王楊欣， 陳 萱， 范鑫博， 張 先， 李范洙*， 李 敏

(1. 延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院；2.延邊特色產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心：吉林 延吉 133000)

寒蔥(AlliumvictorialisL.)具有良好的抗氧化、抑菌[1-2]、防止動(dòng)脈硬化[3]、減緩皮膚衰老[4]、預(yù)防治療糖尿病并發(fā)癥[5]等作用。近幾年，延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏實(shí)驗(yàn)室已對(duì)寒蔥粗提物的化學(xué)成分及抗氧化活性進(jìn)行了初步研究。寒蔥中的維生素C含量高于部分常見果蔬[6]，含有酚類、黃酮類物質(zhì)及皂苷等多種生物活性物質(zhì)，并且具有良好的抗氧化活性。但主要是對(duì)寒蔥粗提物的研究，為進(jìn)一步分離出寒蔥粗提物中的抗氧化作用效果較好的組分，該研究擬利用不同極性有機(jī)溶劑對(duì)寒蔥粗提物進(jìn)行梯度萃取，測(cè)定寒蔥不同極性萃取物總酚、總黃酮、總皂苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，HPLC法分析黃酮類物質(zhì)，并通過對(duì)自由基的清除率以及還原力的測(cè)定探究其體外抗氧化活性，以期尋找抗氧化效果最佳的萃取組分，為天然抗氧化劑以及寒蔥抗氧化食品這一新資源的研究開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑

寒蔥(AlliumvictorialisL.)于2019年5月采自吉林省延邊地區(qū)。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇(分析純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、落新婦苷、蘆丁、斛皮苷、槲皮素、染料木素、山奈酚、香葉木素、漢黃岑素、柳川魚黃素、維生素C(上海源葉生物科技有限公司)、甲醇(色譜純，美國Sigma公司)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

JA10003N高效液相色譜儀(民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；250×4.6 mm，5 μm C18色譜柱(日本島津公司)；FD-1C-50高速冷凍離心機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；UV-7504紫外可見分光光度計(jì)(上海欣茂儀器有限公司)；FD-1C-50冷凍干燥機(jī)(方科儀器(常州)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 寒蔥粗提物及不同極性萃取物的制備

采用水回流提取法，稱取1 kg寒蔥鮮葉，先用15 L蒸餾水浸泡24 h后回流提取2 h，過濾后的濾渣加入10 L蒸餾水回流提取1 h，過濾后的濾渣再加入5 L蒸餾水回流提取30 min后再次過濾，合并3次的濾液。濾液濃縮至浸膏狀，之后凍干24 h后取出研磨成粉末，即寒蔥粗提物，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

取一定質(zhì)量的粗提物，用蒸餾水溶解，依次用正己烷(Hex)、二氯甲烷(DCM)、乙酸乙酯(EAC)、正丁醇(n-BuOH)進(jìn)行萃取[7]，分別萃取3次，真空濃縮揮發(fā)溶劑，冷凍干燥，分別得到正己烷相、二氯甲烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相以及水相萃取物。

1.2.2 活性成分的分析

1) 總酚的測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[8-9]測(cè)定總酚。取0.5 g寒蔥不同極性萃取物，分別用蒸餾水定容至50 mL，量取2 mL又定容至25 mL，吸取1 mL樣液于試管中，再加入1 mL 1 mol/L福林試劑和5 mL 1 mol/L碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容至10 mL，靜止30 min后于760 nm波長測(cè)得吸光度。以單寧為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2) 總黃酮含量的測(cè)定

取0.5 g寒蔥不同極性萃取物，用70%乙醇溶解定容至50 mL，各量取1 mL到試管中并分別定容至20 mL，取1 mL樣液，每隔6 min分別加入0.5 mL 5% NaNO2溶液、0.5 mL 10%Al(NO3)3溶液和5 mL 4% NaOH溶液，用70%乙醇定容至10 mL，搖勻，于510 nm波長測(cè)定吸光度[10-11]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3) 總皂苷含量的測(cè)定

分別稱取0.5 g寒蔥不同極性萃取物，用甲醇溶解定容至50 mL，各稀釋一定倍數(shù)后，取0.2 mL樣液于70 ℃水浴揮干溶劑，之后加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸，混合搖勻，在70 ℃下再次水浴20 min后立即冷卻，然后加5 mL冰醋酸，于550 nm測(cè)定吸光度[12]。以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4) 黃酮類物質(zhì)定量分析

① 供試樣液的制備

分析用標(biāo)準(zhǔn)品為落新婦苷、蘆丁、斛皮苷、槲皮素、染料木素、山奈酚、香葉木素、漢黃岑素、柳川魚黃素，分別用色譜級(jí)甲醇配制成不同濃度的溶液，進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

分別稱取一定量的寒蔥不同極性萃取物和粗提物，用色譜級(jí)甲醇溶液溶解并定容至1 mL，之后用0.45 μm有機(jī)濾膜過濾，待分析。

② 色譜分析條件

C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，Theromo scientific)；流動(dòng)相為0.1%磷酸水(A)和甲醇(B)；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長366 nm；梯度洗脫程序：0～20 min，45% B；20～35 min，80% B；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃。

1.2.3 體外抗氧化活性分析

1) DPPH自由基清除率的測(cè)定

將寒蔥不同極性萃取物配制成一定濃度的溶液后，取2 mL樣液和 2 mL 1.0 mmol/L DPPH溶液混合均勻，在避光條件下反應(yīng)20 min后測(cè)517 nm波長處吸光度，為Ai，同樣方法測(cè)2 mL樣液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度，為Aj，測(cè)2 mL 1.0 mmol/L DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合液的吸光度，為A0，按照式(1)計(jì)算樣液對(duì)DPPH自由基的清除率[13-15]。試驗(yàn)以Vc作對(duì)照，均重復(fù)3次。

(1)

2) 羥自由基清除率的測(cè)定

采用Fenton反應(yīng)法[16-17]，取2 mL樣液、2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 8.8 mmol/L 30% H2O2溶液和2 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，混合均勻，避光、37 ℃保溫30 min，以3 000 r/min離心10 min，取上清液，于510 nm測(cè)溶液的吸光度，記為Bi；將2 mL樣液替換成2 mL超純水同樣方法測(cè)吸光度，記為B0，2 mL水楊酸-乙醇溶液替換成2 mL乙醇溶液，記為Bj。按照式(2)計(jì)算樣液對(duì)羥自由基的清除率。試驗(yàn)以Vc做對(duì)照，均重復(fù)3次。

(2)

3) 還原能力的測(cè)定

取0.1 mL樣液、0.1 mL pH值6.6的磷酸緩沖溶液和0.1 mL 1%鐵氰化鉀溶液混合，于50 ℃水浴反應(yīng)20 min，冷卻后加入0.1 mL 10%三氯乙酸，以3 000 r/min離心15 min，取0.1 mL上清液，加入0.1 mL超純水與0.01 mL 0.1%三氯化鐵，靜置10 min后于酶標(biāo)儀700 nm波長測(cè)吸光度，記為A樣品；同樣方法將鐵氰化鉀溶液替換成0.1 mL去離子水作為空白對(duì)照組，記為A空白，還原力以A樣品和A空白相差來表示[18-19]。試驗(yàn)以Vc做對(duì)照，均重復(fù)3次。

還原力=A樣品-A空白。

(3)

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用Origin 2018軟件繪圖；利用SPSS17.0軟件，采用Duncan多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析，P<0.05，以及Probit回歸法計(jì)算IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 寒蔥不同極性萃取物活性成分

由表1可知，寒蔥不同極性萃取物中總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)均差異顯著，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)大小的順序也基本一致，其中，乙酸乙酯萃取物總酚和總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，分別達(dá)到334.20和127.27 mg/g，其次,二氯甲烷和正丁醇萃取相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，正己烷和水相的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低，且低于粗提物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。而二氯甲烷萃取物的總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為139.04 mg/g，顯著高于其他萃取相，正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取相中皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為90 mg/g，差異不顯著。說明酚類和黃酮類物質(zhì)主要富集在中等極性的乙酸乙酯、二氯甲烷和正丁醇相中，皂苷類物質(zhì)在二氯甲烷相中質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多以外，在正己烷、乙酸乙酯和正丁醇相中分布比較均勻。

表1 不同極性萃取物活性成分的含量

2.2 寒蔥不同極性萃取物黃酮類物質(zhì)的定量分析

從圖1可以看出，正己烷萃取物色譜峰多集中20 min以后，二氯甲烷萃取物的色譜峰的保留時(shí)間多集中于15～24 min，而乙酸乙酯萃取物的色譜峰多集中于7～18 min，正丁醇萃取物的色譜峰集中在5～10 min。對(duì)蔥屬植物中普遍存在的蘆丁、槲皮素、山奈酚以及在全譜分析中檢測(cè)出來的落新婦苷、染料木素、漢黃芩素等9種黃酮類物質(zhì)分析結(jié)果，在不同極性萃取物中的含量具有明顯差異。

注：1.落新婦苷(Astilbin);2.蘆丁(Rutin);3.槲皮苷(Quercitrin);4.槲皮素(Quercetin);5.染料木素(Genistein);6.山奈酚(Kaempferol);7.香葉木素(Diosmetin);8.漢黃芩素(Wogonin);9.柳川魚黃素(Pectolinarigenin)。

由表2可知，乙酸乙酯萃取物較其他萃取相包含更多的黃酮類物質(zhì)，包括落新婦苷8 388.5 μg/g、蘆丁2 245.8 μg/g、槲皮苷1 197.21 μg/g、染料木素1 137.10 μg/g、槲皮素506.93 μg/g和山奈酚341.35 μg/g，未檢測(cè)出漢黃芩素和柳川魚黃素。其次是二氯甲烷萃取物，包含染料木素1 172.65 μg/g、柳川魚黃素818.64 μg/g、槲皮素769.09 μg/g、香葉木素737.15 μg/g和蘆丁649.48 μg/g，未檢出山奈酚和落新婦苷。在正己烷萃取物中，檢出染料木素、香葉木素、柳川魚黃素和漢黃芩素，其中,染料木素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，為997.26 μg/g。正丁醇萃取物中只檢出蘆丁和槲皮苷，且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低；水相中9種物質(zhì)均檢出，其中,槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)最多，達(dá)335.45 μg/g。在粗提物中，槲皮素、染料木素以及漢黃芩素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較高，分別為243.30，216.19和169.25 μg/g，山奈酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)次之，而柳川魚黃素以及蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)較低，因粗提物沒有經(jīng)過純化處理，所以色譜分析結(jié)果可能會(huì)受雜質(zhì)的影響較大。

表2 不同極性溶劑萃取物中黃酮類物質(zhì)的含量

2.3 寒蔥不同極性萃取物抗氧化活性

2.3.1 對(duì)DPPH自由基的清除率

從圖2可以看出，寒蔥不同極性萃取物對(duì)DPPH自由基均有良好的清除活性，其中,乙酸乙酯萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率明顯高于其他萃取物，質(zhì)量濃度在1.0 mg/mL以上時(shí),清除率趨于平緩，清除率高達(dá)92.09%，類似于Vc質(zhì)量濃度在0.4 mg/mL的清除率；二氯甲烷和正丁醇萃取物質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時(shí),清除率分別為80.92%和79.07%，接近峰值；正己烷萃取物的質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),清除率為76.72%，之后趨于平緩；水相萃取物對(duì)DPPH自由基的清除率最低，質(zhì)量濃度在1.4 mg/mL以上時(shí),清除率趨于穩(wěn)定，此濃度下清除率為75.28%。粗提物在質(zhì)量濃度1.2 mg/mL時(shí),其對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到80.22%，類似于二氯甲烷和正丁醇萃取物的峰值，之后趨于穩(wěn)定。

圖2 不同極性溶劑萃取物對(duì)DPPH 自由基的清除率

分析IC50值結(jié)果顯示(表3)，乙酸乙酯萃取相的IC50值最小，為0.153 mg/mL，其后質(zhì)量濃度由低到高依次為二氯甲烷萃取物、正丁醇萃取物、正己烷萃取物，水相萃取物的IC50值最大，為0.927 mg/mL。粗提物的IC50值為0.392 mg/mL，略高于正丁醇相。可以看出，寒蔥不同極性萃取物均對(duì)DPPH自由基具有良好的清除活性，其中,乙酸乙酯相的活性最高，其次是二氯甲烷相、正丁醇相、正己烷萃取相和水相，但均不及Vc的活性。

表3 不同極性溶劑萃取物清除DPPH 自由基的IC50值

2.3.2 對(duì)羥自由基的清除率

從圖3可以看出，寒蔥不同極性萃取物對(duì)羥自由基也具有良好的清除能力，并呈現(xiàn)類似于對(duì)DPPH自由基清除活性的趨勢(shì)。同樣,乙酸乙酯萃取物對(duì)羥自由基的清除率明顯高于其他萃取相，清除率趨于平穩(wěn)后的大小為85.23%，但不及Vc的最高清除率；二氯甲烷和正丁醇萃取物以及粗提物的清除率曲線基本一致，濃度為1.6 mg/mL以上時(shí)清除率趨于平緩，清除率分別為79.27%、81.69%和78.43%；正己烷萃取物和水相萃取物的清除率趨于穩(wěn)定時(shí)的濃度為2.0 mg/mL，清除率分別為78.00%和73.43%。

圖3 不同極性溶劑萃取物對(duì)羥自由基的清除率

IC50值計(jì)算結(jié)果顯示(表4)，乙酸乙酯相的IC50值為0.387 mg/mL,最小，其次是二氯甲烷相，為0.547 mg/mL，其后正丁醇相和正己烷相，水相IC50值最小，為1.171 mg/mL；粗提物的IC50值為0.695 mg/mL，接近于正丁醇萃取物，以上濃度的寒蔥不同極性萃取物活性相當(dāng)于0.08 mg/mL的Vc活性。

表4 不同極性溶劑萃取物清除DPPH 自由基的IC50值

2.3.3 寒蔥不同極性萃取物的還原力

從圖4可以看出，隨著寒蔥不同極性萃取物濃度的增加還原力也增強(qiáng)，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。不同極性萃取物的還原力大小順序與其對(duì)自由基清除率大小順序一致，還原力由高到低依次為乙酸乙酯相、二氯甲烷相、正丁醇相、正己烷萃取相和水相，濃度約為0.3 mg/mL以上時(shí),粗提物的還原力低于正丁醇萃取物。從圖中可知，不同極性萃取物的還原力遠(yuǎn)低于Vc。

圖4 不同極性溶劑萃取物的還原力

2.4 活性成分與抗氧化活性相關(guān)性分析

由表5的相關(guān)性分析可知，寒蔥不同極性萃取物活性成分中總酚、總黃酮含量與其自由基清除率和還原力相關(guān)系數(shù)均為0.8以上，呈極顯著正相關(guān)，總皂苷含量只與還原力有顯著相關(guān)。因此，寒蔥不同極性萃取物抗氧化主要成分是總酚和總黃酮，其含量的高低可以直接反映抗氧化活性的強(qiáng)弱。

此類題解答后有著濃厚的“回味性”：圖形中還蘊(yùn)藏著哪些有價(jià)值的信息點(diǎn)而沒有被發(fā)現(xiàn)和揭示出來，它對(duì)下一問的解題思路有無鋪墊和啟發(fā)的作用；除此方法之外，還有無其他的方法，若有，這些方法之間在“質(zhì)”上是否有著共同的“語言”.

表5 不同極性溶劑萃取物中的活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性

3 討論與結(jié)論

從試驗(yàn)結(jié)果來看，寒蔥粗提物經(jīng)過不同極性溶劑梯度萃取后，乙酸乙酯相的總酚、總黃酮含量最高，分別達(dá)到334.20和127.27 mg/g。乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量顯著高于其余萃取層,這與王麗虹等[20]的結(jié)果相同，其總酚含量最高與吳永祥[21]柳等對(duì)葉臘梅葉的甲醇粗提物萃取結(jié)果相同，但王歡等[22]對(duì)血紅鉚釘菇子實(shí)體的多酚萃取率研究中正丁醇相多酚含量最高，可能是材料所含的多酚種類不同。正己烷相的總酚和水相的總黃酮含量最低，而二氯甲烷相的總皂苷含量最高，為139.04 mg/g。說明不同極性萃取寒蔥粗提物可以集中分離出粗提物中的物質(zhì)組分，但要挑選合適的有機(jī)溶劑，乙酸乙酯是理想的萃取溶劑，曾鐵鑫等[23]也報(bào)道了同樣的結(jié)果。

黃酮類化合物是蔥屬植物的重要組成部分。蔥屬植物的黃酮類物質(zhì)主要有槲皮素、芹菜素、山奈酚等[24]。根據(jù)HPLC法對(duì)9種黃酮類物質(zhì)分析結(jié)果，乙酸乙酯相中檢測(cè)出落新婦苷、蘆丁、槲皮苷、染料木素、槲皮素和山奈酚等7種物質(zhì)，且其含量最高，其中,落新婦苷含量最多；二氯甲烷相也分析出蘆丁、槲皮苷、染料木素、槲皮素、香葉木素、漢黃芩素和柳川魚黃素7種物質(zhì)，其含量僅次于乙酸乙酯相；正己烷相中檢測(cè)出染料木素、香葉木素、漢黃芩素和柳川魚黃素4種，其中,染料木素的含量最多；正丁醇相中只檢測(cè)出蘆丁和槲皮苷，其含量最低；雖然水相中9種物質(zhì)都被檢出，但是其含量較低。

寒蔥不同極性萃取物抗氧化活性順序?yàn)橐宜嵋阴ハ?二氯甲烷相>正丁醇相>正己烷相>水相萃取物，這與不同極性萃取物中酚類物質(zhì)、總黃酮含量大小基本吻合，即總酚和總黃酮含量高,其抗氧化活性也強(qiáng)。根據(jù)物質(zhì)分析，提取物中總酚和總黃酮的含量與其DPPH自由基清除、羥自由基清除能力和還原能力均具有極顯著的正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。劉曦等[25]對(duì)藍(lán)莓葉的研究也報(bào)道了相關(guān)研究結(jié)果。郭小補(bǔ)等[26]也發(fā)現(xiàn),桑葉總黃酮含量與其體外抗氧化能力的高低呈現(xiàn)一定的相關(guān)關(guān)系。并且二氯甲烷相和乙酸乙酯相的抗氧化活性均優(yōu)于粗提物，說明使用這2種有機(jī)溶劑萃取可以萃取出抗氧化活性強(qiáng)的組分。

通過溶劑梯度萃取寒蔥粗提物中黃酮類物質(zhì)主要富集在乙酸乙酯相中，且其抗氧化活性最高，因此，乙酸乙酯相有望開發(fā)成抗氧化劑，其功能應(yīng)用研究需要進(jìn)一步的探索。