曾 挺，郭媛媛，郭婕妤，劉 超，劉 武

(湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部 1.藥學(xué)院、2.糖尿病與心腦血管病變湖北省重點實驗室，湖北 咸寧 437100)

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interactions，PPIs)是細胞生命活動的基礎(chǔ)，以BioID和APEX為代表的蛋白質(zhì)鄰近標記技術(shù)逐漸被應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用研究[1, 2]。由于蛋白的相互作用大多是依靠氫鍵、鹽鍵和疏水相互作用力進行，它們的空間距離都非常的短，所以通常認為互作的蛋白必定相互鄰近[3]。TurboID是一種比BioID或APEX具有更高催化效率的蛋白質(zhì)(標記時間從18 h縮短至10 min)，由于很多蛋白發(fā)揮的結(jié)合與催化作用是很短暫的，理論上利用這個技術(shù)可以找到一些比較新穎的結(jié)合蛋白[4]。大量研究表明，F(xiàn)OXO1調(diào)控許多靶點，如參與細胞凋亡和自噬的基因、抗氧化酶、細胞周期阻滯基因以及代謝和免疫調(diào)節(jié)因子[5-6]，被認為是一種具有復(fù)雜活性的超級轉(zhuǎn)錄因子。因此，我們將利用TurboID的高效性來尋找FOXO1的互作蛋白。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人胚腎上皮細胞株293T及星形膠質(zhì)細胞株U251，均保存于實驗室。脂質(zhì)體核酸轉(zhuǎn)染試劑、胰酶、嘌呤霉素和慢病毒濃縮試劑盒，均購自上海翊圣生物科技有限公司;銀染試劑盒，購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；相關(guān)抗體購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；全基因合成、引物及測序服務(wù)均由北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2 FOXO1-TurboID過表達質(zhì)粒的構(gòu)建TurboID-flag基因序列經(jīng)全基因合成并替換EGFP連接上plenti-cmv-EGFP質(zhì)粒，即為plenti-cmv-TurboID，以人的cDNA為模板擴增FOXO1基因(引物FOXO1-F：ATAGAAGACACCGACTCTAG AATGGCCGAGGCGCCTCAG；FOXO1-R：GGGGTATACGTATACGGATCCGCCTGACACCCAGCTATGTGTC)，將其片段重組上線性化的plenti-cmv-TurboID質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)化，涂板，篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定后送公司測序，測序正確的質(zhì)粒命名為FOXO1-TurboID。

1.3 FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP質(zhì)粒的慢病毒包裝將質(zhì)粒FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP分別與慢病毒包裝質(zhì)粒利用293T細胞進行慢病毒包裝，再使用慢病毒濃縮試劑將細胞培養(yǎng)基進行處理得到病毒濃縮液。

1.4 構(gòu)建FOXO1過表達細胞系及其驗證將攜帶有FOXO1-TurboID和plenti-cmv-EGFP質(zhì)粒的病毒濃縮液對U251細胞進行感染處理，通過觀察感染plenti-cmv-EGFP質(zhì)粒細胞的熒光強度和嘌呤霉素的抗性篩選，以及western-bolt蛋白電泳判斷細胞系是否穩(wěn)轉(zhuǎn)成功。攜帶有plenti-cmv-EGFP質(zhì)粒的細胞命名為EGFP-U251，攜帶有FOXO1-TurboID質(zhì)粒的細胞命名為FOXO1-U251。

1.5 基于TurboID的鄰近生物素標記技術(shù)參照Branon等報道的方法[4]分3組進行12 h生物素標記實驗，分別為EGFP-U251細胞、FOXO1-U251細胞以及使用飽和脂肪酸(棕櫚酸，PA)模擬高脂環(huán)境處理12 h的FOXO1-U251細胞。

1.6 生物素標記蛋白親和純化以及銀染色法鑒定收集1.5中的3組實驗細胞，利用Beads磁珠進行蛋白的親和純化，再將純化后的磁珠進行SDS-PAGE蛋白凝膠電泳，銀染色法觀察EGFP-U251細胞、FOXO1-U251細胞以及經(jīng)過PA處理后的FOXO1-U251細胞，通過蛋白條帶的差異判斷是否尋找到大量互作蛋白。

2 結(jié)果

2.1 FOXO1-TurboID過表達質(zhì)粒的構(gòu)建FOXO1-TurboID過表達質(zhì)粒的組成包含目的基因FOXO1、生物素標記酶TurboID、核定位信號NLS和標簽蛋白Flag，以及兩個不同的抗性篩選標簽。已經(jīng)過公司測序，序列正確。

2.2 FOXO1-TurboID過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建與驗證經(jīng)嘌呤霉素篩選后觀察EGFP-U251細胞系，熒光顯微鏡下有明顯的綠色熒光，可知EGFP-U251穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系構(gòu)建成功。之后對經(jīng)過嘌呤霉素篩選后的細胞系進行Western blot蛋白電泳驗證，確定FOXO1-TurboID過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的構(gòu)建成功。

2.3 生物素標記及銀染色法鑒定將“1.5”中3組細胞經(jīng)過12 h生物素標記實驗后，利用磁珠拉取標記有生物素的蛋白，再進行銀染色法鑒定，觀察到FOXO1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系與對照組EGFP-U251細胞系蛋白條帶之間的巨大差異，證明已經(jīng)拉到大量與目的基因FOXO1互作的蛋白，F(xiàn)OXO1-U251細胞與經(jīng)過PA處理后的FOXO1-U251細胞之間的表達差異有待于進一步的質(zhì)譜分析。

3 討論

目前已知受FOXO調(diào)節(jié)的基因主要包括調(diào)控細胞周期、細胞死亡、細胞自噬、細胞代謝、細胞抗氧化等相關(guān)基因，F(xiàn)OXO某種程度上可以看做調(diào)節(jié)一大類功能基因的“開關(guān)”，是醫(yī)藥生物以及生命科學(xué)領(lǐng)域重要的研究對象[7]。

在本研究中，我們構(gòu)建重組FOXO1-TurboID過表達質(zhì)粒，利用慢病毒包裝技術(shù)得到了可持續(xù)表達FOXO1-TurboID基因的細胞系。之后再對穩(wěn)轉(zhuǎn)EGFP-U251和FOXO1-TurboID的U251細胞進行了生物素標記實驗，并對其中的一組穩(wěn)定過表達FOXO1-TurboID的U251細胞進行棕櫚酸(PA)處理。經(jīng)過生物素親和純化和銀染色法，EGFP-U251作為假陽性對照組可反映內(nèi)源性生物素與磁珠的互作，拉取少量蛋白；而FOXO1-U251細胞與經(jīng)過PA處理后的FOXO1-U251細胞這兩組均可以拉取大量互作蛋白，這兩組之間所拉取的蛋白也存在一定差異，這種差異可以反應(yīng)PA處理條件下FOXO1實時拉取互作蛋白的變化，所拉取的蛋白有待于進一步的蛋白質(zhì)譜鑒定。該技術(shù)的成功應(yīng)用證明了TurboID鄰近標記技術(shù)的實用性和高效性，在FOXO1穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中的成功標記對明確該基因的功能及其參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)，對日后其他基因的研究也提供了一定的思路。