謝采陽王斌珂翟晶晶楊喜張春麗蒲曉輝

河南大學(xué) 藥學(xué)院藥物研究所，河南 開封475000

槲皮素(Quercetin)廣泛存在于蔬菜、水果和茶中[1]，具有多種生物活性，如抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤和丙酮酸脫氫酶抑制作用等[2-5]，常被作為各類中藥材的有效成分進行質(zhì)量控制。槲皮素含量的檢測方法有電化學(xué)法(DPSV)[6-7]、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法(MALDI-MS)[8]和高效液相色譜法(HPLC)[9]等。其中，基于以量子點為熒光探針的熒光分析法具有便捷、快速、成本低等優(yōu)點，量子點在化學(xué)和生物學(xué)等方面應(yīng)用廣泛[10]。

熒光量子點(QDs)是一種直徑在10 nm 左右的半導(dǎo)體納米材料，通常由Ⅱ-Ⅵ、Ⅲ-Ⅴ、Ⅳ-Ⅵ族原子構(gòu)成，如CdSe/ZnS、CdSe、Cd Te、CdS、InP 等[11]。量子點由于其獨特的尺寸和可調(diào)光學(xué)特性引起了人們極大的興趣[12]。與傳統(tǒng)有機染料相比，量子點可以更高效地提供熒光信號，同時具有可精確調(diào)控的發(fā)射波長、寬激發(fā)光譜、窄發(fā)射光譜、高量子產(chǎn)率、較大的斯托克斯位移和良好的光穩(wěn)定性等優(yōu)點[13-14]，被廣泛應(yīng)用于生物檢測(如多巴胺、半胱氨酸、阿米卡星等的測定[15-17]和金屬離子Cu2+、As3+、Fe3+等的測定[18-20])。此外，量子點也可用于中藥有效成分的定量檢測。例如，Tan等[21]合成了巰基乙酸修飾的Cd Te量子點檢測山柰酚的含量。Zhu等[22]合成了聚合物包覆的雙量子點熒光傳感器用于檢測芥子酸。Chen等[23]合成了基于Cd Te量子點的紙基傳感器用于測定茶葉中的左旋茶氨酸。Zhang等[24]以巰基丙酸為穩(wěn)定劑合成了水溶性Cd Te量子點用于檢測莧菜紅。已有文獻報道了使用量子點作為熒光探針快速、高效檢測槲皮素的含量:Sadeghi等[25]合成了雙硫腙包覆的ZnS量子點，將其作為熒光探針用于生物樣品中槲皮素的測定，檢測限為2.50×10-7mol/L。Chen[26]等合成了巰基乙酸修飾的Cd Te量子點測定槲皮素，檢測限為1.7×10-7mol/L。然而，這些獲得水溶性量子點的制備過程所用試劑較多，須在高溫條件下進行，方法較為復(fù)雜，量子點熒光探針穩(wěn)定性有待提高。

本課題通過操作簡便的溶劑揮發(fā)法，采用兩種聚合物PMMA 和PMA-ODE 包裹油溶性CdSe/ZnS量子點，制備了熒光較強、穩(wěn)定性更好的羧基功能化的聚合物-量子點熒光微球，并基于槲皮素能夠猝滅量子點熒光的特性，將熒光微球作為探針對槲皮素進行定量檢測，建立了一種定量分析槲皮素的熒光光譜法。該方法檢測限可達4.20×10-7mol/L，在靈敏度、精確度以及抗干擾能力方面表現(xiàn)極佳。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

透射電子顯微鏡(TEM，JEM-2100，日本電子株式會社)，用于觀測CdSe/ZnS量子點與聚合物-量子點熒光微球的大小和形貌；熒光分光光度計(F-4600，日本株式會社)和紫外-可見分光光度計(UV-2600，日本島津公司)，用于光譜表征；高速分散均質(zhì)機(FJ-200，上海標本模型廠)，用于產(chǎn)生乳化作用。

聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚馬來酸酐-1-十八烯交替共聚物(PMA-ODE，Mn=30 000～50 000)購于Sigma-Aldrich 試劑公司；槲皮素(QCT))標準品購于阿拉丁試劑有限公司；十二烷基磺酸鈉購于Solarbio試劑公司；濃氨水、鹽酸、丙三醇、無水乙醇購于天津市富宇精細化工有限公司；磷酸氫二鈉、硝酸銀、氯化鈣、氫氧化鉀、磷酸二氫鉀、硼酸、四硼酸鈉、檸檬酸等購于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為去離子水。

1.2 油溶性CdSe/ZnS量子點和羧基功能化聚合物-量子點熒光微球的制備

油溶性CdSe/ZnS 量子點參考文獻[27]合成。羧基功能化聚合物-量子點熒光微球合成方法如下:在2 m L氯仿中加入5 mg油溶性CdSe/ZnS量子點、15 mg PMMA 和10 mg PMA-ODE 超聲分散，放置8 h；將40 mg十二烷基磺酸鈉溶于5 m L水中；將上述兩種溶液混合，用高速分散均質(zhì)機乳化形成水包油(O/W)乳液體系；攪拌結(jié)束后，將溶液轉(zhuǎn)入25 mL 單口圓底燒瓶中封口攪拌1 h，隨后揮發(fā)氯仿；氯仿?lián)]發(fā)完畢后離心除去上清液，加入5 m L水(含有10μL 濃氨水)超聲水解，用水洗滌兩次離心；最后將產(chǎn)物分散于5 m L水中保存，即得羧基功能化聚合物-量子點熒光微球。

1.3 QCT含量檢測

取200μL濃度為4.0 mg/m L的羧基化聚合物-量子點熒光微球、3.0 mL PBS緩沖溶液(p H=7.0)和0.8 m L待測樣品于標準試管中，搖勻。室溫放置1 h 后用熒光分光光度計檢測其熒光強度值F；用0.8 m L去離子水替換待測樣品配制空白組，檢測其熒光強度值F0，得ΔF；結(jié)合槲皮素含量檢測的標準曲線，計算樣品中槲皮素的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 羧基功能化聚合物-量子點熒光微球的制備及熒光穩(wěn)定性

羧基功能化聚合物-量子點熒光微球的制備示意圖，見圖1。先將兩種聚合物和CdSe/ZnS量子點分散于氯仿中形成有機相，再配制含有表面活性劑的水溶液備用?；旌蟽上?，在高速分散均質(zhì)機的劇烈攪拌下可形成水包油(O/W)乳液體系；通過攪拌緩慢揮發(fā)有機溶劑，即可制備出聚合物包裹的量子點熒光微球；將聚合物-量子點熒光微球置于堿性環(huán)境中(加入微量氨水)，使聚合物中馬來酸酐環(huán)水解，最終可制備出羧基功能化的聚合物-量子點熒光微球。

圖1 羧基功能化聚合物-量子點熒光微球的制備示意圖

CdSe/ZnS 量子點的TEM，見圖2A。CdSe/ZnS量子點分散均勻，平均粒徑約為9 nm。羧基功能化聚合物-量子點熒光微球的TEM，見圖2B。粒徑約為400 nm，微球中包裹著大量的CdSe/ZnS量子點。

圖2 CdSe/ZnS量子點(A)和聚合物-量子點熒光微球(B)的TEM 圖

羧基功能化聚合物-量子點熒光微球及CdSe/ZnS量子點的熒光光譜，見圖3A。可看出熒光峰均出現(xiàn)在615 nm 處且峰形對稱，CdSe/ZnS 量子點(溶于正己烷)的熒光峰相較于羧基功能化聚合物-量子點微球的熒光峰，位置沒有改變，且半峰全寬(FWHM)較窄，僅有39 nm。量子點被聚合物包裹后熒光強度僅降低了3%。羧基功能化聚合物-量A 中插圖為聚合物-熒光量子點微球水溶液在日光(左)和紫外光(365 nm)(右)激發(fā)下的圖片。子點微球水溶液在日光和紫外光(365 nm)激發(fā)下的圖片見圖3A，熒光微球水溶液在紫外燈照射下發(fā)出明亮的紅色光。如圖3B 所示，在p H=7的PBS溶液中，羧基功能化聚合物-量子點熒光微球放置100 d后其熒光強度基本不變，始終維持在較高水平，此穩(wěn)定性為后續(xù)的生物檢測提供了保證。

圖3 CdSe/ZnS量子點及聚合物-量子點熒光微球的熒光光譜圖(A)、聚合物-熒光量子點微球的熒光穩(wěn)定性測試(B)

2.2 羧基功能化聚合物-量子點熒光微球熒光猝滅機理

熒光猝滅機理主要分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種類型[28]。在靜態(tài)猝滅中，猝滅劑與熒光物質(zhì)之間形成無熒光的絡(luò)合物；在動態(tài)猝滅過程中，猝滅劑與激發(fā)態(tài)的熒光物質(zhì)發(fā)生碰撞，阻止激發(fā)態(tài)電子與表面空穴的復(fù)合，從而導(dǎo)致熒光猝滅。由對槲皮素和聚合物-量子點熒光微球進行的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜表征結(jié)果見圖4A。槲皮素在255 nm 和372 nm 有兩個吸收峰，而聚合物-量子點熒光微球的發(fā)射波長出現(xiàn)在615 nm 處，二者的吸收峰與發(fā)射峰沒有重疊，此結(jié)果排除了由熒光內(nèi)濾效應(yīng)導(dǎo)致的熒光猝滅。

槲皮素在200～400 nm 之間出現(xiàn)兩個吸收峰。加入聚合物-量子點微球后，槲皮素吸收峰位置沒有改變，吸光度值相當(dāng)于聚合物微球與QCT 吸光度值的簡單疊加，見圖4B。在圖4C中，聚合物-量子點熒光微球在615 nm 處出現(xiàn)熒光峰，槲皮素在530 nm 處有一個微弱的熒光峰，聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系在615 nm 處的熒光峰強度改變位置無變化，其在530 nm 處的峰強度及位置皆無變化，且沒有出現(xiàn)新的峰。由此可知，在聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系中無新產(chǎn)物生成，說明槲皮素猝滅聚合物-量子點熒光微球熒光的機理非靜態(tài)猝滅。

進一步用Stern-Volmer區(qū)分熒光猝滅機理的類型，結(jié)果見圖4D。由F0/F=1+KSV〔Q〕和分子猝滅方程KSV=Kq·τ0計算得，Kq(猝滅速率常數(shù))的最大值為6.00×106L·mol-1·s-1，遠小于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數(shù)(2.00×1010L·mol-1·s-1)，證明槲皮素猝滅聚合物-量子點微球熒光的原理為動態(tài)猝滅。

圖4 槲皮素紫外-可見吸收光譜(左)與聚合物-量子點微球熒光發(fā)射光譜(右)(A)，聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系(Microspheres-QCT)、聚合物-量子點熒光微球(Microspheres)與槲皮素(QCT)的紫外-可見吸收光譜(B)與相關(guān)的熒光發(fā)射光譜(C)，槲皮素濃度變化的Stern-Volmer曲線(D)

綜上所述，槲皮素作為電子受體可以猝滅熒光，是由于槲皮素吸收了導(dǎo)帶激發(fā)態(tài)電子，從而阻礙被激發(fā)電子從導(dǎo)帶到價帶，最終表現(xiàn)為熒光猝滅。在聚合物-量子點微球熒光動態(tài)猝滅過程中，熒光微球的激發(fā)態(tài)電子被槲皮素吸收，致使聚合物-量子點熒光微球的熒光發(fā)生衰減，半導(dǎo)體的能帶理論和前人的報道為這一結(jié)論提供了有力的科學(xué)依據(jù)[29]。

2.3 檢測條件的優(yōu)化

2.3.1 聚合物-量子點熒光微球濃度

對檢測體系熒光微球的最佳濃度進行探究，濃度梯度分別為1、2、3、4、5 和6 mg/m L，結(jié)果見圖5A。當(dāng)濃度小于4 mg/mL 時，體系熒光強度隨熒光微球濃度的增大而增大；濃度超過4 mg/mL 時，熒光強度快速下降，是由于熒光微球濃度過大發(fā)生熒光自猝滅，導(dǎo)致熒光強度不增反降。聚合物-量子點熒光微球加入量過低，會使熒光強度弱，標準曲線線性范圍狹窄，不利于繪制精準的標準曲線；熒光微球加入量太大，則會導(dǎo)致上述熒光自猝滅現(xiàn)象[30]，使得檢測工作失敗。綜合考慮，選擇4 mg/m L作為QCT 檢測的最佳聚合物-量子點熒光微球濃度。

圖5 聚合物-量子點熒光微球濃度(A)和待測樣品pH(B)對聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系熒光強度的影響

2.3.2 檢測體系pH值

作溶液環(huán)境的酸堿度不僅影響聚合物-量子點熒光微球的熒光強度，也會對熒光光譜法的靈敏度產(chǎn)生不可忽略的影響。槲皮素為五羥基黃酮，眾多的羥基使其呈弱酸性，堿性環(huán)境會破壞槲皮素的結(jié)構(gòu)，使其熒光猝滅能力降低。因此，理論上檢測環(huán)境應(yīng)為非堿性環(huán)境。由圖5B 可知，偏酸或偏堿的環(huán)境均不利于QCT 的檢測，在pH 值為7時熒光猝滅程度最大。因此，選擇p H=7作為后續(xù)檢測實驗的環(huán)境酸堿度。

2.3.3 待測樣品中緩沖液

為選出檢測體系適合的緩沖溶液，選用硼酸鹽緩沖液(a，BBS)，檸檬酸鹽緩沖液(b，CPBS)，Tris-HCl緩沖液(c，Tris-HCl)和磷酸鹽緩沖液(d，PBS)，對比了四種緩沖液對聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系熒光猝滅效果的影響。從圖6中可以觀察到在相同濃度及pH 值的情況下，聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系在磷酸鹽緩沖液中熒光猝滅程度最大。綜合考慮，PBS為最適的緩沖溶液。

圖6 聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系在硼酸鹽緩沖液和磷酸鹽緩沖液中的熒光發(fā)射光譜

2.3.4 檢測體系處理溫度及時間

處理溫度對聚合物-熒光量子點微球-槲皮素體系的熒光強度的影響見圖7A。在20～70 ℃之間，隨著溫度的升高熒光強度不斷降低；在20～30 ℃之間，待測樣品能保持較高的熒光水平。因此，在室溫下處理待測樣品即可。此外，處理時間過短熒光未達到最大猝滅值會導(dǎo)致QCT 檢測濃度小于實際濃度。待測樣品配制完成后的前20 min熒光強度迅速減小，隨后持續(xù)降低，在1 h時熒光強度保持穩(wěn)定，見圖7B。綜上，分別選擇25 ℃和1 h為待測樣品檢測體系的最佳處理溫度和時間。

圖7 處理溫度(A)和處理時間(B)對聚合物-量子點微球-槲皮素體系熒光強度的影響

2.4 槲皮素檢測標準曲線和檢測限

在上述最優(yōu)條件下，測定了一系列不同槲皮素濃度下聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系的熒光強度。隨著QCT 濃度的增大，熒光猝滅的作用逐漸增強，熒光強度呈有規(guī)律的減弱，見圖8。經(jīng)擬合得回歸方程ΔF=(F0-F)=665.89C+47.69(濃度單位:10-5mol/L)。相關(guān)系數(shù)R2=0.989 6，在0.40～3.60×10-5mol/L 之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)檢測限(LOD)=3 SD/K(SD 為對照組的標準偏差，K為標準曲線的斜率)，經(jīng)計算，該方法的檢測限為4.20×10-7mol/L。

圖8 不同槲皮素濃度下聚合物-量子點熒光微球-槲皮素體系的熒光光譜圖

2.5 干擾組分的影響

在實際檢測中，樣品中時常存在多種干擾物質(zhì)，從而影響檢測結(jié)果，故需考察常見金屬離子、酸根離子、常見陰離子及常規(guī)藥用輔料等對該檢測方法靈敏度的影響。結(jié)果見表1，葡萄糖、三乙醇胺和Na+、Mg2+、Al3+等金屬離子對檢測影響較小。

表1 樣品含量測定(n=6)

2.6 精密度和重復(fù)性

在最佳檢測條件下，對一個濃度為1.000×10-4mol/L的QCT 標準液進行6 次測試，經(jīng)計算得平均濃度為1.027×10-4mol/L，相對標準偏差(RSD)僅為1.02%，表明采用的熒光光譜法精密度較高。隨后，對平行的六個濃度為1.000×10-5mol/L 的QCT 標準液進行單次測試，經(jīng)計算得平均濃度為1.029×10-5mol/L，相對標準偏差(RSD)為2.68%，表明采用的熒光光譜法重復(fù)性較好。

2.7 回收率測定

在最佳條件下，用不同濃度的樣品考察了該方法的準確度，結(jié)果見表2。加標回收率在99.9%～106.4%之間，且RSD 小于3%，說明以聚合物-量子點熒光微球為探針的熒光光譜法用于QCT 檢測可行。

表2 加標回收率實驗(n=6)

3 結(jié)論

本實驗通過簡單的溶劑揮發(fā)法，成功合成了水溶性的羧基功能化聚合物-量子點熒光微球。所制備的熒光微球具有較高的熒光強度和良好的熒光穩(wěn)定性。基于槲皮素對量子點的熒光猝滅現(xiàn)象，本文建立了一種簡便、高效測定槲皮素含量的熒光分析方法。該方法具有較好的精密度、重復(fù)性和高回收率，檢測限可達4.20×10-7mol/L。一些常見金屬陽離子、葡萄糖以及氨基酸對槲皮素含量測定的干擾較小，可用于槲皮素含量的測定。