梁超鵬，梁潔容，何俊烺，程?hào)|美

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 資源與環(huán)境學(xué)院，廣東 廣州 510225）

【研究意義】草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda），鱗翅目夜蛾科灰翅夜蛾屬，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]，具有繁殖能力強(qiáng)、環(huán)境適生性廣、遷飛性、暴食性、寄主廣等特點(diǎn)，是全球預(yù)警的跨國(guó)界遷飛性農(nóng)業(yè)重大害蟲(chóng)。2016 年1 月首次在他國(guó)尼日利亞發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)擴(kuò)散到110 個(gè)國(guó)家，危害多種作物[2]，嚴(yán)重威脅被侵入國(guó)的糧食生產(chǎn)和生態(tài)安全。2019年首次入侵我國(guó)，同年在全國(guó)26個(gè)省份發(fā)現(xiàn)，在華南、西南等地定殖；2020年在全國(guó)27個(gè)省（市、區(qū)）見(jiàn)蟲(chóng)，實(shí)際發(fā)生面積達(dá)134.6萬(wàn)hm2；2021年7月，全國(guó)19省份868個(gè)縣市發(fā)生草地貪夜蛾74.2萬(wàn)hm2，發(fā)生面積較去年同期增加19%。草地貪夜蛾的防治成為保障國(guó)家糧食和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全的迫切需求。金龜子綠僵菌是重要蟲(chóng)生真菌，寄主包括8 個(gè)目30 個(gè)科200 多種昆蟲(chóng)[6]，廣泛用于防治蔬菜、花卉、果樹(shù)及農(nóng)作物上的多種害蟲(chóng)，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和顯著的生態(tài)效益。【前人研究進(jìn)展】為有效控制草地貪夜蛾，我國(guó)制定了包括抗蟲(chóng)品種、種子處理、推-拉策略、誘殺和天敵利用、科學(xué)用藥等綜合防治措施。藥劑防治是當(dāng)前生產(chǎn)中主要措施之一，我國(guó)在產(chǎn)品篩選和登記中取得了較快的發(fā)展，已有14 個(gè)農(nóng)藥產(chǎn)品獲批用于防治草地貪夜蛾，其中包含蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）[3]、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）[4]、金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）[5]、甘藍(lán)夜蛾核型多角體病毒等10 種微生物菌劑，氯蟲(chóng)苯甲酰胺、乙基多殺菌素、溴?！む缦x(chóng)嗪等3 種化學(xué)農(nóng)藥，1 種植物源農(nóng)藥（苦參·印楝素），微生物菌劑成為防治的主要產(chǎn)品類(lèi)型?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】綠僵菌對(duì)草地貪夜蛾具有較強(qiáng)的致病性，在部分國(guó)家已登記為草地貪夜蛾防治藥劑，入選我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的草地貪夜蛾應(yīng)急防治用藥推薦名單，目前只有2個(gè)產(chǎn)品獲批登記用于草地貪夜蛾防治藥劑，草地貪夜蛾的生物防治技術(shù)和生防制劑還有待完善。【擬解決的問(wèn)題】本研究于廣州市番禺區(qū)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)上分離獲得一株蟲(chóng)生真菌，經(jīng)鑒定為金龜子綠僵菌，并研究其生物學(xué)特性和對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病力，以期豐富綠僵菌資源，并篩選出適合草地貪夜蛾防治的高效菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、蟲(chóng)源及飼養(yǎng)

金龜子綠僵菌菌株ZKJGL 廣州市番禺區(qū)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)上分離，鑒定后于實(shí)驗(yàn)室保存。實(shí)驗(yàn)前將菌株接種于PDA固體培養(yǎng)基上，在（25±1）℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

草地貪夜蛾幼蟲(chóng)由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)藥學(xué)系徐漢虹教授團(tuán)隊(duì)提供，在室內(nèi)孵化幼蟲(chóng)后以人工飼料飼養(yǎng)至化蛹，待羽化產(chǎn)卵后作為實(shí)驗(yàn)室供試蟲(chóng)源。室內(nèi)飼養(yǎng)條件為溫度（28±1）℃，相對(duì)濕度70%～90%，光周期L//D=16 h//8 h。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金龜子綠僵菌ZKJGL 菌株生物學(xué)特性試驗(yàn)方法 本試驗(yàn)設(shè)置5 個(gè)處理（溫度、pH、光周期、碳源、氮源），每處理重復(fù)3 次。將各處理放入（25±1）℃培養(yǎng)箱（溫度處理除外）培養(yǎng)，7 d 后記錄各處理菌落特征并測(cè)量其直徑。往每個(gè)處理培養(yǎng)皿中加入0.05%吐溫-80 溶液，刮下培養(yǎng)基上的全部分生孢子，制成孢子懸浮液，經(jīng)紗布過(guò)濾后，用血球計(jì)數(shù)板在生物顯微鏡下觀察并測(cè)定每個(gè)處理的孢子數(shù)量。

溫度處理：將ZKJGL 菌餅接于PDA 培養(yǎng)基上后，將其放入5 個(gè)不同溫度的培養(yǎng)箱內(nèi)（35，30，25，20，15 ℃），每個(gè)溫度處理重復(fù)3次。

pH處理：向滅菌后的PDA 培養(yǎng)基滴入1滴1%農(nóng)用鏈霉素，并用比色卡比對(duì)測(cè)定pH，按照測(cè)定的pH用0.1 mol/L NaOH 和0.1 mol/L HCl 溶液分別將PDA 培養(yǎng)基pH 調(diào)節(jié)9 個(gè)所需要的酸堿度（11、10、9、8、7、6、5、4、3），分別接入直徑為5 mm菌餅于不同酸堿度培養(yǎng)基中央。

光周期處理：將ZKJGL菌餅接于PDA培養(yǎng)基上，放置于25 ℃、3種不同光周期的培養(yǎng)箱中（24 L∶0 D、12 L∶12 D和0 L∶24 D）。

碳源處理：以察氏培養(yǎng)基（NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，2%瓊脂粉，蔗糖30 g，水1 000 mL，pH 自然）為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別以等量麥芽糖、葡萄糖、棉籽糖、纖維素等4種材料作為供試碳源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖以及缺碳處理，配制成6 種培養(yǎng)基，將ZKJGL 菌餅分別接于6種不同碳源培養(yǎng)基上。

氮源處理：基礎(chǔ)培養(yǎng)基為察氏培養(yǎng)基，分別以牛肉浸膏，硫酸銨，蛋白胨和酵母膏等4 種材料作為供試氮源替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鉀以及缺氮處理，制成6種不同氮源類(lèi)型的試驗(yàn)培養(yǎng)基，將ZKJGL 菌餅分別接于6種不同氮源培養(yǎng)基上。

1.2.2 金龜子綠僵菌ZKJGL 對(duì)草地貪夜蛾的侵染 將培養(yǎng)基表面分生孢子刮下制成6 種濃度的孢子懸浮液（1×108，5×108，5×107，1×107，5×106，1×106cfu/mL），以浸蟲(chóng)法[7]進(jìn)行致病力測(cè)定。將大小一致、健康的草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)在供試孢子懸浮液中浸漬5 s后取出，置于濾紙上吸取多余水分，移至6孔板以人工飼料按1.1方法正常飼養(yǎng)。將昆蟲(chóng)板放入25 ℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，光周期設(shè)為16 L∶8 D，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)20 頭蟲(chóng)。以滅菌含吐溫-80 溶液處理為對(duì)照組（CK）。每天定時(shí)觀察并記錄幼蟲(chóng)受侵染后的反應(yīng)，將死亡幼蟲(chóng)移出，在（25±1）℃、L//D＝16 h//8 h條件下保濕培養(yǎng)，根據(jù)蟲(chóng)體是否長(zhǎng)出目的菌確定各蟲(chóng)的死亡原因。連續(xù)察看7 d，計(jì)算草地貪夜蛾2 齡幼蟲(chóng)受ZKJGL 菌株侵染后死亡情況。按數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析方法計(jì)算累計(jì)死亡率和累計(jì)校正死亡率[8]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析方法

金龜子綠僵菌ZKJGL的生物學(xué)特性經(jīng)Excel整理后，采用DPS 7.05統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)各處理幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率和累計(jì)校正死亡率，利用LSD 法對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。使用SPSS 26.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用Probit方法計(jì)算求回歸方程、致死中時(shí)（LT50）、致死中濃度（LC50）及相關(guān)系數(shù)（R）。

2 結(jié)果與分析

2.1 金龜子綠僵菌ZKJGL生物學(xué)特性

2.1.1 溫度對(duì)菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 該菌在15～35 ℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，25～30 ℃

是菌落生長(zhǎng)的最適溫度域，15 ℃生長(zhǎng)緩慢。菌株在25 ℃時(shí)測(cè)得最高產(chǎn)孢量，其次為20 ℃，30 ℃和35 ℃時(shí)產(chǎn)孢量接近，15 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最低。說(shuō)明菌株ZKJGL生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適溫度為25 ℃（表1）。

表1 溫度對(duì)金龜子綠僵菌菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Tab.1 Effect of temperature on colony growth and sporulation of Metarhizium anisopliae ZKJGL

2.1.2 PH 對(duì)菌株ZKJGL 菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 該菌在pH5～11 范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在6 和7 時(shí)生長(zhǎng)最好，菌落直徑分別為30.95 mm 和30.55 mm，pH 在11 和3，不利于菌絲的生長(zhǎng)。菌株在pH 為10 時(shí)產(chǎn)孢量最大，為8.47×106cfu/mL；pH 為4 時(shí)產(chǎn)孢量最低。由此得知，菌株ZKJGL 菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適pH為6～7，pH過(guò)高或過(guò)低都對(duì)菌株的生長(zhǎng)不利（表2）。

表2 pH對(duì)金龜子綠僵菌菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Tab.2 Effect of pH on colony growth and sporulation of Metarhizium anisopliae ZKJGL

2.1.3 光周期對(duì)菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 光周期對(duì)菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響較小（表3）。在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，全光照、半光照和全黑暗條件下，菌落直徑無(wú)明顯差異；菌株在全黑暗條件下平均產(chǎn)孢量高于半光照和全光照，但從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度來(lái)看，各處理之間無(wú)明顯差異。由此得知，光周期對(duì)菌株ZKJGL的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢影響較小。

表3 光周期對(duì)金龜子綠僵菌菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Tab.3 Effects of photoperiod on colony growth and sporulation of Metarhizium anisopliae ZKJGL

2.1.4 碳源對(duì)菌株ZKJGL 菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 菌株ZKJGL 在6 種碳源的培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，以麥芽糖的利用率最高，培養(yǎng)7 d后菌落直徑為13.27 mm；葡萄糖、淀粉、蔗糖、纖維素、棉籽糖為碳源時(shí)，菌絲生長(zhǎng)速度相近。菌株在6種碳源培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量無(wú)明顯差異。說(shuō)明菌株ZKJGL 生長(zhǎng)和產(chǎn)孢對(duì)碳源要求較低（表4）。

表4 碳源對(duì)金龜子綠僵菌菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Tab.4 Effects of carbon sources on colony growth and sporulation of Metarhizium anisopliae ZKJGL

2.1.5 氮源對(duì)菌株ZKJGL 菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 該菌在供試的6 種氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，其中，以硝酸鉀、牛肉浸膏、酵母粉、蛋白胨的利用率較高，菌絲生長(zhǎng)較為旺盛，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑均大于11 mm；以硫酸銨氮源的時(shí)生長(zhǎng)最慢，培養(yǎng)7 d 后菌落直徑為4.32 mm，低于對(duì)照和其他氮源的菌落直徑。氮源對(duì)菌株的產(chǎn)孢量有影響，但差異不顯著，以蛋白胨、酵母膏、硝酸鉀為氮源的培養(yǎng)基上，產(chǎn)孢量在0.14×106cfu/mL 以上，略高于硫酸銨和牛肉浸膏。由此得知，菌株ZKJGL 培養(yǎng)對(duì)氮源要求不高，利用率較高的為蛋白胨、酵母膏（表5）。

表5 氮源對(duì)金龜子綠僵菌菌株ZKJGL菌落生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響Tab.5 Effects of nitrogen sources on colony growth and sporulation of Metarhizium anisopliae strain ZKJGL

2.2 金龜子綠僵菌ZKJGL對(duì)草地貪夜蛾的侵染效果

菌株ZKJGL孢子懸浮液處理草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)，各濃度處理均有死亡情況，表明菌株對(duì)其具有一定的致病力。從圖1 和表6 可見(jiàn)，試蟲(chóng)的死亡率隨孢子懸液濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。孢子懸浮液濃度為5×108cfu/mL 和1×108cfu/mL 時(shí)，幼蟲(chóng)的死亡率相近，處理后1～7 d 均無(wú)明顯差異，第7 天的死亡率分別為77.78%和74.07%，顯著高于其他濃度。各濃度的殺蟲(chóng)效果在第3天出現(xiàn)較為明顯差異，濃度在1×107cfu/mL 和5×106cfu/mL 的致死率明顯低于3個(gè)高濃度處理，濃度為1×106cfu/mL的處理致病性最弱，從處理后4 d 開(kāi)始，顯著低于其他處理，第7天的累積死亡率僅為40.74%。

表6 金龜子綠僵菌菌株ZKJGL對(duì)草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的活性Tab.6 Activity of Metarhizium anisopliae strain ZKJGL against S.frugiperda larvae

圖1 金龜子綠僵菌菌株ZKJGL孢子懸浮液對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致死率Fig.1 Mortality rate of Metarhizium anisopliae ZKJGL spore suspension against 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperda

從處理時(shí)間來(lái)看，孢子懸浮液的濃度為5×108cfu/mL 和1×108cfu/mL 的處理致死中時(shí)LT50較短，分別為3.925 d、4.295 d；LT50隨著孢子懸浮液濃度的降低而相應(yīng)的增大，濃度為5×107cfu/mL、1×107cfu/mL和5×106cfu/mL的LT50均大于5 d；1×106cfu/mL 濃度處理的LT50時(shí)間最長(zhǎng)，為7.294 d。處理7 d后，使用Probit模型，ZKJGL菌株孢子懸浮液對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病力回歸方程PROBIT（p）=-2.576+0.388X，LC50為4.406×106cfu/mL。

3 結(jié)論與討論

金龜子綠僵菌在農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治中起著重要作用，已被成功地用作許多土壤害蟲(chóng)的潛在生物防治劑[9]。從國(guó)內(nèi)外殺蟲(chóng)劑應(yīng)用總量上看，至今生物殺蟲(chóng)劑所占比例仍然很低，大約為1%～5%[10]，獲得更多高致病力菌株，研究其生物學(xué)特性和發(fā)酵境況，并保持其高致病力是推動(dòng)真菌殺蟲(chóng)劑發(fā)展的重要因素。為明確金龜子綠僵菌具體的生物學(xué)特性，黃鵬等[11]結(jié)合前人研究表明：金龜子綠僵菌FM-03菌株在溫度為25 ℃、光周期為12 L∶12 D、pH 為7、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)條件碳源為乳糖、氮源為酵母膏時(shí)菌株有最好的生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量。劉思雨[12]通過(guò)金龜子綠僵MAXD170705 菌株在SDAY 培養(yǎng)基上、于永浩等[13]通過(guò)金龜子綠僵菌JC002在PDA培養(yǎng)基的研究均發(fā)現(xiàn)溫度為25 ℃、pH為7的生長(zhǎng)量和生產(chǎn)孢量最好。侯穎等[8]研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌Ma121 在察氏瓊脂培養(yǎng)基Czapek 上，溫度為25～30 ℃、pH 為7、光周期為0 L∶24 D 的培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量最好。孫家寶等[14]研究發(fā)現(xiàn)金龜子綠僵菌在PPDA 培養(yǎng)基無(wú)光照條件下溫度25 ℃、pH 為6～8 時(shí)生長(zhǎng)量和產(chǎn)孢量最好。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ZKJGL 菌株的最適培養(yǎng)環(huán)境條件的溫度是25 ℃、光周期為0 L∶24 D、pH 為7，營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)條件中碳源為麥芽糖、氮源為蛋白胨，這與黃鵬[11]、劉思雨[12]、于永浩[13]、侯穎[8]、孫家寶[14]等學(xué)者的研究成果有一定的差異，分析原因可能與菌株的地理分布和寄主來(lái)源不同，ZKJGL菌株具有一定的生理差異所致。活性研究表明，菌株ZKJGL可以有效侵染草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)，具有較強(qiáng)的致死作用；在恒溫條件下培養(yǎng)4～5 d，死蟲(chóng)蟲(chóng)體表面有綠色分生孢子產(chǎn)生并逐漸長(zhǎng)滿蟲(chóng)體；試蟲(chóng)的累計(jì)死亡率隨處理的孢子懸液濃度的增加而升高，處理濃度為5×108cfu/mL時(shí)試蟲(chóng)的死亡率最大。

昆蟲(chóng)病原真菌是指能夠直接侵入健康昆蟲(chóng)體內(nèi)、迅速增殖和導(dǎo)致昆蟲(chóng)死亡的真菌類(lèi)群[15]。因其對(duì)環(huán)境友好，具有害蟲(chóng)不易產(chǎn)生抗性、易流行，被認(rèn)為是最有可能替代化學(xué)農(nóng)藥的下一代新型生物農(nóng)藥，在草地貪夜蛾防治中具有很大的應(yīng)用潛力[16-17]。研究金龜子綠僵菌的生物學(xué)特性及其對(duì)草地貪夜蛾的侵染力，為蟲(chóng)生真菌殺蟲(chóng)劑的生產(chǎn)以及防治草地貪夜蛾提供參考，最終目標(biāo)是能夠?qū)⒏咝Ь陸?yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治。本研究初步明確了金龜子綠僵菌菌株ZKJGL 對(duì)草地貪夜蛾的致病力，對(duì)菌株發(fā)酵培養(yǎng)及田間防效等還需要進(jìn)一步研究。

致謝：廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2021KJ133）同時(shí)對(duì)本研究給予了資助，謹(jǐn)致謝意！