宋夢瑤，宋 莉，周銀銀，賈 琦，李曉曼，2，陸 茵，2，3

(南京中醫(yī)藥大學(xué) 1.藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點實驗室、2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心、3.江蘇省中醫(yī)藥與再生醫(yī)學(xué)研究國際合作聯(lián)合實驗室 江蘇 南京 210023)

越來越多的證據(jù)表明，正如健康組織需要神經(jīng)調(diào)節(jié)、支配身體穩(wěn)態(tài)一樣，腫瘤也需要神經(jīng)程序來促進(jìn)其生長和發(fā)展[1]。腫瘤自身增殖與轉(zhuǎn)移依賴于神經(jīng)新生早已得到臨床證實。類似于腫瘤血管新生，腫瘤細(xì)胞釋放神經(jīng)營養(yǎng)因子，通過腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)直接或間接地作用于腫瘤周圍的外周神經(jīng)末梢，誘導(dǎo)軸突新生，促進(jìn)神經(jīng)生長。

腫瘤內(nèi)神經(jīng)新生過程產(chǎn)生了復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)改變。在神經(jīng)發(fā)育和再生過程中，神經(jīng)生長受神經(jīng)支配靶器官釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子調(diào)控。神經(jīng)末梢突觸釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和其他營養(yǎng)因子可以激活腫瘤細(xì)胞上相應(yīng)的神經(jīng)遞質(zhì)受體，加速腫瘤組織內(nèi)神經(jīng)軸突的新生。反之，腫瘤細(xì)胞最終在神經(jīng)周圍生長或侵入神經(jīng)，這一過程稱為神經(jīng)周圍侵襲或神經(jīng)浸潤(peripheral nerve invasion，PNI)。神經(jīng)生長不斷向外擴(kuò)散各類神經(jīng)遞質(zhì)，一方面激活了腫瘤的生長與轉(zhuǎn)移，另一方面促進(jìn)了神經(jīng)浸潤腫瘤。神經(jīng)的大量新生刺激了腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，而神經(jīng)最終也會被腫瘤細(xì)胞包圍、侵入。神經(jīng)-腫瘤細(xì)胞的這種相互干擾最終達(dá)到神經(jīng)新生與腫瘤發(fā)生發(fā)展二者相互促進(jìn)的終效應(yīng)。近幾年，基因工程與影像學(xué)的最新進(jìn)展使人們對腫瘤神經(jīng)調(diào)節(jié)的分子基礎(chǔ)與機(jī)制有了更加深入的了解。在臨床研究證據(jù)的推動下，以靶向神經(jīng)和TME之間的相互作用治療癌癥為目標(biāo)，新的轉(zhuǎn)化治療技術(shù)與方法正在開發(fā)。本文對神經(jīng)新生在調(diào)控腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移中的作用以及針對于神經(jīng)新生在檢測技術(shù)與治療方法上所面臨的困難與策略進(jìn)行綜述。

1 腫瘤神經(jīng)新生改變腫瘤微環(huán)境

TME是一個包含有腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、免疫細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等各種物質(zhì)的微生態(tài)環(huán)境。神經(jīng)細(xì)胞在其中也發(fā)揮了重要的作用，因此，神經(jīng)系統(tǒng)與TME之間的相互作用極大程度上影響了神經(jīng)新生與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移。神經(jīng)-腫瘤微環(huán)境誘發(fā)的神經(jīng)新生，為腫瘤細(xì)胞提供了良好的生長環(huán)境。

1.1 神經(jīng)生長因子驅(qū)動神經(jīng)新生加速腫瘤發(fā)展目前研究發(fā)現(xiàn)，受神經(jīng)支配的靶器官釋放的神經(jīng)營養(yǎng)因子包括神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(neurotrophic protein 3，NT3)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(neurotrophic protein 4/5，NT4/5)等。以上神經(jīng)營養(yǎng)因子均已被證明可通過刺激神經(jīng)末梢中的酪氨酸激酶受體驅(qū)動神經(jīng)新生[2]。其中NGF是最早被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)新生中發(fā)揮著主要驅(qū)動作用的重要神經(jīng)營養(yǎng)因子。前期研究表明，NGF在前列腺癌、胃癌、胰腺癌[3-4]等癌癥的神經(jīng)支配過程中發(fā)揮重要作用。除此之外，粒細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)、神經(jīng)生長因子前體(nerve growth factor precursor，proNGF)對前列腺癌也表現(xiàn)出類似的驅(qū)動作用[5]。

NGF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子內(nèi)最重要的組成部分，與腫瘤內(nèi)神經(jīng)新生有密切關(guān)系。三分之一的浸潤性導(dǎo)管乳腺癌內(nèi)會檢測到神經(jīng)，神經(jīng)密度與腫瘤的侵襲性以及腫瘤細(xì)胞釋放的NGF有關(guān)[6]。Ayala等[7]發(fā)現(xiàn)前列腺腫瘤部位釋放的NGF會驅(qū)動神經(jīng)軸突新生，高組織病理學(xué)分級的前列腺癌區(qū)域比低等級或良性前列腺增生的區(qū)域存在更多的神經(jīng)。同時，前列腺癌細(xì)胞proNGF的產(chǎn)量增加與TME中的神經(jīng)密度成正比，表明proNGF/NGF是前列腺癌腫瘤神經(jīng)新生的分子介質(zhì)。Rowe等[8]通過組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，與正常的甲狀腺組織相比，proNGF在甲狀腺腫瘤組織內(nèi)有所增加，并且病理評分顯示其在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的染色強(qiáng)度明顯高于相應(yīng)的原發(fā)性腫瘤。但是，proNGF在血清中的高表達(dá)卻與甲狀腺癌的發(fā)生與否無關(guān)[9]。

NGF還是疼痛的誘導(dǎo)因素。腫瘤對神經(jīng)造成的壓迫導(dǎo)致了癌癥患者的痛苦，多項研究表明在腫瘤治療中靶向NGF是一種有效減緩患者疼痛的手段[10]。鑒于NGF在腫瘤神經(jīng)支配中的作用，未來神經(jīng)營養(yǎng)因子完全可以用作癌癥診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物。

1.2 神經(jīng)新生誘導(dǎo)腫瘤血管生成血管新生是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，軸突引導(dǎo)生長分子如神經(jīng)肽和信號素可以調(diào)控血管生成。在腫瘤血管生成的治療過程中，已發(fā)現(xiàn)部分軸突引導(dǎo)分子能夠通過有效抑制腫瘤血管生成途徑抑制腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移。Plexin-A4作為一種神經(jīng)纖毛蛋白傳遞配體，通過與FGFR1和VEGFR-2酪氨酸激酶受體形成穩(wěn)定的復(fù)合物，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF誘導(dǎo)的VEGFR-2磷酸化以及bFGF誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖[11]。來源于神經(jīng)系統(tǒng)信號素能夠通過調(diào)節(jié)VEGF促進(jìn)腫瘤相關(guān)的血管生成。Sema3B是一種分泌型信號素，研究表明Sema3B的過表達(dá)可以抑制肺癌、乳腺癌細(xì)胞的增殖。除了對腫瘤細(xì)胞的抑制作用外，Sema3B還可以通過Nrp1排斥內(nèi)皮細(xì)胞，因此被認(rèn)為可以作為血管生成抑制劑[12]，而Sema3E誘導(dǎo)Arf6激活可以誘導(dǎo)快速粘著斑分解和內(nèi)皮細(xì)胞塌陷，進(jìn)而抑制血管生成[13]。

1.3 神經(jīng)新生觸發(fā)腫瘤免疫微環(huán)境改變?nèi)~因子2(trefoil factor 2，TFF2)是一種脾臟產(chǎn)生的分泌肽，可與ChAT-EGFP共定位，標(biāo)記CD4+T細(xì)胞。TFF2受到炎癥反射的調(diào)節(jié)，在急性狀態(tài)下，炎癥反射導(dǎo)致記憶性CD4+T細(xì)胞釋放乙酰膽堿，抑制巨噬細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α，最終阻止了髓源性抑制細(xì)胞的增殖與發(fā)展[14]。內(nèi)源性大麻素，被稱為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)調(diào)節(jié)劑，控制著免疫細(xì)胞的分泌特性。可以直接靶向白細(xì)胞，并通過抑制P物質(zhì)(substancep，SP)和降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin-gene related peptide，CGRP)發(fā)揮其神經(jīng)學(xué)作用[15]。在受損神經(jīng)中，巨噬細(xì)胞衍生的IL-1β誘導(dǎo)非神經(jīng)元細(xì)胞中NGF的合成。炎癥過程會誘導(dǎo)白細(xì)胞的積累和疼痛相關(guān)介質(zhì)的釋放，促進(jìn)神經(jīng)元可塑性和外周神經(jīng)支配[16]。當(dāng)巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞和其他白細(xì)胞釋放NGF時，可以促進(jìn)腫瘤神經(jīng)支配的軸突轉(zhuǎn)換，通過招募腦源性神經(jīng)前體促進(jìn)癌癥進(jìn)展。M2型巨噬細(xì)胞在功能上被募集并有助于神經(jīng)修復(fù)，而M1型巨噬細(xì)胞的功能是破壞受傷的神經(jīng)[17]。巨噬細(xì)胞可以通過分泌VEGF再生受損的神經(jīng)，而施萬細(xì)胞使用VEGF來遷移和引導(dǎo)神經(jīng)生長。此外，mTOR-Sema6D-PPARγ軸在巨噬細(xì)胞極化中起關(guān)鍵作用。mTOR的抑制或Sema6D的缺失阻斷了抗炎巨噬細(xì)胞極化，伴隨著PPARγ表達(dá)、脂肪酸攝取和脂質(zhì)代謝重編程的嚴(yán)重受損[18]。

1.4 其他交感神經(jīng)與副交感神經(jīng)元釋放能激活感覺神經(jīng)元的分子，而感覺神經(jīng)元的切除可顯著減緩瘤變損傷的發(fā)展[4]。Chen等[19]發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)內(nèi)分泌激活會極大提高乳腺癌的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移率。轉(zhuǎn)移過程中，β-腎上腺素能信號參與了CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞向原發(fā)性乳腺癌部位的浸潤，進(jìn)而發(fā)出促轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)信號。

研究發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)和胰腺癌細(xì)胞之間存在旁分泌NGF信號[20]。此外，其他腫瘤細(xì)胞的體外實驗同樣證實了腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生外泌體可以誘導(dǎo)腫瘤神經(jīng)支配[21]，這一發(fā)現(xiàn)為腫瘤的神經(jīng)發(fā)生提供了不一樣的研究途徑，增加了神經(jīng)元分泌的外泌體可能作為具有臨床重要性和實用性的新型癌癥生物標(biāo)志物的可能。高級膠質(zhì)瘤分泌的NLGN3在腦TME中發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤生長的作用。國際癌癥基因組聯(lián)合會對甲狀腺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)多種癌癥類型均發(fā)生NLGN3突變和拷貝數(shù)變異。此外，GRP78和BDNF同樣被鑒定為可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的增殖[22]。SLIT/ROBO信號傳統(tǒng)上被描述為軸突引導(dǎo)的胚胎調(diào)節(jié)器基因。Bapat等[20]通過外顯子組測序及拷貝數(shù)分析確定出該信號是導(dǎo)致胰腺組織癌變的突變基因，并存在頻繁和多樣的體細(xì)胞異常。這一發(fā)現(xiàn)為軸突導(dǎo)向基因參與胰腺癌的發(fā)生提供了有力的支持性證據(jù)。

綜上所述，神經(jīng)新生已成為判斷腫瘤發(fā)展的潛在標(biāo)志，同時腫瘤細(xì)胞釋放的NGF似乎是TME中神經(jīng)浸潤的主要驅(qū)動力。

2 腫瘤神經(jīng)新生的標(biāo)志物探討

目前，腫瘤微環(huán)境內(nèi)軸突新生與神經(jīng)新生介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展檢測的方法學(xué)尚未有成熟的技術(shù)報道。受諸多因素阻礙，臨床前研究涉及到腫瘤的病理學(xué)與神經(jīng)相關(guān)標(biāo)志物檢測兩個方面。在臨床角度，常規(guī)腫瘤的組織結(jié)構(gòu)中很難觀察到神經(jīng)，通常只有大神經(jīng)在病理檢查中可見。然而，TME中所存在的多數(shù)神經(jīng)都是小神經(jīng)纖維，這對于腫瘤神經(jīng)浸潤的病理及實驗結(jié)果的分析帶來了一定的困難。

采用蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫組學(xué)相結(jié)合對腫瘤的生物標(biāo)志物進(jìn)行探索是目前腫瘤神經(jīng)檢測的主要方式。研究多采用免疫組化方法檢測特定神經(jīng)元生物標(biāo)記物，如泛神經(jīng)標(biāo)記物PGP9.5就是一種廣泛用于所有神經(jīng)類型的組化標(biāo)記物。此外，還有許多特定類型的神經(jīng)元生物標(biāo)記物，如外周神經(jīng)元表達(dá)Ⅲ型中間絲蛋白，以及微管蛋白β-3。囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運蛋白可區(qū)分出膽堿能神經(jīng)；酪氨酸羥化酶可有效區(qū)分腎上腺素能神經(jīng)[3]；Brundl等[23]使用神經(jīng)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白或S100進(jìn)行免疫染色，在TME中鑒定出外周神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；Dobrenis等在實驗中運用抗微管結(jié)構(gòu)蛋白(microtubule associated protein 2，MAP2)和抗磷酸化神經(jīng)絲-H(phosphorylated neurofilament-H，pNF-H)對神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行染色評估神經(jīng)突起情況[2]。此外，OLMF4多肽在神經(jīng)系統(tǒng)的早期發(fā)育和功能組織中發(fā)揮作用，已被確定為在結(jié)直腸癌中上調(diào)的癌癥生物標(biāo)志物[6]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示OLMF4在胃癌、胰腺癌、頭頸癌和前列腺癌中也存在類似上調(diào)，同時在乳腺癌檢測中，它的表達(dá)還與腫瘤的病理分級呈現(xiàn)正相關(guān)[24]。LIF可作為胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDA)的有效生物標(biāo)志物，Bressy等[25]還發(fā)現(xiàn)對LIF誘導(dǎo)的PDA進(jìn)行信號靶向治療可以限制PDA相關(guān)神經(jīng)重構(gòu)。此外，研究中還常將病理標(biāo)本進(jìn)行組織微陣列檢測和GS評分，并將結(jié)果與免疫組化或免疫熒光中的標(biāo)記物檢測相結(jié)合來對樣本進(jìn)行更加精確、特異性的分析。

3 針對神經(jīng)軸突新生的治療策略

腫瘤軸突發(fā)生與癌癥診斷、預(yù)后和治療等潛在臨床應(yīng)用有關(guān)。靶向神經(jīng)營養(yǎng)生長因子、去神經(jīng)支配、抑制外泌體分泌均是針對神經(jīng)軸突新生的治療策略。臨床前研究可以采用動物模型研究這些治療策略，但是目前在臨床中具體實施尚存在一定的難度與挑戰(zhàn)性。

3.1 靶向神經(jīng)營養(yǎng)因子通過靶向與腫瘤軸突新生有關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子來抑制腫瘤支配是一種較為合適的治療策略。NGF具有神經(jīng)營養(yǎng)作用，可以驅(qū)動腫瘤軸突新生，因此靶向NGF可以防止TME中神經(jīng)的生長[26]。雖然NGF對于軸突新生必不可少，但在成年個體中一旦組織的神經(jīng)支配被建立，NGF便失去活性，不再參與神經(jīng)元的維持。有趣的是，它依然可以通過原肌球蛋白受體激酶(tropomyosin receptor kinase，TrkA)來介導(dǎo)疼痛[27]。因此腫瘤發(fā)展的早期階段靶向NGF具有同時解決腫瘤發(fā)生發(fā)展及腫瘤壓迫所引起的疼痛的獨特潛力。

3.2 去神經(jīng)支配動物模型中應(yīng)用去神經(jīng)支配治療已經(jīng)取得成功，但真正在臨床中實施還存在較大的爭議與挑戰(zhàn)。首先手術(shù)難度大；其次準(zhǔn)確發(fā)現(xiàn)在腫瘤中起主要作用的神經(jīng)纖維或調(diào)控部位是目前臨床前及臨床研究所未能解決的問題?；诖搜苌隽艘环N治療方案：將神經(jīng)毒性藥物注射到腫瘤，靶向抑制神經(jīng)元。肉毒桿菌毒素作為一種膽堿能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制劑，可以通過模擬自主神經(jīng)廣泛用于肌肉痙攣等臨床問題。目前肉毒桿菌毒素對腫瘤去神經(jīng)支配的作用已經(jīng)在動物模型中進(jìn)行測試，基于肉毒桿菌毒素的前列腺神經(jīng)支配的第一階段臨床試驗結(jié)果已經(jīng)可用[28]。這從側(cè)面反映出膽堿能信號確實參與腫瘤生長，并且去神經(jīng)支配這一途徑可用于輔助癌癥的治療及預(yù)后。未來臨床中，腫瘤的去神經(jīng)化治療將會逐漸走入人們視野。

3.3 腎上腺素受體阻滯劑近幾年腎上腺素受體阻滯劑在腫瘤領(lǐng)域嶄露頭角，例如，普萘洛爾(β-腎上腺素受體阻滯劑)對前列腺癌、乳腺癌和卵巢癌等癌癥的增殖、轉(zhuǎn)移均展現(xiàn)出治療效果。對于慢性應(yīng)激通過促進(jìn)去甲腎上腺素(α-腎上腺素受體激動劑)釋放加速腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移已有不少研究[29]。這提供了一種可能——阻斷腎上腺素釋放途徑可能會通過控制神經(jīng)支配以抑制腫瘤細(xì)胞中腎上腺素受體的表達(dá)，進(jìn)而阻止交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素，起到抑制腫瘤發(fā)展的作用。然而，這其中真正發(fā)揮作用的機(jī)制目前還沒有明確闡述。這一治療方法未來應(yīng)用于臨床可能為患者帶來普適性的治療效果。

最近一項研究顯示，在前列腺癌小鼠模型中，來自中樞神經(jīng)系統(tǒng)腦室下區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞隨著血液遷移到前列腺腫瘤部位。神經(jīng)祖細(xì)胞表達(dá)了雙皮質(zhì)醇(double cortisol，DCX)滲透到前列腺腫瘤中啟動了神經(jīng)發(fā)生，并能產(chǎn)生新的腎上腺素能神經(jīng)元[30]。這一現(xiàn)象揭示了中樞神經(jīng)系統(tǒng)和前列腺腫瘤之間一種獨特的相互干擾模式，提示了腫瘤治療可能的一種新的神經(jīng)靶向方案。

4 總結(jié)與展望

神經(jīng)是腫瘤發(fā)生發(fā)展研究中的新型調(diào)節(jié)器。通過TME內(nèi)各類神經(jīng)營養(yǎng)因子與神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，神經(jīng)新生與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間相互作用、相互促進(jìn)。臨床研究也針對神經(jīng)新生采取了靶向NGF、去神經(jīng)支配等治療策略。在過去幾年，已經(jīng)有大量開創(chuàng)性的科學(xué)研究分別從不同方面證實了神經(jīng)在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中存在著的驅(qū)動作用。

腫瘤神經(jīng)新生的檢測與癌癥診斷、臨床應(yīng)用及預(yù)后均存在重要聯(lián)系。大量研究表明，神經(jīng)密度在原發(fā)性腫瘤中增加，并且與轉(zhuǎn)移性或侵襲性疾病有關(guān)。量化神經(jīng)密度有助于區(qū)分腫瘤的進(jìn)展情況。此外，檢測和量化驅(qū)動腫瘤軸突新生的神經(jīng)營養(yǎng)因子也具有極大的診斷和預(yù)后價值。目前，臨床仍有大量的癌癥診斷需要對神經(jīng)浸潤程度進(jìn)行檢測以確定癌癥的發(fā)展階段。因此，急需開發(fā)更加便捷、敏銳的檢測手段與方法應(yīng)用于臨床。腫瘤神經(jīng)生物學(xué)這一新興的領(lǐng)域會有更多的科研學(xué)者及臨床專家們給予關(guān)注。與此同時也為腫瘤的診斷、治療、預(yù)后帶來了新的突破與挑戰(zhàn)。