葉 瑩，霍 達，2，張曉陽，3，劉 冰，熊桂紅，彭文文，周慶紅，黃英金，蔣軍喜*

（1.江西農業(yè)大學 農學院/江西省薯芋生物學重點實驗室，江西 南昌 330045；2.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300；3.江西省九江市植保植檢局，江西 九江332000）

【研究意義】芋頭是天南星科（Araceae）芋屬（Colocasia）多年生塊莖植物[1]，因其營養(yǎng)豐富，口感粉糯，質地細膩而廣受消費者青睞。由鐮刀菌（Fusariumspp.）引起的芋頭干腐病是國內外芋頭貯藏期重要的真菌病害[2-4]，罹病塊莖發(fā)生皺縮、腐爛，直至空腔，失去食用價值?；瘜W防治仍是目前有效防治芋頭干腐病的主要措施，但由此引發(fā)的環(huán)境污染、病菌抗藥性和農藥殘留等問題越來越引起人們的擔憂[5]。生物防治作為一種安全有效無污染的植物病害防治方法，成為當今植物病害防控的研究熱點[6]。因此，篩選鑒定出對芋頭干腐病菌具有顯著拮抗作用的生防菌株，對芋頭干腐病的生物防治具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已報道對鐮刀菌干腐病具有良好防效的生防菌有木霉菌（Trichoderma）、鏈霉菌（Streptomyces）、假單胞菌（Pseudomonas）和芽孢桿菌（Bacillus）等。張茹等[7]從馬鈴薯根際土壤分離得到的長枝木霉（T.longibrachiatum）和深綠木霉（T.atroviride）對接骨木鐮刀菌的抑菌率均高于80%；張紊瑋等[8]研究發(fā)現假單胞菌屬菌株YL11的無菌發(fā)酵液對硫色鐮刀菌的菌絲生長、孢子萌發(fā)和毒素活性均有顯著抑制作用；牛世全等[9]從河西走廊鹽堿土壤中分離得到的球孢鏈霉菌（S.globisporus）發(fā)酵液對馬鈴薯干腐病的防效達65.46%；暹羅芽孢桿菌（B.siamensis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、死谷芽孢桿菌（B.vallismortis）、解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B.methylotrophicus）等對馬鈴薯干腐病菌表現出良好的抑制效果[10-12]?！颈狙芯壳腥朦c】芽孢桿菌是植物根際最為豐富的細菌類群，具有抗菌譜廣、繁殖快、抗逆性強和生物安全性高等優(yōu)點[13-14]，它們通過拮抗作用、競爭作用及誘導植物獲得系統(tǒng)抗性等機制在植物病害生物防治中發(fā)揮重要作用[15-16]。目前關于鐮刀菌干腐病的生物防治僅在馬鈴薯上開展了較多研究，國內外尚無關于芋頭干腐病生防芽孢桿菌篩選鑒定的報道?！緮M解決的關鍵問題】本研究擬從植物根際土壤中分離篩選對芋頭干腐病具有顯著拮抗作用的芽孢桿菌，對該菌株進行種類鑒定及抑菌譜測定，以期為芋頭干腐病及其他病害的生物防治提供新的生防菌株，為生防菌劑的研發(fā)應用奠定前期工作基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土樣 福建省南平市武夷山茶苗合作社基地的茶樹根際土壤。

1.1.2 供試病原菌 芋頭干腐病菌（尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮刀菌（F.proliferatum）和茄鐮刀菌（F.solani））、獼猴桃果實熟腐病菌（Botryosphaeria dothidea）、獼猴桃黑斑病菌（Alternaria alterna-ta）、獼猴桃白紋羽病菌（Rosellinia necatrix）、獼猴桃棒孢葉斑病菌（Corynespora cassiicola）、茶輪斑病菌（Pseudopestalotiopsis camelliae-sinensis）、茶炭疽病菌（Colletotrichum fructicola）和茶雙毛殼孢葉斑病菌（Discosia rubi）共10 種病原真菌；水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）、柑橘潰瘍病菌（X.citrisubsp.citri）、辣椒細菌性斑點病菌（X.campestrispv.vesicatoria）、辣椒青枯病菌（Ralstonia solanacearum）和獼猴桃潰瘍病菌（Pseudomonas syringaepv.actinidiae）等5種植物病原細菌。供試菌株均由本實驗室前期分離鑒定保藏，經活化后備用。對照菌株為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）FJ17-4，由福建省農業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（NB）：蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，牛肉膏5 g，蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，瓊脂20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 生防芽孢桿菌的分離篩選及抑菌活性測定

1.2.1 土壤中芽孢桿菌的分離 采用稀釋平板分離法[17]對供試土樣中的芽孢桿菌進行分離。取滅菌風干后的供試土壤10.0 g 放入含90 mL 無菌水的三角瓶中，混合均勻后將稀釋液在85 ℃的水浴鍋中水浴30 min。用無菌水稀釋成10-3、10-4、10-5、10-6等不同濃度的土壤稀釋液，吸取100μL 各稀釋液均勻涂布NA平板，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)24 h，挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落劃線純化，純化后的菌株保存于4 ℃冰箱備用。

1.2.2 芽孢桿菌的篩選及病原真菌菌絲形態(tài)觀察 采用平板對峙法[18]，以芋頭干腐病的優(yōu)勢病原菌茄鐮刀菌作為指示菌進行拮抗菌篩選。實驗前將純化得到的芽孢桿菌分別接種于NA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)12 h，得到OD600為2.0的生防菌液。用直徑為5 mm的無菌打孔器沿菌落邊緣打取菌餅，將菌餅接種到PDA平板中央，在距平板中央3 cm處點接1μL生防菌液，以點接1μL無菌水作為對照，每處理重復3 次。接種后置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。選取有明顯抑菌作用的菌株進行復篩，方法同上。用十字交叉法測量對照菌落直徑和處理菌落直徑，按下述公式計算抑菌率。在菌餅周圍插上蓋玻片碎片，待菌絲長上去后取下碎片觀察菌絲的形態(tài)變化。選取抑菌效果最好的1株芽孢桿菌進行后續(xù)研究。抑菌率計算公式：

1.3 生防芽孢桿菌的形態(tài)觀察及生理生化指標測定

1.3.1 菌體形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察 將獲得的抑菌效果最好的芽孢桿菌菌株于NA固體培養(yǎng)基上純化，置于30°C 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，肉眼觀察菌落的形狀、顏色及菌落邊緣特征。通過革蘭氏染色及芽孢染色，觀察菌株形態(tài)。

1.3.2 生理生化測定 參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[19]和《植病研究方法》[20]，對待鑒定菌株D-1和對照菌株FJ17-4進行生理生化指標測定。

1.4 生防芽孢桿菌的分子生物學鑒定

1.4.1 基因組DNA 的提取 挑取純化后的單菌落至NB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h。使用生工生物工程（上海）有限公司的Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株總DNA，用超微量核酸蛋白測定儀測定總DNA的濃度和純度。

1.4.2 16SrDNA、gyrA和rpoB基因擴增及序列測定 以提取的基因組DNA 為模板，用引物對27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ）/1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ ）、42F（5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′）/1066R（5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′）和2292F（5′-AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC-3′）/3354R（5′-AAGAACCGTAACCGGCAACTT-3′）[21-23]分別對16SrDNA、gyrA和rpoB基因進行PCR 擴增。PCR 反應總體積25 μL，包含ddH2O 8.5 μL、2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL、正反向引物各1μL 和模板DNA 2μL。PCR 反應程序：94 ℃5 min；94 ℃30 s，50 ℃1 min，72 ℃2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 產物經10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托生工生物工程（上海）有限公司進行序列測定。

1.4.3 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹構建 將所得的16SrDNA、gyrA和rpoB基因原始序列用DNAStar 分析軟件進行序列拼接和核準后，提交到GenBank 中獲取序列登錄號，在NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中運行Blast 程序進行序列同源性搜索。下載相關菌株的對應基因序列，采用MEGA 7.0 軟件鄰接（Neighbour-joining）法分別構建基于16SrDNA、gyrA、rpoB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，根據序列同源性大小和系統(tǒng)發(fā)育關系，確定該菌株的種類歸屬。

1.5 生防芽孢桿菌的抑菌譜測定

1.5.1 對9種植物病原真菌的抑菌效果 除目標菌茄鐮刀菌外，對供試病原菌中的其他9種真菌進行抑菌效果測定，以明確其對植物病原真菌的抑菌范圍大小，測定方法同1.2.2。

1.5.2 對5 種植物病原細菌的抑菌效果 采用牛津杯法[24]，將純化后的5 種植物病原細菌和生防芽孢桿菌分別接種于NA 液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min 震蕩培養(yǎng)24 h，得到OD600為2.0 的生防菌液和病原菌液。分別吸取200μL相應病原菌液與NA固體培養(yǎng)基充分混勻后倒板，在NA平板中心放上直徑為5 mm的牛津杯，每個牛津杯內接70μL 生防菌液，每處理3 個重復，28 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察有無抑菌圈產生，測量并記錄抑菌圈直徑。

1.6 數據處理

使用Excel 2016、SPSS 21.0對所得數據進行統(tǒng)計處理，采用新復極差法進行差異顯著性檢驗（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離篩選及抑菌效果

從福建省南平市武夷山茶苗專業(yè)合作社基地的茶樹根際土壤中共分離得到89 株芽孢桿菌，用茄鐮刀菌篩選得到4 株有明顯拮抗作用的芽孢桿菌，其中菌株D-1 對茄鐮刀菌抑菌效果最好，抑菌率達74.5%（圖1-A）。通過鏡檢，發(fā)現被抑制的菌絲出現扭曲和節(jié)狀膨大等畸形現象（圖1-D）。

圖1 拮抗菌株D-1對茄鐮刀菌菌落和菌絲生長的抑制作用Fig.1 Inhibition effect of antagonistic strain D-1 on colony and hyphal growth of Fusarium solani

2.2 菌株D-1的形態(tài)觀察及生理生化指標測定

D-1 菌株在NA 培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)36 h 后，菌落圓形，乳白色，不透明，表面干燥有皺褶，邊緣不整齊，中央凹陷（圖2-A）。菌體呈桿狀，大小1.5～4.0 μm×0.4～0.6 μm，單個或成對排列，革蘭氏染色呈陽性，4 d后有大量橢圓形芽孢產生（圖2-B）。對D-1菌株進行生理生化特性測定，結果與對照菌株貝萊斯芽孢桿菌FJ17-4的生理生化測定結果一致（表1）。根據菌株D-1的形態(tài)特征和生理生化特性，參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，初步將菌株D-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

表1 拮抗菌株D-1的生理生化特性測定Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of the antagonistic strain D-1

圖2 拮抗菌株D-1的菌落及菌體形態(tài)特征Fig.2 Morphological features of colony and bacterium of antagonistic strain D-1

2.3 菌株D-1的16S rDNA、gyrA和rpoB序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

以供試菌株D-1的基因組DNA 為模板，分別擴增其16SrDNA、gyrA和rpoB基因片段，經電泳檢測后均獲得明亮單一的目的條帶（圖3），經測序得到長度分別為1 420，1 010，580 bp 的序列。將序列提交至GenBank數據庫，獲得的基因登錄號分別為MZ749456、MZ771302和MZ771303。通過對菌株D-1基因序列的BLAST 比對發(fā)現，這3 個序列與GenBank 中貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對應序列同源性均為100%。采用MEGA 7.0 軟件，分別構建基于16SrDNA、gyrA和rpoB基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示菌株D-1 的16SrDNA、gyrA和rpoB序列均與貝萊斯芽孢桿菌聚為一支（圖4A-C）。結合形態(tài)學特征、生理生化特性及序列分析結果，將拮抗菌株D-1鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）。

圖3 拮抗菌株D-1的不同基因PCR擴增產物電泳結果Fig.3 Electrophoresis of PCR products amplified from different genes of antagonistic strain D-1

圖4 基于16S rDNA（A）、gyrA（B）和rpoB（C）基因序列構建的芽孢桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of Bacillus based on 16S rDNA（A），gyrA（B）and rpoB（C）gene sequences

2.4 菌株D-1對植物病原真菌的抑制作用

菌株D-1 對9 種供試病原真菌菌絲生長均有較強的抑制作用（圖5），抑菌率為77.07%～60.80%（表2），其中對獼猴桃白紋羽病菌的抑制作用最強，對獼猴桃果實熟腐病菌的抑制作用最弱。

圖5 拮抗菌株D-1對9種植物病原真菌的抑菌作用Fig.5 Antagonistic effect of antagonistic strain D-1 on 9 plant pathogenic fungi

表2 拮抗菌株D-1 對9種植物病原真菌的抑制作用Tab.2 Antagonistic effect of strain D-1 on 9 plant pathogenic fungi

2.5 菌株D-1對植物病原細菌的抑制作用

菌株D-1對5種供試植物病原細菌均具有拮抗作用（圖6），抑菌圈直徑介于33.75～14.00 mm（表3），其中對獼猴桃潰瘍病菌和辣椒細菌性斑點病菌拮抗效果顯著，對其他3種植物病原細菌抑菌效果較弱。

表3 拮抗菌株D-1對5種植物病原細菌的抑制作用Tab.3 Antagonistic effect of strain D-1 on 5 plant pathogenic bacteria

圖6 拮抗菌株D-1對5種病原細菌的抑菌作用Fig.6 Antagonistic effect of antagonistic strain D-1 on 5 pathogenic bacteria

3 結論與討論

本研究從福建省南平市的茶樹根際土壤中分離篩選到1 株對芋頭干腐病菌具有明顯拮抗作用的生防芽孢桿菌菌株D-1，并對其進行了形態(tài)觀察、生理生化特性測定和分子生物學鑒定。其菌落形態(tài)特征和生理生化特性符合對貝萊斯芽孢桿菌（B.velezensis）的描述，測定的16SrDNA、gyrA和rpoB3 個基因序列與貝萊斯芽孢桿菌對應序列具有最高的同源性，在構建的系統(tǒng)發(fā)育上與貝萊斯芽孢桿菌也聚于一個分支，基于以上結果，將該菌株的種類鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。該菌不僅對芋頭干腐病菌（Fusariumspp.）具有顯著的抑菌效果，而且對多種其他植物病原真菌和病原細菌也有良好的拮抗作用，表現出廣譜抑菌活性，具有潛在的生防利用價值。

干腐病是薯芋類作物貯藏期發(fā)生的一種重要的真菌病害，國內外對馬鈴薯[25]、甘薯[26]和薯蕷[27]上的干腐病均有一定的研究，但對芋頭干腐病的研究很少，特別是對其生物防治研究尚未開展。周潔等[28]研究發(fā)現，南方鐮刀菌（F.meridionale）和變紅鐮刀菌（F.incarnatum）可引起湖北恩施魔芋干腐病，30%苯甲丙環(huán)唑乳油對2種病原菌的菌絲生長抑制率均達85%以上；趙璐藐等[29]研究表明，茄鐮刀菌（F.solani）可引起奉化地區(qū)芋艿的采后腐爛，檜木醇處理后可明顯抑制病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)，在控制芋艿采后病害方面具有較好的應用前景。本文從茶樹根際土壤中分離篩選到對芋頭干腐病菌（Fusariumspp.）具有明顯拮抗作用的生防貝萊斯芽孢桿菌D-1，為該病的生物防治提供了新的微生物資源。

致謝：江西省科技計劃項目（2018ACF60017）和江西省薯類產業(yè)技術體系建設項目（JXARS-19-01)同時對本研究給予了資助，謹致謝意！