翁晨虹，張亞洲，李佑杰，許燕燕，周秋白

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江西 南昌 330045）

【研究意義】黃鱔（Monopterus albus），是我國特色淡水魚養(yǎng)殖品種。根據(jù)中國漁業(yè)年鑒的數(shù)據(jù)統(tǒng)計，2007—2018 年的12 年間，黃鱔養(yǎng)殖產(chǎn)量由19.619 萬t 增長至31.9 萬（t最高產(chǎn)量為38.613 7 萬t），在我國的經(jīng)濟(jì)水產(chǎn)養(yǎng)殖種類扮中演著越來越重要的角色。然而，黃鱔的高密度集約化養(yǎng)殖和高脂飼料的大量投喂導(dǎo)致其代謝紊亂和肝膽疾病頻發(fā)，危害極大，給該養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。瘦素（leptin，Lep）是一種蛋白質(zhì)類激素，最初是在小鼠被鑒定到的[1]，后來在哺乳動物中得到了廣泛的研究。其在哺乳動物中主要由脂肪組織產(chǎn)生，在食欲、能量穩(wěn)態(tài)、繁殖、免疫反應(yīng)和骨形成等生理過程的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。大量報道顯示Lep/LepR 系統(tǒng)在魚類的攝食和能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要功能。通過對黃鱔Lep/LepR系統(tǒng)基因的分子克隆及組織表達(dá)特性分析，為硬骨魚瘦素系統(tǒng)進(jìn)化提供新見解，給黃鱔生殖及營養(yǎng)代謝研究提供一定的基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】在硬骨魚類中最先是在河豚（Takifugu rubripes）中鑒定到了Lep的存在，并且主要在肝臟中表達(dá)[3]。隨后在其他很多硬骨魚中對Lep進(jìn)行的廣泛的研究，發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物L(fēng)ep 的同源性很低，但是其預(yù)測的蛋白的三維結(jié)構(gòu)卻在哺乳動物和硬骨魚中是保守的[4-7]。到目前為止，所有研究顯示在的哺乳動物和兩棲動物都只表達(dá)了一種Lep 的同源物，然而在硬骨魚似乎主要有兩種Lep基因即LepA和LepB基因。目前已經(jīng)在多種魚類同時鑒定到LepA和LepB基因，包括斑馬魚（Danio rerio）[8]、石斑魚（Epinephelus coioides）[4]、鯉魚（Cyprinus carpio var.Jian）[9]、大西洋鮭魚（Salmo salar）[10]、虹鱒魚（Oncorhynchus mykiss）[11]及半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）[12]等，而在河豚[3]、銀花鱸魚（Morone saxatilis）[13]及海馬（Hippocampus erectus）[5]卻只發(fā)現(xiàn)了一種LepA基因。Lep 的生理作用是由膜相關(guān)的瘦素受體（leptin receptor，LepR）介導(dǎo)的，在哺乳動物已知至少有6 種LepR 亞型，而只有長亞型具有細(xì)胞內(nèi)功能域。硬骨魚的LepR基因已經(jīng)在多種魚中被鑒定出來，值得注意的是，在大西洋鮭魚，歐洲鰻魚（Anguilla anguilla）和日本鰻魚（Anguilla japonica）同時鑒定到了兩個不同的LepR 類型（LepRa1/Lepra2或LepRa/LepRb），它們之間的功能差異還需要進(jìn)一步的研究?！颈狙芯壳腥朦c】目前，雖然已經(jīng)在哺乳動物及多種硬骨魚類中克隆到了Lep和LepR基因，但在合鰓目魚類中還未見其基因克隆于表達(dá)方面的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過克隆分別獲得Lep和LepR基因ORF序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和組織分布表達(dá)分析，為探明黃鱔Lep/LepR系統(tǒng)在生殖及營養(yǎng)代謝的分子調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所有動物試驗均經(jīng)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物保護(hù)與利用專業(yè)委員會批準(zhǔn)。實驗用魚為約1 冬齡的未成熟雌性黃鱔，取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。在室外水塘中網(wǎng)箱中飼養(yǎng)，自然光照，每天18:00用商品化黃鱔飼料飽食投喂1次。

1.2 總RNA提取和cDNA的合成

采用Vazyme 公司的RNA-easy Isolation Reagent 試劑盒提取總RNA，操作過程所用耗材均為無RNA酶耗材，其它用品均用DEPC 水處理。總RNA提取的具體步驟參考試劑盒操作手冊進(jìn)行。第一條cDNA模板鏈的合成參考HiScript Ⅲ1stStrand cDNA Synthesis Ki（tVazyme）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行。

1.3 基因克隆

從NCBI 數(shù)據(jù)庫黃鱔基因組數(shù)據(jù)庫搜索包含完整開放閱讀框（ORF）的黃鱔Leptin和LeptinR基因cDNA序列（XM_020613040、XM_020602810），利用Primer Premier 5在ORF上下游分別設(shè)計2對基因特異性引物（表1），引物有生工生物工程（上海）股份有限公司合成。以黃鱔肝臟第一鏈cDNA 為模板，用高保真PCR 試劑盒2×Phanta Max Master Mix（Vazyme）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變形5 min；95 ℃，15 s，56 ℃，20 s，72 ℃，1 min，進(jìn)行35個循環(huán)；72 ℃，5 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物分別用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用膠回收/DNA 純化試劑盒FastPure Gel DNA Extraction Mini Ki（tVazyme）將目標(biāo)條帶回收、純化，再用TA 克隆連接試劑盒5min Universal Ligation Mix（Vazyme）將目標(biāo)片段連接到pUCm-T 載體（上海生工），然后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白色菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定，選取陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用ORF Finder 服務(wù)器（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）確定ORF 位置，并推導(dǎo)出氨基酸序列；利用SignalP5.0 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預(yù)測信號肽；使用TMHMM Server v.2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測跨膜域。使用Clustal Omega（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）進(jìn)行序列比對，并手動修改。用ExPASy（http://web.expasy.org/compute_pi/）分析蛋白的分子質(zhì)量和等電點。二級和三級蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由自動化蛋白質(zhì)建模服務(wù)器的ProModII（http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL）進(jìn)行估算。氨基酸序列通過ClustalW2（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）進(jìn)行分析，并用MEGA6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 實時熒光定量PCR

利用Applied Biosystems StepOneTM Real-Time PCR System 對黃鱔中Leptin和LeptinR在各個組織中的表達(dá)情況進(jìn)行實時熒光定量分析。熒光染料為ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme）。目的基因和內(nèi)參基因引物見表1。采用10μL 反應(yīng)體系：5μL ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、上下游引物各0.5μL、1μL cDNA 模板、3μL ddH2O。序為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃20 s，40個循環(huán)；熔解階段95 ℃15 s，65 ℃1 min、95 ℃15 s、0.5 ℃/20 s，每個樣品3個重復(fù)，待反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行熒光值變化曲線和溶解曲線分析。利用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)最終結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔Lep和LepR基因ORF序列的克隆

以黃鱔肝臟組織總cDNA 為模板，通過特異性引物（表1）進(jìn)行巢式PCR 的方法進(jìn)行目的片段的克隆。用第一輪PCR 特異性引物擴(kuò)增后得到多條彌散條帶（圖1A、C），將第一輪PCR 產(chǎn)物稀釋100 倍后，用第二輪PCR 特異性引物擴(kuò)增分別得到600 bp 左右（圖1B）和3 000 bp 左右（圖1D）的特異性條帶。將目的條帶回收后，連接到pUCm-T 載體上送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序，結(jié)果顯示其序列和基因組預(yù)測的序列一致。

圖1 黃鱔肝臟巢式PCR特異性擴(kuò)增試驗結(jié)果Fig.1 Results of nested PCR specific amplification test in the Monopterus albus liver

表1 研究所用引物序列Tab.1 Sequence of primers in this research

2.2 黃鱔Lep和LepR氨基酸序列特征分析

分析結(jié)果如圖2A所示，Lep基因ORF長度為486 bp，編碼161個氨基酸。利用SignalP 5.0 Server預(yù)測Lep 前體由20 氨基酸信號肽和140 氨基酸的成熟肽組成。成熟Lep 蛋白的預(yù)測分子量為15.62 ku，等電點為5.57，此外，還含有兩個保守的特征半胱氨酸殘基參與二硫鍵的形成。三維結(jié)構(gòu)模型預(yù)測顯示黃鱔Lep蛋白由4個α-螺旋組成（圖3C），并且和人Lep蛋白有很高的三級結(jié)構(gòu)一致性（圖3A、B）。

結(jié)果如圖2B 所示，LepR基因ORF 長度為3 537 bp，編碼1 178 個氨基酸。深入分析發(fā)現(xiàn)，LepR蛋白預(yù)測含有1 個38 氨基酸的信號肽、1 個775 氨基酸胞外片段、1 個23 氨基酸單跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個342-氨基酸胞內(nèi)片段。黃鱔LepR 的Lep 結(jié)合域估計為第401～609 個氨基酸殘基。另外，黃鱔LepR 也包含脊椎動物L(fēng)epR 中一些重要的功能域，包括3 個纖連蛋白III 型結(jié)構(gòu)域、1 個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域。

圖2 黃鱔Lep（A）及LepR（B）的核苷酸序列及推斷氨基酸序列Fig.2 The nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of Monopterus albus Lep（A）and LepR（B）

2.3 序列同源性分析

不同物種的Lep 蛋白的多個氨基酸序列比對如圖3C 所示。在蛋白質(zhì)水平上，黃鱔Lep 蛋白與斜帶石斑魚（90.68%）、條紋鱸（80.75%）、尼羅羅非魚（79.50%）、半滑舌鰨（65.00%）、青斑河豚（52.50%）、和紅鰭東方鲀（52.35%）具有較高的同源性，然而與其他魚類中報道的Lep 蛋白序列同源性下降到相對較低的水平（16.33%～29.33%）（表2）。

表2 黃鱔Lep氨基酸序列與其他物種百分比一致性比較Tab.2 Percent amino acid sequence identities among leptin of Monopterus albus and other species

圖3 黃鱔Lep的分子特征Fig.3 Molecular characterization of Monopterus albus leptin

此外，黃鱔LepR 與大黃魚（78.55%）、斜帶石斑魚（78.08%）、大菱鲆（74.57%）、尼羅羅非魚（70.11%）序列同源性較高，其次是半滑舌鰨（61.87%）、紅鰭東方鲀（62.65%）、青鳉（55.52%）和大西洋鮭（50.23%），而與其他非魚類物種的同源性很低，都通常低30%（表3）。

表3 黃鱔LepR氨基酸序列與其他物種百分比一致性比較Tab.3 Percent amino acid sequence identities among leptin receptor of Monopterus albus and other species

2.4 構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹

Lep 和LepR 蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹被構(gòu)建了出來，其中包含克隆到的黃鱔Lep 和LepR 序列。系統(tǒng)發(fā)育上，黃鱔Lep 與硬骨魚棘鰭總目報道的Lep 親緣關(guān)系較近，與鮭形目和鯉形目的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)（圖4A）。同樣，黃鱔LepR也屬于硬骨魚棘鰭總目LepR分支，與鮭形目和鯉形目分支較遠(yuǎn)（圖4 B）。

圖4 Lep（A）和LepR（B）在脊椎動物中的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of Lep（A）and LepR（B）in vertebrates

2.5 黃鱔Lep和LepR基因表達(dá)的組織分布

通過熒光定量PCR 技術(shù)研究了黃鱔Lep和LepR基因在14種組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，Lep基因主要在下丘腦、大腦、胃、后腸、皮膚以及卵巢中表達(dá)，并且在胃中表達(dá)量最高（圖5A），在其他所檢測的組織中表達(dá)量很低或不表達(dá)。Lep基因除腎臟和前腸以外的大部分組織均有明顯表達(dá)，且在下丘腦、大腦、肝臟、胃以及卵巢中有著較高的表達(dá)量（圖5B）。

圖5 Lep（A）及LepR（B）mRNA在黃鱔各組織中的相對表達(dá)量Fig.5 Relative expression of Lep（A）and LepR（B）mRNAs in various tissues of Monopterus albus

3 討論與結(jié)論

從黃鱔的肝臟中分離了編碼Lep和LepR的ORF序列，這是第一次在合鰓目魚類中鑒定到Lep/LepR系統(tǒng)的存在。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)盡管與其他脊椎動物中Lep的氨基酸序列差異很大（表1），但從預(yù)測三維結(jié)構(gòu)來看，黃鱔Lep 與包括人類在內(nèi)的其他已確認(rèn)的Lep 之間的三級結(jié)構(gòu)具有很強(qiáng)的保守性（圖3A），包含4個a-螺旋結(jié)構(gòu)域，該序列和結(jié)構(gòu)特征與其他所有報道的魚類相一致[4-5,11,14-15]。說明這種保守的Lep晶體結(jié)構(gòu)可能對Lep/LepR結(jié)合親和性起到重要作用。有意思的是，目前已經(jīng)在多種魚類（如斑馬魚[8]、石斑魚[4]、鯉魚[9]、大西洋鮭魚[10]、虹鱒魚[11]及半滑舌鰨[12]等）同時鑒定到兩種Lep基因，分別命名為LepA和LepB，這可能起源于魚類進(jìn)化早期的基因組復(fù)制。但在黃鱔中卻只發(fā)現(xiàn)了一種Lep基因，這與河豚[3]、銀花鱸魚[13]及海馬[5]等魚類相似，并且分析發(fā)現(xiàn)黃鱔的Lep基因與魚類的LepA同源性更高，且在進(jìn)化上也屬于同一分支，因此推測黃鱔Lep基因可能屬于LepA亞型家族。

黃鱔與其他脊椎動物一樣都只發(fā)現(xiàn)單一的LepR基因，預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)分析顯示LepR為一種單次跨膜受體，包含一些重要的功能域包括3個纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域、1個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域以及Lep結(jié)合域，在于在半滑舌鰨[12]、日本鯖[6]等魚類中的研究一致。說明LepR 除介導(dǎo)Lep的生理功能外還可能發(fā)揮更加豐富的生理作用。有研究發(fā)現(xiàn)重組LepA 比LepB 對尼羅羅非魚的LepR 有更高的親和力[7]，暗示LepR 在魚體內(nèi)主要介導(dǎo)LepA 的生理作用，而LepB基因的生理功能和意義仍然未知。另外，在大西洋鮭魚[22]和尼羅羅非魚[7]中報道了多個LepR剪接變異體的存在。然而，黃鱔中并沒有檢測到剪接變異體。

在脊椎動物中，LepmRNA的組織分布差異很大。哺乳動物的Lep主要在脂肪組織中合成[7]。與哺乳動物不同，LepA主要在河豚[3]、鯉魚[16]、青鳉[14]、虹鱒魚[17]、條紋鱸魚[13]、白云山鰷魚[18]、異齒裂腹魚[19]、大黃魚[20]及大口黑鱸[21]等魚的肝臟中表達(dá)，這表明肝臟是Lep在這些物種中表達(dá)的主要部位，這也可能是肝臟富含脂質(zhì)的原因。在其他硬骨魚中，在石斑魚[4]、大西洋鮭魚[22]、海馬[5]和半滑舌鰨[12]的大腦中可以檢測到相當(dāng)程度的LepAmRNA，而在外周組織中，LepAmRNA主要在卵巢中表達(dá)[4-5,12,22]。Lepb的表達(dá)廣度要遠(yuǎn)低于LepA，僅在腦、眼睛及卵巢有較高量的表達(dá)[4-5,14]。同樣，在黃鱔的腦和卵巢中也觀察到高水平的LepmRNA 表達(dá)，這暗示Lep可能和其他魚類一樣在生殖過程中起重要生理作用。出乎意料的是LepmRNA的最高表達(dá)量出現(xiàn)在黃鱔的胃中，這可能和黃鱔獨(dú)特的攝食習(xí)性有關(guān)。另外，在之前的報道中LepRmRNA 在大西洋鮭魚[22]、歐洲鰻魚[23]、歐洲鱸魚[24]和海馬[5]以及半滑舌鰨[12]的卵巢中表達(dá)最為豐富。在黃鱔中也觀察到了相似的情況，卵巢中的LepR表達(dá)豐度很高僅次于下丘腦。

綜上所述Lep和LepR在魚卵巢中都有表達(dá)量較高，而在黃鱔中的表達(dá)模式與其他報道的魚類高度相似，提示Lep/LepR系統(tǒng)可能在黃鱔的生殖及營養(yǎng)代謝方面發(fā)揮重要作用。到目前為止，對魚類Lep 的研究多集中在能量代謝方面，而關(guān)于魚類Lep 生殖功能的報道有限[25]。在黃鱔中對Lep/lepr系統(tǒng)的研究結(jié)果，將有助于魚類瘦素系統(tǒng)在生殖及營養(yǎng)代謝功能方面作用的探索。

致謝：江西省教育廳科技計劃項目（GJJ200449）同時對本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！