張 梅，何旨意，黃慶洋，張阿潔，覃彥蓉，劉 揚，鄭海倫

(1. 蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院，2. 蚌埠醫(yī)學院藥學院/安徽省生化藥物工程技術(shù)研究中心，安徽 蚌埠 233030；3. 廣州歡網(wǎng)科技有限責任公司，北京 100021)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種發(fā)病率高、死亡率高的常見惡性腫瘤，是全球最緊迫的健康問題之一。根據(jù)GLOBOCAN 2020年全球發(fā)病率和死亡率估計報告，大腸癌是全球第三大確診癌癥和第二大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。目前治療結(jié)直腸癌的方法包括手術(shù)、放療、化療、免疫治療和生物靶向治療[2]。然而，大多數(shù)癌癥患者最終還是會復發(fā)并產(chǎn)生抗藥性[3]。因此，迫切需要尋找既能提高抗癌藥物的藥效，又能克服多藥耐藥和毒副作用的有效化療增敏劑。

紫草素(shikonin,Shi)是從紫草根中提取的一種化合物[4]。研究表明，Shi已在多種人類癌癥中顯示出抗腫瘤活性，例如神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]、黑色素瘤[6]、乳腺癌[7]、肝細胞癌[8]等。研究發(fā)現(xiàn)[9]，Erastin(Era)對結(jié)直腸癌細胞具有明顯的細胞毒作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)，Era減輕了結(jié)直腸癌細胞對化療藥物的耐藥性。最近，聯(lián)合化療被發(fā)現(xiàn)是一種更好的治療策略[10]，既能提高抗癌藥物的療效，又能克服多藥耐藥并減輕毒副作用。Shi單獨或與其他藥物聯(lián)合使用導致細胞死亡的機制，需要進一步研究。本研究主要探討鐵死亡誘導劑Era與Shi聯(lián)合應用對結(jié)直腸癌細胞SW480和SW620抗腫瘤活性的影響并分析其可能作用機制，以期為結(jié)直腸癌的治療提供一種很有前途的策略。

1 材料與方法

1.1 材料人結(jié)直腸癌細胞株SW480(CL-0223)、SW620(CL-0225)購于武漢普諾賽生命科技有限公司。DMEM高糖培養(yǎng)基(C11995500BT)購于Gibco，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(FSP500)購于ExCell Bio。紫草素(HY-N0822)和Erastin(HY-15763)均購自MCE公司。胰酶細胞消化液(BL501A)購于biosharp，CCK-8(K1018)、Annexin-V /PI雙染試劑盒(BB-4103-100T)購于貝博公司；乳酸檢測試劑盒(A019-2-1)購自南京建成；Bax(50599-2-Ig)、Bcl-2(12789-1-AP)、PARP1(13371-1-AP)、caspase 3(19677-1-AP)、caspase 8(13423-1-AP)、AKT(10176-2-AP)、山羊抗兔IgG(SA00001-2)和β-actin(66009-1-Ig)均購自Proteintech，p-AKT(4060S)購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 人結(jié)直腸癌細胞SW480，SW620培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素高糖DMEM培養(yǎng)基中，在37 ℃、含5% CO2的加濕、恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2CCK-8檢測細胞存活率 將對數(shù)生長期的SW480、SW620細胞接種于96孔板，8×103/孔，放置于37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 h后棄去孔中培養(yǎng)液，加入含有不同濃度(0、10、20、40、80、100 μmol·L-1)Era和(SW480:0、1、2、4、8、16 μmol·L-1；SW620:0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1)Shi的DMEM培養(yǎng)液，并設(shè)置空白組，每組3個復孔。之后置于培養(yǎng)箱，分別培養(yǎng)24 h和48 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀于450 nm處檢測吸光度，實驗重復3次。根據(jù)藥物劑量效應曲線分別計算出Era和Shi的半數(shù)抑制濃度(IC50)。再選用濃度低于IC50的Era與不同濃度(SW480:0、1、2、4、8、16 μmol·L-1；SW620:0,0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 μmol·L-1)的Shi聯(lián)合作用于SW480和SW620細胞24 h，觀察單用Shi以及Shi與Era聯(lián)合應用對SW480、SW620細胞活力的影響。

1.2.3Erastin與紫草素的結(jié)合指數(shù)CI 根據(jù)CCK-8檢測結(jié)果使用CompuSyn軟件計算結(jié)合指數(shù)CI。CI=1表示兩藥起到相加作用；CI<1表示協(xié)同作用；CI>1表示拮抗作用。Era濃度為10 μmol·L-1，Shi濃度梯度分別為1、2、4和0.5、1、2 μmol·L-1作用于SW480和SW620。

1.2.4倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化 將人結(jié)直腸癌細胞SW480和SW620接種于6孔板，2×105/孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后棄去孔中培養(yǎng)液，細胞分為4組，含DMEM培養(yǎng)液的對照組，10 μmol·L-1Era組，2 μmol·L-1Shi(SW480)組(SW620：1 μmol·L-1Shi)以及兩者聯(lián)合用藥組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后使用倒置顯微鏡拍照。

1.2.5活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成量的測定 收集對數(shù)生長期的SW480、SW620細胞，按3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組加入濃度分別為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組加入濃度分別為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1Shi以及兩者合用組。置于培養(yǎng)箱中24 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗，將10 μmol·L-1的DCFH-DA以500 μL/孔加入6孔板中，放37 ℃培養(yǎng)箱中染色30 min，棄去染液，收集細胞，用流式細胞儀檢測活細胞內(nèi)ROS的生成量。

1.2.6培養(yǎng)液中乳酸含量的測定 對數(shù)生長期的SW480、SW620細胞，3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1shi以及兩者合用組。置于培養(yǎng)箱中24 h，收集培養(yǎng)液，按照乳酸檢測試劑盒說明書進行乳酸含量的測定。實驗重復3次。

1.2.7AnnexinV-Alexa Fluor 488/PI雙染檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的SW480、SW620細胞，按3×105/孔種于6孔板中，SW480細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、2 μmol·L-1Shi以及兩者合用組；SW620細胞組分別加入濃度為0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1Shi以及兩者合用組。置于培養(yǎng)箱中24 h，收集培養(yǎng)液，PBS清洗，收集細胞。于冰上避光加入5 μL AnnexinV/PI染色15 min；然后加入10 μL PI染液，染色5 min。上機，用流式細胞儀檢測藥物對細胞凋亡的影響。實驗重復3次。

1.2.8Western blot檢測Bax、Bcl-2、PARP1、caspase3、caspase8、AKT和p-AKT的表達 結(jié)直腸癌細胞SW620接種于60 mm平皿而后置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，棄去培養(yǎng)液，更換為含有0、10 μmol·L-1Era、1 μmol·L-1shi以及兩者合用組的DMEM培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中24 h，加入100 μL含有PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，12 000 r·min-14 ℃離心30 min。取上清，BCA蛋白定量法計算出每組所需上樣量。每組取60 μg蛋白進行電泳，之后蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，洗膜1次，5 min。封閉30 min，洗膜3次，每次5 min。4 ℃敷一抗過夜。洗膜3次，每次5 min。室溫搖床敷二抗1 h，洗膜3次，每次5 min。ECL試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 Erastin與Shikonin單用及聯(lián)合應用對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響人結(jié)直腸癌細胞SW480、SW620經(jīng)藥物作用并計算出IC50(24 h)：SW480-Shi為1.98 μmol·L-1，SW480-Era為35.83 μmol·L-1，SW620-Shi為1.204 μmol·L-1，SW620-Era為22.24 μmol·L-1。Era和Shi聯(lián)合應用對結(jié)直腸癌細胞的增殖抑制作用明顯高于單用藥組(Fig 1)。使用10 μmol·L-1Era分別與不同濃度Shi(SW480：1、2、4 μmol·L-1；SW620：0.5、1、2 μmol·L-1)聯(lián)合應用24 h，經(jīng)CompuSyn軟件計算出CI值(Tab 1)，結(jié)果表明聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用。

Fig 1 Combination of Erastin and Shikonin exhibits synergistic anticancer effects

Tab 1 Combination index (CI) of Erastin and Shikonin on SW480 or SW620

2.2 Erastin、紫草素單用及聯(lián)合用藥對SW480與SW620細胞形態(tài)學的影響如Fig 2所示，10 μmol·L-1Era處理組細胞形態(tài)和密度與對照組相比無明顯差別，2 μmol·L-1和1 μmol·L-1Shi處理組細胞密度減少，而聯(lián)合用藥組細胞形態(tài)與密度則有明顯的改變。

Fig 2 The morphological changes of colorectal cancer cellsA E:control. B F:Era. C G:Shi. D H:Era+Shi.

2.3 Erastin、shikonin單用及聯(lián)合用藥對SW480與SW620乳酸水平的影響如Fig 3所示，聯(lián)合用藥組中糖酵解的最終產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)生比單用Shi組抑制作用更明顯，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

Fig 3 Changes of lactate level**P<0.01 vs Shi-2(Shi-1) .

2.4 Erastin、紫草素單用或聯(lián)合用藥對結(jié)直腸癌細胞活性氧含量的影響如Fig 4所示，ROS檢測結(jié)果表明，單獨處理組ROS產(chǎn)生不明顯，聯(lián)合用藥組ROS水平比Shi組明顯升高(Fig 4A，B)。

Fig 4 Changes of ROS levelA and B: Intracellular ROS generation were measured (E:Erastin,S:Shikonin).

2.5 Erastin、紫草素單用或聯(lián)合用藥對結(jié)直腸癌細胞凋亡的影響如Fig 5所示，為了進一步闡明聯(lián)合作用抑制細胞生長的機制，我們用Annexin V/PI染色法檢測了Shi和/或Era對結(jié)直腸癌細胞的促凋亡作用。如Fig 5A，B所示，與單獨使用Era或Shi相比，聯(lián)合治療導致凋亡細胞比例明顯增加。凋亡檢測結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組與Shi組相比差異有統(tǒng)計學意義(Fig 5C，D)。

Fig 5 Erastin enhances shikonin-induced cell apoptosis

2.6 聯(lián)合用藥對結(jié)直腸癌細胞SW620相關(guān)蛋白的影響Fig 6A顯示，10 μmol·L-1Era和1 μmol·L-1Shi兩者合用組p-Akt明顯低于單用Shi組。如Fig 6B顯示，單用藥組Bcl-2和Bax的表達沒有明顯變化，聯(lián)合用藥組可顯著抑制Bcl-2的表達，上調(diào)Bax的表達。與流式細胞儀結(jié)果一致，Era處理明顯增強Shi誘導的caspase 3和caspase 8的激活，進而Cleaved-caspase 3，Cleaved-caspase 8和Cleaved-parp1表達增加。PARP是caspase的底物，裂解的PARP被認為是細胞凋亡的重要標志。此研究結(jié)果表明鐵死亡誘導劑Era與Shi聯(lián)合應用可以促進凋亡相關(guān)蛋白的激活。

Fig 6 The expression levels of related proteins in SW620 cells

3 討論

Shi是從中國草本植物紫草中分離出來的一種天然化合物，幾千年來一直被用來治療各種疾病[11]。Shi通過誘導細胞內(nèi)氧化應激抑制惡性腫瘤細胞生長和誘導癌細胞凋亡[12]。研究表明[13]，紫草提取物具有多種藥理活性，包括抗炎、抗氧化應激、抗病毒、抗菌和抗癌。研究發(fā)現(xiàn)[14]，Erastin和順鉑的聯(lián)合應用具有協(xié)同作用，表明在結(jié)直腸癌中鐵死亡增加了經(jīng)典治療藥物和抗腫瘤機制所觸發(fā)的另一種細胞死亡途徑。在本研究中，Erastin和Shi聯(lián)合用藥的結(jié)果顯示，Erastin能有效地增強Shi誘導的細胞凋亡，并顯示出協(xié)同抑制結(jié)直腸癌細胞增殖的作用。也有研究表明[15]，Erastin可能通過誘導氧化應激對結(jié)直腸癌細胞產(chǎn)生細胞毒性和促凋亡作用。

在腫瘤細胞中，Shi治療通過抑制丙酮酸激酶M2(PKM2)的活性來抑制糖酵解，通過增加ROS的產(chǎn)生來誘導細胞凋亡[16]。我們的研究結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組ROS含量明顯高于Shi組。癌細胞中ROS的增加在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。本實驗乳酸含量檢測結(jié)果顯示，合用組能顯著抑制乳酸的產(chǎn)生。腫瘤細胞以高速率產(chǎn)生乳酸，乳酸是一種經(jīng)常被忽視的碳源，但可以促進三羧酸循環(huán)(TCA)回補；循環(huán)乳酸也是調(diào)節(jié)氧化還原平衡的重要手段[17]。Akt信號通路在細胞中發(fā)揮重要作用，介導多種細胞機制，如增殖、存活、血管生成、自噬和凋亡。據(jù)報道，Akt級聯(lián)信號通路有助于腫瘤細胞的發(fā)生、增殖、侵襲和發(fā)展。因此，Akt級聯(lián)抑制可以避免腫瘤的發(fā)生。在本研究中，Erastin和Shi聯(lián)合治療可顯著降低Bcl-2的表達，而增加Bax的表達。Bcl-2家族最終表達失衡導致結(jié)直腸癌細胞凋亡。

綜上所述，Erastin作為Shi的增效劑，可能通過誘導細胞內(nèi)氧化應激、抑制乳酸產(chǎn)生、抑制Akt通路，進而使促凋亡蛋白高表達，抗凋亡蛋白低表達來實現(xiàn)協(xié)同抗癌作用的一種高效途徑。此研究結(jié)果證明ROS的產(chǎn)生可能是開發(fā)新的抗癌藥物的一個很好的策略，因此，Erastin可能是一種很有前途的化療增敏劑，可以作為以Shi為基礎(chǔ)的癌癥治療藥物，也可作為一種新型的抗結(jié)直腸癌藥物，應在腸道疾病領(lǐng)域內(nèi)進一步研究。