陰蘇月，王守寶，杜冠華

(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所,藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室，北京 100050)

重建冠脈血流，緩解心肌血流灌注不足，降低耗氧量，以維持冠脈血流和心肌需求的相對平衡，是缺血性心臟病的主要治療手段。心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)是因阻塞的冠狀動脈重新開放，出現(xiàn)的心肌細胞不可逆性死亡的加重和梗死區(qū)擴大，這在臨床實踐中也被稱為“無復流”現(xiàn)象[1]。MIRI增加了缺血性心臟病患者心臟不良重構(gòu)的發(fā)生率，也是該類患者遠期存活率較低且預后較差的重要原因，但目前尚無有效的治療方法[2]。

細胞凋亡和壞死被認為是參與MIRI的兩條主要細胞死亡途徑。近年來，研究人員發(fā)現(xiàn)了一種新的細胞死亡途徑——壞死樣凋亡，其既有與細胞凋亡類似的可調(diào)控途徑，又有細胞發(fā)生壞死后的形態(tài)學特征。壞死樣凋亡主要由受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase1，RIPK1)，RIPK3及RIPK3下游效應子混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白(mixed-lineage kinase domain-like pseudokinase，MLKL)來介導，不依賴于caspase的細胞死亡形式[3]。

壞死樣凋亡在細胞死亡途徑研究中受到越來越多的關(guān)注。研究表明，RIPK1和RIPK3都可以通過凋亡和壞死樣凋亡兩種機制誘導細胞死亡。壞死樣凋亡發(fā)生的兩個基本條件是細胞表達RIPK3和caspase-8被抑制，而抑制caspase-8會導致RIPK3的激活。當RIPK3被敲除時，RIPK1只能引起細胞凋亡，若RIPK3存在，RIPK1則可以引起細胞發(fā)生壞死樣凋亡，且RIPK3在下游效應蛋白MLKL大量存在時，可以單獨介導壞死樣凋亡的發(fā)生[4]。這些都表明了RIPK3對于壞死樣凋亡中是必不可少的。RIPK3介導的壞死樣凋亡參與了包括心臟在內(nèi)的不同器官的多種病理情況，并能參與多種病理條件下的細胞死亡，如病毒感染、急性腎損傷和缺血/再灌注損傷[5]。

研究發(fā)現(xiàn)，RIPK3介導的壞死樣凋亡在MIRI病理進程中發(fā)揮著重要作用，因此靶向RIPK3介導的壞死樣凋亡可能成為一種新穎的、有效的干預策略。詳細了解RIPK3介導的壞死樣凋亡的發(fā)生機制及其參與MIRI發(fā)病的具體過程，將有助于研究在疾病的發(fā)生發(fā)展和后期治療中，心肌細胞的相互作用，并將RIPK3介導壞死樣凋亡的潛在益處轉(zhuǎn)化為臨床研究。

1 RIPK3的結(jié)構(gòu)與生物功能

RIPK家族是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的蛋白家族。其家族成員N端包含同源激酶結(jié)構(gòu)域，并具有經(jīng)典的催化元件，如同源但不相同的P-環(huán)(P-loops)，位于αC螺旋中心的賴氨酸和谷氨酸離子對，以及催化環(huán)中的HXD基序[6]。但RIPK家族的C端卻各不相同，可特異性地與蛋白結(jié)合發(fā)揮不同的生物功能。不同于RIPK1 C端的一段死亡結(jié)構(gòu)域(death domain，DD)，RIPK3的C端沒有DD結(jié)構(gòu)，但有一段和RIPK1同樣的片段，即RIP同型結(jié)構(gòu)域(RIP homotypic interaction motif，RHIM)。這個結(jié)構(gòu)域奠定了RIPK3和RIPK1相互作用的基礎(chǔ)，對壞死樣凋亡的發(fā)生至關(guān)重要[6-7]。

RIPK3在調(diào)節(jié)細胞存活和死亡中發(fā)揮重要作用。最初認為RIPK3的作用是介導核因子-κB(NF-κB)的激活和細胞凋亡，但在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)RIPK3在介導壞死樣凋亡中起到不可或缺的作用[5]。結(jié)構(gòu)完整的RIPK3參與了依賴caspase和不依賴caspase的細胞程序性死亡。當caspase-8在RIPK3的Asp328位點處剪切掉其特異結(jié)構(gòu)域后，RIPK3只能介導依賴caspase發(fā)生的細胞凋亡，這說明結(jié)構(gòu)完整RIPK3的激活在不依賴caspase的細胞死亡途徑中是必不可少的[8]。在RIPK3-/-細胞中，RIPK1無法和RIPK3形成壞死復合體，繼而不能引發(fā)壞死樣凋亡[9]。這些都表明RIPK3在壞死樣凋亡中的重要性。

RIPK3在炎癥反應中也起著重要的作用，涉及多種疾病如：缺血/再灌注損傷、膿毒癥、神經(jīng)退行性疾病、胰腺炎、胃腸炎和皮炎等。有報道稱RIPK3可以特異性激活依賴于NLRP3-caspase-1的炎癥，而且RIPK3可以激活炎癥小體[5, 10]。RIPK1缺乏引起的劇烈炎癥反應會導致圍產(chǎn)期小鼠死亡，但敲除RIPK3可以降低其死亡率[11]。而且越來越多研究發(fā)現(xiàn)，敲除RIPK3可以逆轉(zhuǎn)炎癥性疾病及相關(guān)損傷，故與RIPK1抑制劑相比，RIPK3抑制劑更有可能保護細胞使其免受來自各方面的刺激。

綜上，RIPK3的主要功能是介導細胞壞死樣凋亡，其依賴于RIPK3結(jié)構(gòu)中具有激酶活性的結(jié)構(gòu)域[7]。除此之外，RIPK3還有不依賴激酶活性結(jié)構(gòu)域的功能，這些功能與炎癥小體的激活和細胞凋亡有關(guān)[12]。因此，RIPK3在調(diào)節(jié)壞死樣凋亡和炎癥反應中有著不容忽視的作用。

2 RIPK3介導壞死樣凋亡的途徑

壞死樣凋亡可被多種信號激活，如腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、DNA損傷、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、缺氧等[13]。調(diào)控壞死樣凋亡的過程非常復雜且精密，目前研究較為清晰的有以下兩種(Fig 1)。

Fig 1 Necroptosis and RIPK3-related pathways in myocardial ischemia-reperfusion injury

2.1 RIPK3通過MLKL介導的壞死樣凋亡通路壞死樣凋亡可由多種受體啟動，如：死亡受體腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1)，模式識別受體Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)等[5, 14]。RIPK3對巨噬細胞壞死樣凋亡的調(diào)節(jié)與不同受體的激活有關(guān)，其活化常常出現(xiàn)在TNF誘導的細胞通路中。

TNFR1受到TNF-α刺激后，首先招募腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(TNF receptor associated death domain，TRADD)、RIPK1和TNF受體相關(guān)因子2(TNF receptor-associated factor 2，TRAF2)，而后TRAF2和細胞凋亡蛋白抑制因子1/2(cellular inhibitor of apoptosis protein 1 and 2，cIAP1/2)結(jié)合，共同形成復合體Ⅰ。RIPK1的泛素化主要由cIAP1/2和線性泛素鏈組裝復合體(linear ubiquitin chain assembly complex，LUBAC)來介導，泛素化后的RIPK1可以激活NF-κB通路，啟動細胞存活通路及炎癥反應。當NF-κB信號通路被抑制時，復合體Ⅰ中的TRADD招募Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD)和caspase-8，形成復合體Ⅱa，此時發(fā)生不依賴RIPK1的凋亡(RIPK1 independent apoptosis，RIA)；當去泛素化酶，如腫瘤抑制因子頭帕腫瘤綜合征蛋白(cylindromatisis，CYLD)，使RIPK1去泛素化，RIPK1招募FADD和caspase-8后形成復合物Ⅱb，介導依賴RIPK1的凋亡(RIPK1 dependent apoptosis，RDA)。當啟動細胞凋亡的caspase-8被抑制的時候，caspase-8對RIPK1的抑制作用也會隨之解除，RIPK1和RIPK3通過RHIM相互作用，形成RIPK1-RIPK3復合體(necrosome)，RIPK1磷酸化RIPK3，RIPK3進一步磷酸化MLKL，磷酸化的MLKL發(fā)生寡聚和移位，最終在質(zhì)膜上執(zhí)行壞死樣凋亡[14]。

當病毒RNA、LPS和dsRNA激活TLR3或TLR4時，β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain containing adapter inducing interferon-β，TRIF)被特異性招募，通過其結(jié)構(gòu)域中特有的RHIM形成RIPK3/TRIF復合物，在caspase-8抑制劑或泛caspase抑制劑(zVAD-FMK)存在的情況下，形成壞死小體，繼而細胞發(fā)生壞死樣凋亡[15]。

2.2 RIPK3通過CaMKII介導的壞死樣凋亡通路RIPK3除了通過上述RIPK1-RIPK3-MLKL級聯(lián)反應引發(fā)壞死樣凋亡外，還可通過激活鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKII)誘導細胞發(fā)生壞死樣凋亡[16]。CaMKII是一種主要的鈣調(diào)節(jié)蛋白，參與MIRI、心律失常和心力衰竭等疾病發(fā)生發(fā)展的過程[16]。RIPK3可直接磷酸化CaMKII的第287位蘇氨酸，而RIPK3通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)-Ca2+-黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)信號通路誘導并過量產(chǎn)生的細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)，也可使CaMKII的第281/282位蛋氨酸發(fā)生氧化，激活的CaMKII可以介導其下游效應器線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore，mPTP)開放，線粒體膜電位去極化，線粒體功能出現(xiàn)障礙，最終導致心肌細胞發(fā)生壞死樣凋亡。研究證實，通過RIPK3-CaMKII-mPTP通路可以靶向保護心臟免受缺血和氧化應激誘導的壞死樣凋亡和心肌重構(gòu)的影響[16]。抑制CaMKII活性，可阻止RIPK3介導的mPTP開放，說明CaMKII在RIPK3介導的壞死樣凋亡中發(fā)揮調(diào)節(jié)信號作用[16]。

3 RIPK3介導的壞死樣凋亡在心肌缺血/再灌注損傷中扮演重要角色

壞死樣凋亡和心肌梗死之間的聯(lián)系最早由Luedde等[17]提出，他們在心肌缺血模型中發(fā)現(xiàn)，RIPK3表達上調(diào)后，依賴RIPK3的壞死樣凋亡會導致小鼠心肌缺血后心臟的不良重塑。研究證明，壞死樣凋亡是MIRI中壞死性損傷的重要因素之一。阻斷壞死樣凋亡可以減少約50%的心肌細胞死亡，而泛caspase抑制劑只能減少30%的細胞死亡，這說明壞死樣凋亡可能是復氧后心肌細胞死亡的主要方式[18]。

先前的研究將壞死定義為一種不受調(diào)控的細胞死亡模式，但目前研究表明，壞死樣凋亡是可控的，這為我們提供了通過相應的靶點信號對壞死樣凋亡進行調(diào)控的新思路。且RIPK3調(diào)控的壞死樣凋亡在心肌缺血/再灌注損傷下發(fā)生的線粒體功能障礙、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、鈣超載、微血管功能障礙、炎癥等方面都發(fā)揮著一定作用。

3.1 RIPK3介導的壞死樣凋亡在心肌線粒體功能障礙中的作用RIPK3介導的壞死樣凋亡除了通過破壞質(zhì)膜發(fā)揮作用，RIPK3還會被轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，通過激活動力蛋白相關(guān)蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)導致線粒體裂變[19]。Drp1是一種線粒體裂變調(diào)節(jié)劑，由于缺氧/再灌注(hypoxia/reoxygenation，H/R)損傷，心肌細胞中線粒體分裂調(diào)節(jié)因子Drp1在第616位絲氨酸上發(fā)生磷酸化，并在第637位絲氨酸上發(fā)生去磷酸化，從而導致線粒體碎裂且功能紊亂。磷酸甘油酸突變酶5(phosphoglycerate mutase 5，PGAM5)是一種線粒體膜蛋白，在TNF-α誘導的壞死樣凋亡模型中負責招募Drp1和Drp1的去磷酸化。在H/R之后，PGAM5表達顯著上調(diào)，Drp1去磷酸化水平增高，同時線粒體膜電位下降，ROS增加。這說明可以通過抑制PGAM5,進而抑制線粒體分裂蛋白Drp1來減輕H/R誘導的心肌細胞發(fā)生壞死樣凋亡[19]。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)已被確定為減少心肌梗死面積，緩解MIRI的重要治療靶點，它在線粒體形態(tài)和功能調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用。mPTP的長時間開放會引發(fā)一系列損傷如線粒體功能障礙，最終導致細胞死亡，這是包括心肌損傷在內(nèi)多種疾病的發(fā)病機理[20]。此外，也有研究表明它的開放是細胞發(fā)生壞死樣凋亡的上游觸發(fā)因素[21]。

親環(huán)素D(cyclophin-D，Cyp-D)蛋白是位于線粒體中的一種肽基-脯氨酰異構(gòu)酶，也是mPTP復合體的關(guān)鍵組成部分，它在mPTP的開放調(diào)節(jié)過程中至關(guān)重要。激活的RIPK3上調(diào)PGAM5的表達，PGAM5增強Cyp-D的磷酸化作用，Cyp-D繼而增加mPTP的開放并介導線粒體斷裂增加，從而發(fā)生壞死樣凋亡[18]。將Cyp-D基因敲除后，小鼠對細胞壞死產(chǎn)生抵抗力，但對細胞凋亡并無抵抗力[20]。綜上，RIPK3可以通過不同的通路介導壞死樣凋亡，并在線粒體功能障礙導致的心肌損傷中發(fā)揮重要作用。

3.2 RIPK3介導的壞死樣凋亡參與MIRI中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和鈣超載研究證明，在心肌梗死后，RIPK3介導的Ca2+/CaMKⅡ激活，進而導致ER應激。同樣RIPK3被激活后易位至ER，導致ER應激。ER應激標志物，如78 ku葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulated protein，GRP78)，C / EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)和蛋白激酶R樣ER激酶(protein kinase R-like ER kinase，PERK)等表達增加可以表征該過程的發(fā)生[21]。

RIPK3還可以促進黃嘌呤氧化酶(XO)和肌醇三磷酸受體(inositol trisphosphate receptor，IP3R)的表達，IP3R是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的鈣通道，負責將鈣離子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放到細胞質(zhì)，IP3R表達上調(diào)后細胞內(nèi)Ca2+濃度也隨之增高[21]。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面上的XO是一種負責通過ATP/ADP代謝進行電子傳遞的氧化酶，在Ca2+調(diào)控下它的活性增加，進而導致細胞內(nèi)的氧化應激和mPTP的開放。所以，在MIRI下，RIPK3能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激來上調(diào)IP3R表達，提高XO的表達，導致鈣超載，并通過ER- Ca2+-XO途徑調(diào)控ROS的過量產(chǎn)生，進而激活mPTP開放，從而介導MIRI中心肌細胞發(fā)生壞死樣凋亡[21]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激不僅參與調(diào)控細胞凋亡，也是壞死樣凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。

也有研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)熱休克蛋白90(HSP90)是RIPK3的上游激活劑，HSP90從分子伴侶CDC37上解離后可抑制RIPK3介導的壞死樣凋亡，這表明HSP90在RIPK3介導的壞死樣凋亡中發(fā)揮重要作用[22]。

3.3 RIPK3介導的壞死樣凋亡與MIRI的心肌微血管功能障礙微血管的通暢性主要受內(nèi)皮依賴性舒張功能的調(diào)節(jié)，而內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的表達在小鼠心臟發(fā)生MIRI后顯著降低，但敲除RIPK3后，eNOS可恢復到正常水平，且微血管的通暢性也有所改善[18]。此外，經(jīng)過MIRI后的小鼠心臟，在大多數(shù)微血管中會出現(xiàn)線形和不規(guī)則的充盈缺損，紅細胞易在微血管中積聚，同樣，在敲除RIPK3之后，紅細胞沉積的概率、微血栓的形成和微血管阻塞的風險均有所降低[18]。

血管內(nèi)皮鈣黏素(vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)已被證明是維持血管完整性的關(guān)鍵成分，其表達水平降低會破壞內(nèi)皮屏障，導致血管通透性增加，炎性細胞浸潤。有研究表明MIRI誘發(fā)的壞死樣凋亡與VE-cadherin表達下降密切相關(guān)[23]。此外，RIPK3介導的PGAM5激活和mPTP開放會導致血管舒張劑(eNOS)和血管收縮劑內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)的失衡，引發(fā)微循環(huán)障礙，使得“無復流”現(xiàn)象進一步加重。但從敲除RIPK3小鼠的心臟中提取心臟微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)，檢測RIPK3、p-MLKL和PGAM5的表達，發(fā)現(xiàn)均降低到正常水平[18]。

3.4 RIPK3誘導的壞死樣凋亡與MIRI中的炎癥RIPK3介導MLKL在質(zhì)膜上執(zhí)行壞死樣凋亡，質(zhì)膜破裂后，損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular pattern，DAMP)的釋放會引發(fā)廣泛的炎癥。而DAMPs一旦釋放，便會激活炎癥細胞，從而加重炎癥和組織損傷。與凋亡相比，壞死樣凋亡會破壞質(zhì)膜的完整性，可能引發(fā)更多的炎癥反應[14]。此外，許多臨床前實驗都證明了RIPK3誘導的壞死樣凋亡在加重各種器官，包括心臟、腸和皮膚的炎癥反應中發(fā)揮著不可忽視的作用，且炎癥反應反過來又能引起包括壞死樣凋亡在內(nèi)的細胞壞死[11]。

高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是一種DNA結(jié)合蛋白，在被分泌到細胞外后，作為一種DAMPs，與晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products，RAGE)和TLR4結(jié)合而發(fā)揮促炎活性。HMGB1與TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性細胞因子的產(chǎn)生和壞死標志物表達的上調(diào)有關(guān)。RAGE又會被MIRI上調(diào)，故而HMGB1促進了MIRI引起的炎癥反應，而炎癥反過來又會加劇MIRI。下調(diào)HMGB1的表達可以抑制炎癥介導的壞死樣凋亡，從而保護心肌細胞免受H/R損傷[24]。

羧甲基賴氨酸(Nε-carboxymethyl lysine，CML)是一種晚期糖基化終末物(advanced glycation end product，AGE)，由氧化和糖基化反應中的賴氨酸殘基進行非酶修飾而產(chǎn)生[25]。AGEs在動脈粥樣硬化斑塊的形成和糖尿病血管病變中發(fā)揮著不可忽視的作用。急性心肌梗塞的患者，特別是在患者發(fā)生缺血/再灌注后，CML水平顯著升高，可通過增加RIPK3及其下游蛋白的磷酸化來促進RIPK3介導的壞死樣凋亡。而RAGE缺乏可以阻斷CML對RIPK3介導的心肌壞死樣凋亡的作用，緩解CML誘導的MIRI，這表明CML能促進RIPK3介導的心肌壞死樣凋亡，并通過RAGE加重MIRI[25]。

4 問題與展望

目前研究已經(jīng)較為清晰地揭示了壞死樣凋亡的分子機制，但許多重要的問題仍未可知。例如，在不同的病理生理條件下，哪些細胞因子、損傷相關(guān)分子模式能夠刺激壞死樣凋亡，以及這些信號如何協(xié)調(diào)壞死樣凋亡；在TNF-α刺激的細胞中，是什么觸發(fā)了壞死樣凋亡激活的關(guān)鍵步驟，即從復合體Ⅰ到復合體Ⅱa/b的轉(zhuǎn)變；RIPK3是如何參與并介導壞死樣凋亡、抑制細胞凋亡；MLKL執(zhí)行壞死樣凋亡的分子機制是怎樣的？

根據(jù)現(xiàn)有的研究，在動物、細胞模型中，RIPK3調(diào)控的壞死樣凋亡在MIRI的幾個方面均起著關(guān)鍵作用，包括心臟炎癥、心肌梗死范圍擴大、心功能障礙等。但其具體在人體上的效果依然未知。因此，在未來的工作中，仍需要有更多的研究來證明在臨床研究中使用RIPK3藥理抑制作用的合理性。