影響[10]。Triple test作為經(jīng)典的焦慮測試裝置的集成，實現(xiàn)了同時進行情緒的多維度考察，最大程度減輕了相繼測試所致的混淆影響，還可與運動活性的變化區(qū)分開，被證明是一種焦慮和一般活動性的可靠測量方式[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn)，狀態(tài)性焦慮小鼠呈現(xiàn)明顯的探究性行為抑制，表明Triple test可復(fù)制和評價小鼠的狀態(tài)性焦慮模型，且前4 d表現(xiàn)更多的焦慮樣行為。

腦電圖是客觀反映睡眠架構(gòu)的重要指標(biāo)，是國際公認的評價參數(shù)[11]，可用于睡眠-覺醒周期的分析。焦慮對睡眠的影響多體現(xiàn)在睡眠時長、睡眠連續(xù)性、睡眠深度和REM睡眠壓力的改變[8]。相關(guān)報道指出，高焦慮個體往往存在睡眠深度的抑制，而NREM睡眠對于抵抗焦慮癥的發(fā)展至關(guān)重要[12-13]。研究在模型復(fù)制基礎(chǔ)上探討了焦慮與睡眠之間的關(guān)系，得知狀態(tài)性焦慮小鼠伴有覺醒-睡眠時間和睡眠時相的改變，表現(xiàn)為約束小鼠的睡眠時長和睡眠深度及REM睡眠壓力的偶見升高，且指標(biāo)上看對日間睡眠的影響更加明顯。

另外，經(jīng)查閱文獻得知基底外側(cè)杏仁核(BLA)和中央杏仁核(CeA)在焦慮過程中起著特別重要的作用。BLA與內(nèi)側(cè)前額葉皮層(mPFC)的交互連接與焦慮密切相關(guān)[14]，BLA接收來自丘腦和前額葉皮質(zhì)的感覺信息傳入，激活CeA后向腦內(nèi)不同靶區(qū)進行投射，從而呈現(xiàn)不同的焦慮樣反應(yīng)[15]。目前認為杏仁核可以驅(qū)動覺醒中樞興奮，而在睡眠-覺醒狀態(tài)的調(diào)節(jié)過程中食欲素(orexin，包括orexin-A和orexin-B)發(fā)揮重要作用，它是由下丘腦外側(cè)區(qū)orexins神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)，可作用于上行網(wǎng)狀激活系統(tǒng)，使睡眠縮短而覺醒程度增加[16]。研究發(fā)現(xiàn)，腦室內(nèi)灌注orexin-A可引起焦慮樣行為，表現(xiàn)為OF的中央運動時間和EPM開臂時間減少[17]。而orexin缺乏會減弱谷氨酸能激活下丘腦外側(cè)區(qū)產(chǎn)生的喚醒行為[18]。因此，推測焦慮引起的睡眠-覺醒周期的改變可能與杏仁核驅(qū)動的下丘腦外側(cè)區(qū)釋放orexin增加有關(guān)。為今后探討相關(guān)機制豐富理論基礎(chǔ)，且作為初步研究與狀態(tài)性焦慮和睡眠-覺醒周期相關(guān)的藥效學(xué)研究有待進一步開展。