高倩雯，肖鈺潔，王羽維，朱曉佳，劉福明，陳可塑，王榮榮，陳 龍,

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇省中藥藥效與安全性評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省中醫(yī)院，南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；3．南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210093；4. 泰州中國醫(yī)藥城中醫(yī)藥研究院，江蘇 泰州 225300)

蟾酥注射液中的主要成分為動物毒素——蟾酥。蟾酥是我國傳統(tǒng)名貴藥材，為蟾蜍科動物中華大蟾蜍或黑眶蟾蜍耳后腺和皮膚腺分泌的白色漿液加工而成。蟾酥中的主要成分有強(qiáng)心甾烯蟾毒類，其有效成分多為脂溶性成分，蟾蜍甾烯類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)與強(qiáng)心苷類化合物類似，具有強(qiáng)心苷樣作用。有多種蟾酥類藥物制劑應(yīng)用于臨床，包括口服劑型、外用劑型及注射劑型等17種成方制劑[1]。蟾酥具有廣泛的藥理作用，包括抗腫瘤、強(qiáng)心、升壓、鎮(zhèn)痛、麻醉等作用?；隗杆值倪@些藥理作用，其用于靜脈注射的劑型-蟾酥注射液用于清熱解毒，急慢性化膿感染[2]，以及抗腫瘤輔助用藥。然而，作為蟾酥注射液的主要成分蟾酥，其不良反應(yīng)涉及多器官系統(tǒng)，主要分為神經(jīng)系統(tǒng)異常、循環(huán)系統(tǒng)異常以及消化系統(tǒng)異常，其中心臟毒性尤為突出[3-4]。

蟾酥注射液臨床上主要用于抗炎，機(jī)體出現(xiàn)炎癥時，產(chǎn)生以IL-6為主的炎癥因子風(fēng)暴，IL-6主要由單核-巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和纖維母細(xì)胞合成。IL-6由184個氨基酸殘基組成，有2個絲氨酸和2個蘇氨酸可成為蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)。IL-6與跨膜型IL-6受體(mIL-6R) (經(jīng)典信號通路)或血清中可溶性IL-6受體(sIL-6R) (反式信號通路) 結(jié)合，IL-6/IL-6R復(fù)合體募集普遍表達(dá)在細(xì)胞膜上的分子量為130 000的糖蛋白130(glycoprotein 130，gp130)，形成了由2個IL-6、2個IL-6R和2個gp130 亞基組成的IL-6/IL-6R/gp130六聚復(fù)合體。六聚復(fù)合體通過多個信號通路，引發(fā)下游信號連鎖反應(yīng)[5]。

實(shí)際上，有研究表明，IL-6抑制心肌細(xì)胞hERG (Ikr)電流而延長心電圖QT間期[6]，自身免疫性疾病患者的QT間期明顯延長[7]。這些從2016起發(fā)表的研究成果并沒有受到重視，直到新冠肺炎(COVID-19)暴發(fā)以后才得以廣泛關(guān)注。大量研究表明，COVID-19患者體內(nèi)釋放大量炎癥因子，導(dǎo)致不同程度的心律失常[8-9]，而阻斷心肌細(xì)胞膜上IL-6受體的托珠單抗(tocilizumab)能夠有效對抗COVID-19患者的心律失常[10]，以及其他免疫性疾病導(dǎo)致的心律失常[11]。

基于蟾酥注射液臨床上用于急慢性化膿感染的炎癥疾病，本實(shí)驗(yàn)將使用豚鼠在體心電圖技術(shù)，觀察蟾酥注射液對心電圖各指標(biāo)的作用；并研究其對心室肌細(xì)胞動作電位、鈣電流及鈉電流的作用，分析IL-6加重蟾酥注射液潛在心律失常的作用機(jī)理。通過本實(shí)驗(yàn)評價蟾酥注射液臨床使用中，在治療炎癥性疾病可能導(dǎo)致心律失常風(fēng)險和種類。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑蟾酥注射液購于泰州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，規(guī)格：2 mL/支，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z32020693；重組人IL-6購于Pepro TECH (USA,No 200-06)；其他化學(xué)試劑均購自Sigma-Aldrich (USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器RM6240BD型多道生理信號采集處理系統(tǒng)，HSS-1(B)恒溫水浴槽，Langendorff離體心臟灌流裝置均由成都儀器廠生產(chǎn)；膜片鉗儀Axopatch 200B和Axon Digidata 1550數(shù)模轉(zhuǎn)換器，Axon Instruments，USA；MP-225三維液壓微操縱器和P-97微電極拉制儀, Sutter Instruments，USA；Olympus IX53 倒置熒光顯微鏡(Japan)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物豚鼠體質(zhì)量(250～300)g，雌雄不拘。由南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇) 2019-0005；實(shí)驗(yàn)動物使用許可證：SYXK(蘇) 2018-0048。

1.4 濃度設(shè)計

1.4.1在體實(shí)驗(yàn)蟾酥注射液濃度的計算方法 關(guān)于人體與動物實(shí)驗(yàn)的劑量換算：根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)，按照體表面積系數(shù)和每千克體重進(jìn)行比較[12]，豚鼠劑量為人體劑量的4.6倍。并按照說明書規(guī)定：注射用蟾酥注射液的成人臨床劑量為每人每天20 mL(靜脈滴注)，即0.33 mL·kg-1(按成人60 kg計算)。換算到豚鼠，則1倍臨床劑量為1.5 mL·kg-1[13-14]。蟾酥注射液的豚鼠在體實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的臨床1、5、10倍臨床劑量分別為1.5、7.5、15 (mL·kg-1)。

1.4.2離體實(shí)驗(yàn)蟾酥注射液濃度的計算 按照蟾酥注射液說明書規(guī)定：成人用量為每人每天20 mL(靜脈滴注)，即0.33 mL·kg-1。成人細(xì)胞外液約占體質(zhì)量的20%，那么換算成臨床血藥濃度即為1.7 mL·L-1，基于上述方法，離體實(shí)驗(yàn)1倍臨床濃度為1.7 mL·L-1[13-14]。蟾酥注射液的豚鼠離體實(shí)驗(yàn)對應(yīng)的臨床1、 5、 10濃度分別為1.7、 8.5、17 (mL·L-1)。

1.4.3IL-6在體離體實(shí)驗(yàn)劑量及濃度計算 IL-6被用于心肌細(xì)胞電生理研究的濃度為(20 μg·L-1)[8]，根據(jù)上述在體與離體換算比例，離體(20 μg·L-1)的濃度，對應(yīng)的在體劑量為(18.4 μg·kg-1)。

1.5 在體心電圖實(shí)驗(yàn)豚鼠由20%烏拉坦(5 mL·kg-1)進(jìn)行腹腔注射麻醉，仰臥位固定，分離出頸外靜脈，引導(dǎo)記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。靜脈緩慢累計注射蟾酥注射液 (1，5，10倍臨床劑量)并穩(wěn)定5 min，記錄前后的心電圖；或靜脈緩慢注射IL-6(18.4 μg·kg-1)，記錄前后的心電圖，再緩慢累計注射蟾酥注射液 (1, 5, 10倍臨床劑量)，記錄前后的心電圖，各組之間穩(wěn)定5 min。分析心率(HR), P-R, QRS及QTc間期，QTc=QT/RR1/3(ms)[13-14]。在體實(shí)驗(yàn)對照實(shí)驗(yàn)表明，5 mL生理鹽水靜脈緩慢注射對心電圖無作用(P>0.05,n=5)。

1.6 動作電位、L-type Ca2+及Na+電流記錄電流鉗法用于記錄動作電位[13-14]。酶解法(膠原酶Ⅱ型2 g·L-1)分離豚鼠單個左心室肌細(xì)胞[15]。動作電位記錄的細(xì)胞外液組成為(mmol·L-1)：NaCl 117、KCl 5.7、NaHCO34.4、MgCl21.7、CaCl21.8、HEPES 20、葡萄糖20, 用NaOH 調(diào)pH至7.3。電極內(nèi)液為(mmol·L-1)：KCl 135、EGTA 10、HEPES 10、葡萄糖 5、K2ATP 3、Tris GTP 0.5, 用KOH 調(diào)pH至7.1。分析動作電位復(fù)極于90%水平的時程(APD90)。電壓鉗技術(shù)用于記錄L-type Ca2+電流，細(xì)胞外液組成為(mmol·L-1): NaCl 132、CsCl 5.4、CaCl21.8、MgCl21.8、NaH2PO40.6、4-AP 5、HEPES 10、Glucose 10,用NaOH 調(diào)pH至7.3。電極內(nèi)液為(mmol·L-1): CsCl 130、MgCl22、EGTA 11、HEPES 20、Glucose 10、Na2-ATP 2、Na-GTP 0.1，用CsOH 調(diào)pH至7.3。刺激方案: 鉗制電位為-80 mV, 然后去極到-40 mV并持續(xù)30 ms，再去極到0 mV并持續(xù)300 ms，最后鉗制電位回到-80 mV[13-14]。用于記錄Na+電流的細(xì)胞外液組成為(mmol·L-1): NaCl 70、Choline-Cl 70、 KCl 5.4、 MgCl21、 CaCl20.1、 HEPES 10、 Glucose 10、 NaH2PO40.33, 用NaOH 調(diào)pH至7.3。電極內(nèi)液為(mmol·L-1):CsCl 120、 EGTA 11、 HEPES 10、 Na2-ATP 5、 MgCl25、 CaCl21、 Glucose 11, 用CsOH調(diào)pH至7.3。刺激方案:鉗制電位為-80 mV, 然后去極到-40 mV并持續(xù)50 ms,最后鉗制電位回到-80 mV[13-14]。被分析的蟾酥注射液(1，5，10倍臨床劑量)溶于細(xì)胞外液分別灌流，上一濃度被下一個完全取代并穩(wěn)定5 min后記錄電壓或電流。

2 結(jié)果

2.1 蟾酥注射液、IL-6及合用對豚鼠在體心電圖的影響蟾酥注射液5、 10倍臨床劑量(7.5, 15 mL·kg-1)、IL-6(18.4 μg·kg-1)以及IL-6 (18.4 μg·kg-1)合用蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床劑量(1.5、 7.5、 15 mL·kg-1)均明顯延長P-R和QTc間期，而對HR, QRS無明顯作用。Tab 1、2及Fig 1分別為在體豚鼠ECG數(shù)據(jù)統(tǒng)計及代表性曲線。Fig 2顯示在無與有IL-6(18.4 μg·kg-1)合用條件下，進(jìn)行P-R及QTc間期比較。蟾酥注射液1, 5, 10倍臨床劑量(1.5、 7.5、 15 mL·kg-1)分別使P-R間期從標(biāo)準(zhǔn)化Control (100±5.9)%延長到(107±5.2)%、 (111±8.5)%、 (120±3.2)%；而在IL-6 (18.4 μg·kg-1) 合用條件下，P-R間期從標(biāo)準(zhǔn)化Control的(100±1.8)%延長到(119±7.4)%、 (124±7.8)%、(135±11.2)%。同樣QTc間期的變化為：無IL-6 (18.4 μg·kg-1) 合用條件下，從標(biāo)準(zhǔn)化Control的(100±3.2)%延長到(106±6.9)%、(110±5.1)%、(114±5.1)%；與IL-6 (18.4 μg·kg-1)合用條件下，從標(biāo)準(zhǔn)化Control(的100±8.3)%延長到(119±5.0)%, (127±6.2)%、(132±10.5)%。見Fig 2。

Fig 1 Representative in vivo guinea pig ECG curves before and after jugular veins injections of Chan Su (CS) (1, 5, 10 times clinically relevant doses, CRD) (A), or IL-6 plus CS (1, 5, 10 times CRD) (B), respectively.

Fig 2 Histograms of normalized P-R (A) and QTc (B) intervals to controls from in vivo guinea pig ECG, comparisons between Chan Su (CS) (1, 5, 10 times clinically relevant doses, CRD) and IL-6 (18.4 μg·kg-1) plus CS (1, 5, 10CRD)

Tab 2 Effects of IL-6 and combination of IL-6 and CS on HR, P-R, QRS and QTc intervals of guinea pig ECG in vivo n=5)

2.2 蟾酥注射液、IL-6及合用對對豚鼠動作電位的影響蟾酥注射液5、10倍臨床濃度(8.5、17 mL·L-1)、IL-6 (20 μg·L-1)以及IL-6 (20 μg·L-1)合用蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床劑量(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)均明顯延長APD90。Fig 3為豚鼠左心室肌細(xì)胞動作電位代表性曲線以及數(shù)據(jù)統(tǒng)計直方圖。蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床濃度(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)分別使APD90從Control的(413±17.3) ms延長到(432±18.2) ms、 (463±21.0) ms、 (546±30.3) ms；而在IL-6 (20 μg·L-1)合用條件下，APD90從Control的(393±11.6) ms延長到IL-6 (20 μg·L-1)的442±21.6 ms,再延長到(472±23.8) ms、(551±38.6) ms、(611±28.5) ms。蟾酥注射液1, 5, 10倍臨床濃度(1.7、8.5、17 mL·L-1)分別使APD90從標(biāo)準(zhǔn)化Control的(100±4.2)%延長到(105±4.4)%、(112±5.1)%、(132±7.3)%；與IL-6 (20 μg·L-1)合用條件下，從標(biāo)準(zhǔn)化Control的100±3.0%延長到(121±6.1)%、(140±9.8)%、(155±7.2)%。見Fig 3。

Fig 3 Representative action potential traces of CS (1, 5, 10 CRC) (A) and IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (B), statistical histograms of APD90 by CS (1, 5, 10 CRC) (C) and IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (D) and normalized APD90 (E) compared Chan Su (CS) (1, 5, 10 CRC) with IL-6 (20 mg·L-1) plus CS (1, 5, 10 CRC)

2.3 蟾酥注射液、IL-6及合用對鈣電流的影響蟾酥注射液5、10倍臨床濃度(8.5、17 mL·L-1)以及IL-6 (20 μg·L-1)合用蟾酥注射液1、5、10倍臨床劑量(1.7、8.5、17 mL·L-1)均明顯延長APD90。Fig 4為豚鼠左心室肌細(xì)胞鈣電流代表性曲線以及標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計直方圖。蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床濃度(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)分別使APD90從標(biāo)準(zhǔn)化Control的100±4.8%分別抑制到(91±13.5)%、 (79±12.)2%、 (67±9.8)%；與IL-6 (20 μg·L-1)合用條件下，從標(biāo)準(zhǔn)化Control的(100±14.0)%抑制到IL-6 (20 μg·L-1) (86±12.4)%，再分別抑制到(70±7.5)%、 (60±8.0)%、 (52±5.3)%。見Fig 4。

Fig 4 Representative Ca2+ current traces of CS (1, 5, 10 CRC) (A) and IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (B), normalized histograms of Ca2+ currents by CS (1, 5, 10 CRC) (C) and IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (D) and comparisons (E) between Chan Su (CS) (1, 5, 10CRC) with IL-6 (20 μg/mL) plus CS (1, 5, 10CRC)

2.4 蟾酥注射液、IL-6及合用對鈉電流的影響蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床濃度(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)、IL-6 (20 μg·L-1)以及IL-6 (20 μg·L-1)合用蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床濃度(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)均未能明顯影響鈉電流。Fig 5為豚鼠左心室肌細(xì)胞鈉電流代表性曲線以及標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)據(jù)統(tǒng)計直方圖。蟾酥注射液1、 5、 10倍臨床濃度(1.7、 8.5、 17 mL·L-1)分別使鈉電流從標(biāo)準(zhǔn)化Control的(100±8.5)%改變到(100±8.8)%、 (98±6.2)%、 (96±8.8)%；與IL-6 (20 μg·L-1)合用條件下，從標(biāo)準(zhǔn)化Control的100±12.1%改變到IL-6 (20 μg·L-1)的(97±9.5)%，再分別到(99±12.8)%、 (94±9.0)%、 (92±9.3)%。見Fig 5。

Fig 5 Representative Na+ current traces of CS (1, 5, 10 CRC) (A) and IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (B), normalized histograms of Na+ currents by CS (1, 5, 10 CRC) (C), IL-6 combined with CS (1, 5, 10 CRC) (D) and comparisons (E) between Chan Su (CS) (1, 5, 10 CRC) with IL-6 (20 mg·L-1) plus CS (1, 5, 10 CRC)

3 討論

心律失常是藥物的心臟毒性最重要部分，嚴(yán)重狀態(tài)下會導(dǎo)致患者猝死。因此，國際人用藥物技術(shù)要求協(xié)調(diào)理事會(The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH)中安全性部分的S7B明確提出，任何一種藥物或制劑在進(jìn)入臨床試驗(yàn)前必須進(jìn)行心律失常風(fēng)險評估。我國于2017年6月加入ICH組織，標(biāo)志著許多沒有通過心臟安全性評價的制劑需要進(jìn)行再評價。藥物心臟安全性評價是一系列復(fù)雜的科學(xué)研究，包括在體動物實(shí)驗(yàn)、離體心臟實(shí)驗(yàn)、心肌細(xì)胞動作電位以及多種離子通道實(shí)驗(yàn)。

本研究分別研究了單獨(dú)蟾酥注射液，以及在IL-6與蟾酥注射液合用對豚鼠心電圖各指標(biāo)的作用，及其所基于的離子通道作用機(jī)理。蟾酥注射液5倍以上臨床劑量條件下，導(dǎo)致在體豚鼠的P-R及QTc間期明顯延長；而蟾酥注射液5倍以上臨床濃度條件下，APD90明顯延長以及Ca2+電流明顯被抑制是其心電圖改變的機(jī)理。此外，IL-6 (18.4 μg·kg-1)同樣導(dǎo)致在體豚鼠的P-R及QTc間期明顯延長，IL-6 (20 μg·L-1)明顯延長APD90。由于IL-6的作用，蟾酥注射液1倍以上臨床劑量導(dǎo)致P-R及QTc間期明顯延長。對豚鼠左心室肌細(xì)胞Na+電流研究表明，蟾酥注射液(10倍臨床濃度)、IL-6 (20 μg·L-1)以及IL-6 (20 μg·L-1)合用蟾酥注射液(10倍臨床濃度)均未能明顯改變Na+電流。

P-R間期是心房開始興奮到心室開始興奮的時間，其延長主要是房室結(jié)傳導(dǎo)的延遲。房室結(jié)的去極化主要是鈣離子通過鈣通道引起的，其傳導(dǎo)延遲標(biāo)志蟾酥注射液具有鈣通道的抑制作用。QRS是開始興奮到興奮結(jié)束的時間，代表心室內(nèi)浦氏纖維的傳導(dǎo)速度，其快速去極化是鈉離子通過鈉通道形成的。表明蟾酥注射液對浦氏纖維的鈉通道無明顯作用。QTc是心室開始興奮到完全回復(fù)到靜息狀態(tài)，包括有鈉通道介導(dǎo)的去極以及復(fù)極過程，而復(fù)極是IKr電流介導(dǎo)的[16]，表明蟾酥注射液IKr電流具有明顯抑制作用，通常某濃度化合物抑制IKr電流10%～20%就可導(dǎo)致APD90和QTc的延長[17]。在隨后左心室肌細(xì)胞動作電位實(shí)驗(yàn)中，證明動作電位復(fù)極時程隨蟾酥注射液的濃度增加逐步延長。表明蟾酥注射液對IKr電流有明顯抑制作用。雖然本研究并沒有研究IKr電流，但APD90延長與IKr電流抑制的程度基本成正相關(guān)。

被用于心臟安全性評價的化合物最高劑量和濃度，國際上并沒有一個明確的規(guī)定，但學(xué)術(shù)界一般認(rèn)為取決于其臨床目的。用于重癥疾病(如腫瘤晚期)的藥物，10倍于治療量無心電圖及離子通道抑制作用就可接受，用于中等嚴(yán)重疾病(如中風(fēng)等)的藥物需30倍于治療量，而用于輕微的疾病需100倍以上的治療量[18]。按照這個標(biāo)準(zhǔn)，蟾酥注射液在臨床上存在心律失常的風(fēng)險，尤其在患者機(jī)體處于炎癥狀態(tài)。

綜上所述，本研究心電圖實(shí)驗(yàn)表明P-R及QTc間期延長，而動作電位研究證明了其時程延長。雖然動物實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了P-R及QTc間期延長的數(shù)字化，但臨床上潛在的心律失常發(fā)生率取決于蟾酥注射液靜脈給藥的速度，更關(guān)鍵的是病人本身存在的心律失常的狀態(tài)。按照ICH國際標(biāo)準(zhǔn)評價，蟾酥注射液存在心律失常高風(fēng)險，但實(shí)際上臨床蟾酥注射液并沒有出現(xiàn)高心律失常的發(fā)生率。其原因是ICH關(guān)注的QTc延長的快速性室性心律失常，并不關(guān)注以P-R間期為特征的緩慢性心律失常。實(shí)際上，QTc延長的快速性心律失常在臨床上會采用鈣通道阻斷劑治療。也就是說，蟾酥注射液抑制鈣通道本身就要治療自身導(dǎo)致的室性快速性心律失常。因此，蟾酥注射液在臨床上易導(dǎo)致房室傳導(dǎo)阻滯，而非ICH關(guān)注的快速性室性心律失常，有房室傳導(dǎo)阻滯以及炎癥反應(yīng)的患者應(yīng)該謹(jǐn)慎使用蟾酥注射液。