李瑞冬， 方南洙， 金慶國， 柳海星， 李鐘淑

(延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002)

卵母細(xì)胞是哺乳動物特有的生殖細(xì)胞，卵母細(xì)胞的質(zhì)量決定著母畜的繁殖率以及仔畜的健康以及品質(zhì)的優(yōu)良。為了提高家畜的繁殖率，通常會采用IVM技術(shù)以及胚胎移植技術(shù)從體外人工提高動物的繁殖率。然而在體外的操作過程中存在著某些因素會影響卵母細(xì)胞的質(zhì)量，從而降低試驗的成功率，其中常見的因素就是氧化應(yīng)激[1]。

氧化應(yīng)激是一種細(xì)胞內(nèi)氧化還原水平不平衡導(dǎo)致的細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)，其主要誘因ROS會與細(xì)胞內(nèi)各種分子結(jié)合反應(yīng)產(chǎn)生各種有害的自由基，因此氧化應(yīng)激能夠?qū)е录?xì)胞生物膜、遺傳物質(zhì)等的破壞。其次ROS作為一種第2信使也在時刻的對下游的基因表達(dá)起著調(diào)節(jié)的作用，如ROS對Keap1-Nrf2-ARE、PI3K/Akt通路的調(diào)節(jié)可以提高細(xì)胞的抗氧化、增殖分化以及糖代謝的能力[2]。糖代謝能力的下降將會導(dǎo)致細(xì)胞的衰老，進(jìn)而引發(fā)各方面的疾病[3]。因此，過量的ROS導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞通路的異常運作，對細(xì)胞活力有著不良的影響。近來也有研究表明，氧化應(yīng)激還能夠通過干擾胰島素信號通路導(dǎo)致小鼠的糖代謝紊亂，從而對小鼠的健康產(chǎn)生不良影響[4]。

因此，為了對抗這種不良影響，外源性抗氧化物質(zhì)的添加顯的格外重要。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的抗氧化物質(zhì)有很多，但大多數(shù)都是從植物中提取而來，其含量甚微甚至遠(yuǎn)不及內(nèi)源性抗氧化劑，如褪黑素、α-硫辛酸、輔酶Q等。堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)是一種自身能夠合成的細(xì)胞蛋白因子，其廣泛存在于人體組織中，其次在快速增殖的組織中，如胚胎[5-6]。bFGF已知的生物學(xué)作用主要體現(xiàn)在組織損傷的修復(fù)，血管的生成以及創(chuàng)傷的愈合中[7-8]，近些年研究發(fā)現(xiàn)，bFGF還對氧化應(yīng)激造成的損傷細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用[9-11]。然而有關(guān)bFGF在卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激方面的研究迄今還是一片空白。

因此，該試驗以6～8周的雌性小白鼠為試驗材料，旨在通過比較正常組(正常培養(yǎng)液)、氧化組(含有250 μmol/L過氧化氫)、抗氧化組(150 ng/L bFGF+250 μmol/L)3組細(xì)胞中的氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA、8OHdG水平、細(xì)胞內(nèi)還原物質(zhì)谷胱甘肽(GSH)、線粒體功能如膜電位熒光強度、能荷水平，以及細(xì)胞代謝途徑中無氧途徑酶pk，hk，6-pfk的活性以及調(diào)節(jié)無氧途徑與有氧途徑的pdk1酶活性的變化，探究bFGF對氧化應(yīng)激條件下的小鼠卵母細(xì)胞的保護(hù)作用以及對細(xì)胞糖代謝途徑調(diào)節(jié)的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象

雌性昆明小鼠，購自延邊大學(xué)實驗動物中心，6～8周周齡，體重25～30 g。在IVC條件下飼養(yǎng)，溫度為26 ℃，固定的光周期暗周期各12 h，自由采食，自由飲水。在飼養(yǎng)適應(yīng)一周后進(jìn)行試驗，操作均符合試驗動物福利的相關(guān)規(guī)定。

1.1.2 主要試劑及儀器

血促性素(PMSG，寧波第二激素廠，貨號110254564)，M2培養(yǎng)液(SIGMA，貨號M7167)，M16P培養(yǎng)液(M7292)，礦物油，即用型透明質(zhì)酸酶，堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF，索萊寶，貨號50037-M07E)，GSH 熒光染色劑(CellTrackerTMBlueCMF2HC Dye，Thermo Fisher Scientific，貨號C12881)，JC-1[CBIC2(3)，碧云天，貨號C2005]。ELISA酶聯(lián)試劑盒(上海遠(yuǎn)慕)，實體顯微鏡(Nikon，TMS)，熒光顯微鏡(Nikon，ECLIPSE Tis 634268)，二氧化碳培養(yǎng)箱(ESCO，CCL-170B-8)。

1.1.3 主要試劑的配制

1) bFGF的配制 bFGF的配制按照說明進(jìn)行配制，將bFGF粉末溶解于70 μL無菌水中，配制成濃度為0.15 mg/mL的原液，后加入M16使其濃度為150 ng/mL。

2) 過氧化氫的配制 過氧化氫的濃度按照相關(guān)文獻(xiàn)確定為250 μmol/L[12]，其配置方法為：取10 μL 30%過氧化氫原液，加入990 μL M16形成A液，然后取A 10 μL 溶于990 μL M16中獲得B液，然后取250 μL B液與750 μL M16混合即得250 μmol/L的過氧化氫。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的收集與培養(yǎng)

選取符合試驗標(biāo)準(zhǔn)的健康雌性小鼠，腹腔注射10 IU的PMSG 2 d后脫頸處死，打開腹腔，取出卵巢，剔除脂肪后置于M2液滴中，顯微鏡下用手術(shù)刀切碎卵巢并加入透明質(zhì)酸酶，吸取至5 mL微量離心管中，移至培養(yǎng)箱中進(jìn)行酶消化作用 5 min。取出微量離心管吸取沉淀。用合適的玻璃針拾取卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞在M2培養(yǎng)液中洗滌3～5次，洗去雜質(zhì)后，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h。

1.2.2 ROS、MDA、8OHdG的檢測

氧化應(yīng)激標(biāo)志物的檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值)，計算樣品濃度。

1.2.3 GSH熒光強度檢測

按照試劑說明書配置好CMF2HC工作液后分裝，使用時提前解凍并加入990 μL M16后待用，將培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞用1 g/L PBS-PVA洗滌3次后置于含有染色劑的小滴中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育15 min，取出用PBS-PVA洗滌3次，洗去染料，置于新的PBS-PVA液滴中并覆蓋礦物油，熒光顯微鏡下進(jìn)行紫外熒光激發(fā)，得到的熒光染色照片用 Image J 1.49對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。

1.2.4 線粒膜電位熒光強度檢測

按照試劑說明書配置好JC-1工作液后分裝，使用時提前解凍并加入990 μL M16后待用，將培養(yǎng)后的卵母細(xì)胞用1 g/L PBS-PVA洗滌3次后置于含有染色劑的小滴中，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，取出用PBS-PVA洗滌3次，洗去染料，熒光顯微鏡下進(jìn)行紫外熒光激發(fā)，得到的熒光染色照片用 Image J 1.49對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。

1.2.5 卵母細(xì)胞活力、能荷以及細(xì)胞糖代謝酶活力的檢測

檢測方法同1.2.2。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞的抗氧化標(biāo)志物水平的影響

由表1可見，與正常組相比，100 μmol/L過氧化氫處理組的卵母細(xì)胞內(nèi)總氧化應(yīng)激標(biāo)注物含量顯著高于正常組(ROS、MDA、8OHdG，n=90，P<0.05)，與此一致，100 μmol/L過氧化氫處理組的卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)注物含量顯著高于抗氧化處理組(n=90，P< 0.05)，而正常組與抗氧化處理組卵母細(xì)胞內(nèi)總ROS含量相比，差異不顯著(P=0.08>0.05)；正常組與抗氧化處理組卵母細(xì)胞內(nèi)MDA含量相比，差異顯著(P<0.05)；正常組與抗氧化處理組卵母細(xì)胞內(nèi)8OHdG含量相比，差異顯著(P<0.05)。

表1 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激標(biāo)志物含量影響

2.2 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)GSH熒光水平的影響

為探究bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量GSH含量的影響，現(xiàn)采用CMF2HC Dye對卵母細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞染色，每組20個細(xì)胞，避光染色后在熒光顯微鏡激發(fā)拍攝后用ImageJ 1.49 對熒光圖片量化分析，結(jié)果用平均熒光強度相對值表示。bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響見圖1。

注：(A)不同實驗組卵母細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽熒光強度。(B)谷胱甘肽熒光強度量化分析圖，

2.3 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞活力及能荷水平的影響

細(xì)胞內(nèi)ATP、ADP、AMP的動態(tài)比是衡量細(xì)胞活力的一種指標(biāo)，其中，能荷的換算更能體現(xiàn)出細(xì)胞活力的情況。結(jié)果顯示：正常組卵母細(xì)胞能荷比值接近于0.95，而過氧化氫組能荷接近0.5，顯著低于正常組(P<0.05)，抗氧化組細(xì)胞能荷水平大致在0.7左右，顯著高于過氧化氫組(P<0.05)，正常組與抗氧化組相比，差異顯著(P<0.05)，試驗表明bFGF能夠顯著提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下小鼠卵母細(xì)胞的能荷水平(表2，圖2)。

表2 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)ATP、ADP、AMP含量及能荷影響

圖2 bFGF處理對氧化應(yīng)激條件下小鼠 卵母細(xì)胞能荷水平量化分析圖

2.4 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位熒光水平的影響

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量的中轉(zhuǎn)站，因此細(xì)胞的活性應(yīng)與線粒體的膜電位相關(guān)，因此采用JC-1染色劑分別對3組卵母細(xì)胞進(jìn)行染色，處理結(jié)果如圖3，通過數(shù)據(jù)可以看出，正常組膜電位熒光強度顯著高于過氧化氫組(P<0.05)，過氧化氫組膜電位熒光強度顯著低于抗氧化組(P<0.05)。

注：(A)不同處理組內(nèi)細(xì)胞線粒體膜電位熒光強度比較，(B)線粒體膜電位熒光強度量化分析圖。

2.5 bFGF對氧化應(yīng)激條件下小鼠卵母細(xì)胞代謝酶活力影響

由圖4數(shù)據(jù)分析可知，hk、6-pfk、pk酶的酶活力均顯著低于H2O2處理組，而pdk1則恰恰相反，抗氧化組4種酶活性均顯著高于H2O2處理組(P<0.05)。然而正常組與抗氧化組相比，pdk1、6-pfk酶活力差異顯著(P<0.05)，而pk、hk酶2組之間無顯著性差異(P>0.05)。表明bFGF的添加有效調(diào)控了糖代謝酶的活性：恢復(fù)了氧化應(yīng)激導(dǎo)致的糖酵解途徑活化，并恢復(fù)了細(xì)胞正常的有氧代謝途徑(n=90，P<0.05)。

圖4 bFGF對小鼠卵母細(xì)胞內(nèi)pdk1、pk、hk、6-pfk活性的影響

3 討論

卵母細(xì)胞的質(zhì)量不僅對家畜的繁殖率和動物仔畜的品質(zhì)有很大影響，而且還會影響著畜牧業(yè)未來的發(fā)展。氧化應(yīng)激作為影響卵母細(xì)胞質(zhì)量的主要因素不僅影響著卵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，更加對細(xì)胞的功能產(chǎn)生嚴(yán)重的影響，其不僅會對線粒體膜造成損傷，還會加速細(xì)胞的衰老或死亡。氧化應(yīng)激標(biāo)志物作為檢測氧化應(yīng)激水平指標(biāo)對于疾病的判斷及預(yù)測有很大的作用[13-15]。谷胱甘肽作為一種內(nèi)源性抗氧化劑，能夠防止自由基、過氧化物、脂質(zhì)過氧化物和重金屬等活性氧對重要細(xì)胞成分造成的損害[16]。因此，細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽的水平通常也用來衡量細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激的能力[17-19]。由于氧化應(yīng)激對細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)造成了不可逆的危害，因此對于線粒體的功能也是產(chǎn)生影響的，線粒體功能通常通過細(xì)胞內(nèi)對ATP水平和膜電位的測定來體現(xiàn)。周秀芬，姜宏[20]表明，線粒體膜電位與ROS的含量呈負(fù)相關(guān)，且線粒體膜電位越低精子的活力越低。此外細(xì)胞的糖代謝水平也與膜電位有很大關(guān)聯(lián)，線粒體膜電位的高低與線粒體的氧化磷酸化能力呈正相關(guān)[21]。

細(xì)胞的糖代謝即取決于線粒體的功能結(jié)構(gòu)，也取決于其內(nèi)部酶的活力。蔣欣，徐陽表明，卵母細(xì)胞的發(fā)育及質(zhì)量與糖代謝酶的調(diào)控息息相關(guān)[22]。因此該試驗設(shè)計并研究bFGF對氧化應(yīng)激狀態(tài)下小鼠卵母細(xì)胞糖代謝酶活力的影響。

結(jié)果顯示，經(jīng)過bFGF處理的卵母細(xì)胞顯著降低了氧化應(yīng)激，標(biāo)注物的含量顯著高于正常組(ROS、MDA、8OHdG，n=90，P<0.05)。 bFGF處理后也顯著恢復(fù)了細(xì)胞的GSH熒光水平并且提高了線粒體膜電位和ATP的水平(P<0.05)，從而提高細(xì)胞的活力。此外，試驗數(shù)據(jù)還顯示在過氧化氫的處理下，糖酵解途徑的酶活力得到顯著的激活，而三羧酸循環(huán)中的限速酶活力得到了抑制，在bFGF添加后，糖酵解途徑酶活力恢復(fù)正常，由此證明bFGF的加入改善了氧化應(yīng)激對細(xì)胞糖代謝酶活性及途徑的調(diào)控有顯著作用。

4 結(jié)論

該試驗結(jié)果表明，100 ng/L bFGF能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)還原當(dāng)量GSH含量以及降低氧化應(yīng)激標(biāo)志物ROS、MDA和8OHdG的相當(dāng)含量從而對抗細(xì)胞的氧化應(yīng)激，另外，bFGF的添加顯著提高了線粒體膜電位以及ATP和能荷的相對含量，從而提高細(xì)胞線粒體的功能，增強細(xì)胞活力，最后bFGF的加入顯著改善了氧化應(yīng)激對細(xì)胞糖代謝酶活性造成的不良影響。