許 萍，黃淑蕓，郭紅敏，柳艷萍，洪宗元，鐘樹志

(皖南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，安徽 蕪湖 241002)

抑郁癥患病率高、治愈率低，目前其發(fā)病機(jī)制仍未完全了解，需要更安全有效的療法。越來越多的人認(rèn)識到天然產(chǎn)物的健康特性和將其用作功能性食品或預(yù)防醫(yī)學(xué)的潛力[1-2]。石榴，亦名安石榴?！侗静菥V目·果部·安石榴》酸榴皮主治：“赤白痢下、久痢久瀉、疔腫惡毒、肚子生瘡”。藥用其皮，故名石榴皮。研究表明石榴皮提取物安石榴苷(punicalagin，Pun)具有抗炎、抗氧化、抗菌、保肝抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、改善婦女更年期綜合征等多種藥理功能[3]。

Pun是用于治療神經(jīng)退行性疾病的有效NF-κB抑制劑，能夠改善致神經(jīng)元損失的腦中神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激[4]。Pun能夠激活小鼠的AMPK/PGC-1α/Nrf2級聯(lián)，改善孕婦產(chǎn)前應(yīng)激[5]。石榴提取物可改善卵巢切除小鼠絕經(jīng)綜合征模型的抑郁狀態(tài)[6]。這些研究表明，Pun能夠緩解神經(jīng)疼痛并能夠改善認(rèn)知功能，并可能改善抑郁癥。然而，Pun能否改善抑郁癥狀及其可能的分子機(jī)制尚未見報(bào)道。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是使用生物信息數(shù)據(jù)庫，整合疾病、藥物相關(guān)的基因、蛋白質(zhì)進(jìn)行綜合分析的一種新型的藥物研發(fā)模式[7]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討Pun對抑郁癥的作用及潛在分子機(jī)制，并進(jìn)行分子對接以及動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，為進(jìn)一步研究Pun治療抑郁癥的藥理機(jī)制提供基礎(chǔ)，并為新藥臨床應(yīng)用提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1藥物-疾病共同靶點(diǎn) 使用Pubchem數(shù)據(jù)庫(Tab 1)獲得Pun的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入PharmMapper數(shù)據(jù)庫，取Norm Fit預(yù)測得分>0的靶標(biāo)作為藥物靶點(diǎn)，經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)名稱統(tǒng)一矯正后獲得藥物靶點(diǎn)。使用OMIM、TTD、Genecards數(shù)據(jù)庫以“depressed”、“depression”、“depressive”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索并去重。取兩者交集Venny2.1繪制韋恩圖。使用Cytoscape 3.7.2軟件，進(jìn)行疾病-靶點(diǎn)-成分網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析。

1.1.2PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析 在STRING數(shù)據(jù)庫中對“1.1.1”獲得靶點(diǎn)進(jìn)行檢索，蛋白種屬“Homo sapiens”、閾值0.4，建立蛋白互作關(guān)聯(lián)圖。用Cytoscap 3.7.2拓?fù)浞治?，選取基因滿足度(Degree)值超過平均分的基因，使用R 3.6.0繪制條形圖。

1.1.3通路和功能富集的分析 基于R軟件使用Bioconductor以P<0.05，Q<0.05進(jìn)行關(guān)鍵基因的基因生物過程(GO)及基因組百科全書(KEGG)分析。將共同靶點(diǎn)經(jīng)R語言運(yùn)行后GO分析選取生物學(xué)過程和排名前20位的KEGG通路。

1.3 動物實(shí)驗(yàn)

1.3.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 實(shí)驗(yàn)小鼠：C57BL/6 60只，1～2月齡，雌雄各半，(22±3) g，由長沙天勤生物提供SCXK(湘)2019-0014。常規(guī)飼養(yǎng)，恒溫(23±2) ℃，恒濕40%～60%，晝夜交替照明，自由飲水與攝食，實(shí)驗(yàn)前1周不處理。安石榴苷凍干粉(P0349，純優(yōu)生物有限公司)；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀Agilent 6460 (MA，美國)。超純水儀(Millipore, Bedford，MA，美國)。乙腈，光譜級，默克化學(xué)公司(中國上海)。其他試劑均為分析純。

1.3.2造模分組給藥 參照文獻(xiàn)[8]的造模方法，實(shí)驗(yàn)遵循隨機(jī)、不可預(yù)見性的原則，所有小鼠均單籠孤養(yǎng)，連續(xù)28 d，每天不定時隨機(jī)給3種低強(qiáng)度刺激，包括：夾尾、禁食、禁水、熱烘、震蕩、傾斜、潮濕、晝夜顛倒、冰水游泳。在小鼠造模結(jié)束后和灌胃用藥結(jié)束后，分別進(jìn)行行為學(xué)實(shí)驗(yàn)的檢測，檢驗(yàn)造模及治療成果。所有動物實(shí)驗(yàn)程序均根據(jù)皖南醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)的方案(YJS-2020-10-006)進(jìn)行。

將造模成功的小鼠均分為4組,參考文獻(xiàn)設(shè)定給藥劑量[9],正常對照組(Normal)、模型組(Model)給與滅菌水灌胃；Pun治療高、中、低劑量組(Pun-H、Pun-M、Pun-L)分別給予Pun 50 、25和12.5 mg·kg-1灌胃，每天1次,連續(xù)45 d。

1.3.3小鼠曠場實(shí)驗(yàn) 將小鼠放置于曠場箱中，每只小鼠檢測時間為6 min，自由活動1 min，記錄后5 min的穿越格數(shù)(以穿越底面積塊數(shù)為水平運(yùn)動記錄穿越格數(shù))和直立次數(shù)(為垂直運(yùn)動記錄小鼠前肢直立次數(shù))。

1.3.4液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS) 檢測海馬中多巴胺(dopamine，DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)含量 小鼠處死后，取海馬組織，生理鹽水洗凈，精密稱重后加入4倍超純水冰浴勻漿。采用Agilent C18色譜柱(2.1 × 50 mm，1.8 μm)在35 ℃下進(jìn)行色譜分離。用程序溶劑混合物溶劑A(乙腈)和溶劑B(0.1%甲酸水溶液)洗脫，流速為0.3 mL·min-1: 0～4 min： 95%～0% B；4～5 min：40%～80% B；5～6 min；80%～95% B。采用MassHunter軟件(Version B.06.00，Agilent Technology，MA，USA)在正電離模式下采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。質(zhì)譜參數(shù):氣體溫度300 ℃；氣流量5 L·min-1；噴霧器氣體45 psi；護(hù)套氣體溫度250 ℃；鞘氣流量11 L·min-1；毛細(xì)管電壓3 500 V；碎片電壓135 V；碰撞能量15 eV。

2 結(jié)果

2.1 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)分析Venny2.1將獲得的290個藥物靶點(diǎn)與1 635個疾病靶點(diǎn)集合，得到核心靶點(diǎn)76個。蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 1)可見PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)之間關(guān)系密切，Pun與抑郁癥交集基因之間有高度關(guān)聯(lián)性。核心靶點(diǎn)(Fig 2)前10包括血清白蛋白(albumin，ALB)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(CASP3)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9、雌激素ESR1、過氧化氫酶CAT、明膠酶A(MMP-2)、一氧化氮NOS3(nitric oxide synthase 3)、過氧化物酶體增生激活受體γPPARG。

Fig 1 Protein interaction network

Fig 2 Ranking of core targets based on PPI topology analysis

2.2 GO 、KEGG富集分析GO結(jié)果顯示(Fig 3)，交集基因共富集1 127條生物學(xué)過程。Pun抗抑郁機(jī)制主要涉及對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)的反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程。R語言運(yùn)行后共得到74條KEGG通路，取前20條(Fig 4)。富集靶點(diǎn)較多的主要信號通路有癌癥中的蛋白多糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化、糖尿病心肌病、促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAP激酶, MAPK)、磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)、腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)等。

Fig 3 GO enrichment analysis

Fig 4 KEGG enrichment analysis

2.3 分子對接結(jié)果如Fig 5、6，化合物和靶點(diǎn)蛋白存在很好的結(jié)合作用。據(jù)結(jié)合模式可以很清晰的看到化合物與蛋白口袋相結(jié)合的氨基酸殘基，如：Pun與AKT1結(jié)合的活性氨基酸殘基有LYS-158、PHE-161、LYS-179、ASP-439、MET-281、LYS-276等。

Fig 5 Combination mode of Pun and AKT1

Fig 6 Combination mode of Pun and ALB

2.4 Pun對CUMS抑郁模型小鼠體質(zhì)量的影響如Fig 7，造模前，造模組與Normal組沒有差異，造模完成后小鼠體質(zhì)量均低于Normal組(P<0.05)。給藥45 d后，Pun各組小鼠體質(zhì)量較Model組快速上調(diào)(P<0.05)，接近Normal小鼠體質(zhì)量。

Fig 7 Body mass of mice

2.5 Pun對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響與Model組相比，用藥組曠場實(shí)驗(yàn)小鼠的探索欲明顯增加(P<0.05，P<0.01)(Tab 2)。

Tab 2 Open field experiment of mice n=12)

2.6 Pun對抑郁小鼠海馬組織中DA、5-HT水平的影響Model組小鼠海馬中遞質(zhì)水平比Normal組迅速下落(P<0.01)(Tab 3)，而Pun治療可以改善其水平(P<0.05，P<0.01)。

Tab 3 Levels of DA and 5-HT in mouse

3 討論

PPI核心靶點(diǎn)ALB、AKT1等化合物可能是Pun治療抑郁癥的關(guān)鍵成分。其中ALB作為人體內(nèi)重要的營養(yǎng)物質(zhì)，目前應(yīng)用于檢測機(jī)體的營養(yǎng)狀況。一項(xiàng)橫斷面研究[10]使用ALB作為營養(yǎng)評價(jià)檢查發(fā)現(xiàn)了124名血液透析患者的營養(yǎng)狀況和抑郁癥之間存在密切聯(lián)系。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[11]老人抑郁癥和ALB等健康狀況指標(biāo)密切相關(guān)，老年抑郁癥量表(GDS-15)每增加1點(diǎn)，健康狀況不佳的風(fēng)險(xiǎn)增加20%(P<0.01)。新近研究發(fā)現(xiàn)[12]逍遙丸通過激活A(yù)KT1相關(guān)信號通路，改善大鼠抑郁樣行為和氧化應(yīng)激。

GO富集分析結(jié)果表明，Pun抗抑郁機(jī)制主要涉及對LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、肌細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程。研究發(fā)現(xiàn)，LPS可以誘導(dǎo)神經(jīng)炎癥以及病理改變，從而引起抑郁癥等疾病[13]。抑制LPS引起的神經(jīng)炎癥可能是Pun改善小鼠抑郁樣行為的重要機(jī)制。抑郁是心肌梗死的危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)5-HT再攝取抑制劑能夠降低抑郁所引起的心肌梗死。其作用機(jī)制與5-HT介導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)[14]。

KEGG 富集分析說明，Pun的主要活性成分可能是通過介導(dǎo)癌癥中的蛋白多糖、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等途徑治療抑郁癥。癌癥中的蛋白多糖如透明質(zhì)酸、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、硫酸軟骨素/硫酸皮膚素蛋白多糖等形成致密的點(diǎn)陣狀神經(jīng)周網(wǎng)(perineuronal nets，PNNs)，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后的神經(jīng)活性和可塑性[15]。Pun治療或許可以作用于PNNs，增強(qiáng)神經(jīng)元活性和突觸可塑性，促進(jìn)中樞神經(jīng)退行性疾病的恢復(fù)。動脈粥樣硬化是一種脂質(zhì)驅(qū)動的動脈免疫炎癥性疾病，同時也是認(rèn)知障礙的主要風(fēng)險(xiǎn)因素[16]。Pun可能通過心血管相關(guān)機(jī)制改善認(rèn)知行為。除此之外，MAPK、PI3K-Akt和Ras信號通路能夠介導(dǎo)神經(jīng)營養(yǎng)因子、生長因子，有效降低海馬神經(jīng)元衰弱并促進(jìn)其復(fù)蘇，增加突觸可塑性，發(fā)揮抗抑郁作用。

分子對接結(jié)果表明，Pun含有多個供受體，Pun能夠與AKT1、ALB靶點(diǎn)蛋白的氨基酸的活性基團(tuán)形成較強(qiáng)氫鍵相互作用，與口袋的疏水性殘基形成疏水相互作用，共軛相互作用等，從而促進(jìn)小分子與蛋白位點(diǎn)的結(jié)合，該結(jié)果驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)篩選結(jié)果, Pun與AKT1、ALB蛋白靶點(diǎn)匹配好，是潛在的有治療活性的化合物。

綜上，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，對Pun治療抑郁癥的活性成分與重要靶點(diǎn)進(jìn)行了分析與預(yù)測，并進(jìn)一步采用分子對接及動物實(shí)驗(yàn)對Pun的藥效進(jìn)行了進(jìn)一步探索，初步明確了Pun的主要活性成分可能是多靶點(diǎn)、多途徑抑制HPA軸亢進(jìn)并促進(jìn)腦內(nèi)單胺遞質(zhì)分泌，避免損傷海馬神經(jīng)元從而發(fā)揮抗抑郁作用，為后續(xù)Pun的抗抑郁分子機(jī)制作用的深入研究思路提供了一定方向。