周亞潔，陳朋，周鑫惠，沈海燕，胡春紅

（周口師范學(xué)院生命科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，河南 周口 466001）

小麥作為中國農(nóng)業(yè)和人口增長大國的主要品種和糧食作物，與人們的日常生活息息相關(guān)，其種植的面積和分布區(qū)域范圍已經(jīng)遙遙領(lǐng)先于其他農(nóng)作物。小麥的產(chǎn)量和質(zhì)量對人們?nèi)粘Ｉ钏接兄匾绊?，而且其種子萌發(fā)狀況和幼苗的生長發(fā)育情況是保證小麥產(chǎn)量和質(zhì)量最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一［1］。

近年來，有關(guān)過氧化氫在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究也越來越多，對植物生理變化的研究有了很大的進(jìn)展，不論是內(nèi)源性還是外源性過氧化氫，均可作為信號分子，參與植物體內(nèi)眾多生理過程，對植物的生長、發(fā)育、衰老、防御反應(yīng)及抗逆性均有重要的影響［2］。過氧化氫屬于活性氧成員，參與調(diào)控植物對逆境脅迫的響應(yīng)，但過量積累就會破壞生物大分子，從而對植物細(xì)胞造成質(zhì)膜氧化損害［1］。有研究表明，適宜濃度的過氧化氫對重金屬逆境脅迫下的植物損傷有一定的緩解效果，表現(xiàn)為“低濃度促進(jìn)，高濃度抑制”效果［3］；作為氧化劑，過氧化氫具有表面殺菌和提高種子發(fā)芽率的作用，適量濃度的外源過氧化氫對植物種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育起著促進(jìn)作用［4，5］。但到目前為止，比較不同品種的同一作物對外源過氧化氫處理敏感性的探究鮮見報(bào)道。為此，本試驗(yàn)研究過氧化氫處理下3種小麥種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的情況，并借助一些形態(tài)指標(biāo)和生理指標(biāo)的測定，初步了解其相關(guān)生理機(jī)制，比對不同品種小麥對過氧化氫響應(yīng)的敏感性，其研究結(jié)果對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中提高小麥出芽率及促進(jìn)苗期幼苗生長發(fā)育提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料處理

種子消毒處理：以中國春（國家級供小麥細(xì)胞遺傳研究用的小麥標(biāo)準(zhǔn)栽培品種）、Fielder（目前科研領(lǐng)域的瞬時遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)用小麥品種之一）、周麥36（周口農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的一種農(nóng)藝性狀優(yōu)良的地方特色品種）3種小麥為試驗(yàn)材料。選用子粒飽滿、大小均一的3種小麥種子各300粒，分別置于3個培養(yǎng)皿中。用去離子水先沖洗種子數(shù)次后，用75%乙醇消毒4 min，用5%的NaClO溶液浸泡消毒20 min，最后以去離子水沖洗4～5次。

過氧化氫浸種處理：取上述消毒后的種子，以25粒種子/皿的濃度將種子均勻點(diǎn)播在含有3層濾紙的培養(yǎng)皿中，分別用濃度梯度為0.0、0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 μmol/L的過氧化氫溶液浸種，每個濃度下做3個重復(fù)，置25℃恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)12 h。

播種：將上述過氧化氫浸種處理后的種子用去離子水沖洗后，在25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并于第2天開始，每天定時觀察并記錄種子的萌發(fā)情況［3］。

苗期過氧化氫處理：同上述種子消毒及培養(yǎng)方法（過氧化氫未處理），待種子萌芽3 d后移至常溫下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至第4天，挑選發(fā)芽正常并長勢一致的小麥幼苗，移栽至泡沫漂板上，分別置于濃度為0、0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 μmol/L的過氧化氫溶液中水培，幼苗根基部以下做好遮光處理，幼苗根基部以上正常光照培養(yǎng)。在第3天和第6天測其株高并觀察發(fā)根情況，在第7天稱其整體鮮重，待幼苗長至二葉一心（即10天）測定相應(yīng)生理指標(biāo)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小麥種子萌發(fā)率測定胚根突破種皮視為種子萌發(fā)的標(biāo)志，在小麥種子萌發(fā)第3天，統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽勢，第7天計(jì)算種子發(fā)芽率［6］。

1.2.2 小麥幼苗形態(tài)指標(biāo)測定從幼苗莖基部到葉子生長的最高點(diǎn)長度為幼苗株高［6］。在小麥種子萌發(fā)至第3天后，用直尺（以cm作單位）測每株株高，統(tǒng)計(jì)每株幼苗的發(fā)根情況。將幼苗根部水分吸干，分析天平稱其整體鮮重，重復(fù)稱重3次取均值。

1.2.3 小麥幼苗生理指標(biāo)測定結(jié)合3種小麥幼苗形態(tài)指標(biāo)變化情況，篩選中國春和周麥36為代表性實(shí)驗(yàn)材料，分別測定了不同濃度過氧化氫處理下幼苗中脯氨酸、丙二醛、過氧化氫酶含量的變化情況。丙二醛（MDA）含量的測定采用Predideri等［7］的方法，游離脯氨酸（Proline）含量的測定采用茚三酮顯色法，過氧化氫酶（CAT）活性的測定采用Kakmak等［8］的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 過氧化氫處理下種子萌發(fā)情況

由圖1a和圖1d、圖2a和圖2d、圖3a和圖3d可以看出，與對照組相比，中國春、周麥36、Fielder 3種小麥種子隨過氧化氫濃度增大，其萌發(fā)率和發(fā)芽勢均呈先升高后又逐漸降低的趨勢，在0.3 μmol/L過氧化氫濃度處理下的種子活力和萌發(fā)率最高，在1.2 μmol/L過氧化氫濃度處理下的萌發(fā)率和發(fā)芽勢最低。這表明了低濃度下過氧化氫處理的小麥種子有明顯的促進(jìn)萌發(fā)作用，并且在0.3 μmol/L濃度下促進(jìn)作用最強(qiáng)，高過氧化氫濃度處理下對小麥種子萌發(fā)有抑制作用。

2.2 過氧化氫處理下幼苗發(fā)育情況

2.2.1 過氧化氫處理下小麥幼苗株高情況由圖1b可以看出，在過氧化氫處理中國春小麥幼苗時，0.1 μmol/L和0.9 μmol/L濃度下的作用效果不明顯，0.3 μmol/L濃度下的株高有明顯增高，1.2 μmol/L濃度下株高有明顯降低。由圖2b可以看出，在周麥36小麥幼苗中，幼苗與對照組比，0.1～1.2 μmol/L過氧化氫濃度處理下株高呈逐漸矮化效果。由圖3b可以看出，F(xiàn)ielder小麥幼苗在0.1～0.6 μmol/L濃度的過氧化氫處理下株高均有增加，0.1 μmol/L濃度下株高增加最顯著，0.9～1.2 μmol/L濃度下幼苗表現(xiàn)矮化現(xiàn)象，且1.2 μmol/L濃度矮化最嚴(yán)重。

2.2.2 過氧化氫處理下小麥幼苗鮮重的情況由圖1c可以看出，中國春小麥幼苗時，在0.1 μmol/L過氧化氫處理下鮮重?zé)o明顯變化，0.3 μmol/L濃度下的鮮重明顯增加，0.6～1.2 μmol/L濃度下鮮重逐漸降低，1.2 μmol/L濃度下鮮重最低。由圖2c可以看出，周麥36小麥幼苗鮮重在0.1 μmol/L過氧化氫處理下變化不明顯，在0.3～1.2 μmol/L濃度下呈降低趨勢，1.2 μmol/L濃度下鮮重降低最多。由圖3c可以看出，F(xiàn)ielder小麥幼苗在0.1～0.6 μmol/L濃度下鮮重增加，0.1 μmol/L濃度下鮮重最高，0.9～1.2 μmol/L濃度下鮮重降低，且1.2 μmol/L濃度降至最低。

圖1 過氧化氫處理下中國春小麥形態(tài)指標(biāo)

圖2 過氧化氫處理下周麥36小麥形態(tài)指標(biāo)

綜合圖1至圖3可知，過氧化氫對小麥種子萌發(fā)整體上均呈現(xiàn)“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”現(xiàn)象，0.3 μmol/L濃度下過氧化氫的促進(jìn)作用最為顯著。但不同品種小麥幼苗對過氧化氫的敏感性不同：0.3 μmol/L濃度下中國春鮮重增加效果最顯著；0.1 μmol/L濃度下Fielder鮮重增加作用效果最強(qiáng)；而周麥36在所試用過氧化氫濃度下均表現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象。整體上，1.2 μmol/L濃度下過氧化氫對3種種子萌發(fā)及幼苗發(fā)育均呈現(xiàn)出顯著的抑制效果。

2.2.3 過氧化氫處理對小麥幼苗發(fā)根情況的影響由表1可知，中國春幼苗在0.1～0.9 μmol/L過氧化氫濃度處理下的發(fā)根數(shù)變化不明顯，0.3 μmol/L濃度下的發(fā)根數(shù)最少（5.25條），1.2 μmol/L濃度下的發(fā)根數(shù)顯著增加（6.04條與對照組的5.39條相比增加了12.06%）（P＜0.05）。Fielder幼苗隨過氧化氫處理濃度的增大，其發(fā)根數(shù)與中國春幼苗表現(xiàn)一致，呈現(xiàn)先降低后又逐漸增加的效果，其中0.3 μmol/L濃度下的發(fā)根數(shù)最少（5.09條），與對照組相比達(dá)到差異極顯著水平（P＜0.01）。相反，周麥36幼苗發(fā)根數(shù)隨過氧化氫濃度增加表現(xiàn)為先增加后降低的趨勢，其中0.6 μmol/L處理下，其發(fā)根數(shù)達(dá)到最多（5.78條），與對照組（5.16條）相比增加了12.02%，而1.2 μmol/L濃度下少于對照組，其發(fā)根數(shù)最少（5.12條）。

綜合比較圖1e、圖2e、圖3e和表1發(fā)現(xiàn)，整體上小麥幼苗發(fā)根數(shù)與株高和根長成反比。在相應(yīng)濃度處理下幼苗株高越高發(fā)根數(shù)就越少，但發(fā)根數(shù)越少其根長則較長。

表1 過氧化氫處理下3種小麥幼苗發(fā)根數(shù)

圖3 過氧化氫處理下Fielder小麥形態(tài)指標(biāo)

2.2.4 過氧化氫處理下小麥幼苗中各生理指標(biāo)含量變化情況游離脯氨酸（Proline）是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)植物受逆境脅迫下的滲透壓，增強(qiáng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。由圖4a可以看出，中國春小麥幼苗在0.1～0.6 μmol/L過氧化氫處理下的脯氨酸含量均降低，其中0.3 μmol/L脯氨酸含量最低。由圖5a可以看出，與對照組相比，周麥36幼苗在過氧化氫處理下脯氨酸含量整體上呈現(xiàn)隨處理濃度升高而增加的趨勢，濃度為1.2 μmol/L過氧化氫處理下脯氨酸含量最高。

圖4 中國春幼苗生理指標(biāo)

丙二醛是植物受逆境脅迫后，反映細(xì)胞膜脂過氧化損傷程度的生理指標(biāo)［9］，由圖4b可以看出，中國春小麥幼苗在0.1～0.3 μmol/L過氧化氫處理下，丙二醛含量呈降低趨勢，0.3 μmol/L濃度處理下，丙二醛含量最低。由圖5b可以看出，周麥36幼苗丙二醛含量隨過氧化氫處理濃度增加而升高，1.2 μmol/L過氧化氫處理下丙二醛含量最高。

過氧化氫酶是清除植物體內(nèi)活性氧的重要酶［10］，由圖4c可以看出，中國春小麥幼苗在0.1～0.3 μmol/L過氧化氫處理下，CAT活性無明顯變化，但在0.6～1.2 μmol/L濃度處理下CAT活性均呈顯著升高趨勢，其中1.2 μmol/L濃度處理下CAT活性升高最多。由圖5c可以看出，周麥36小麥幼苗在0.1～0.9 μmol/L濃度處理下，CAT活性整體上呈現(xiàn)升高趨勢。在1.2 μmol/L濃度處理下，CAT活性呈現(xiàn)降低趨勢。

圖5 周麥36幼苗生理指標(biāo)

3 討論與結(jié)論

過氧化氫作為活性氧（ROS），在植物體內(nèi)發(fā)揮著雙重作用。有研究報(bào)道，低濃度過氧化氫對白沙蒿種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，高濃度過氧化氫添加下，白沙蒿種子的萌發(fā)得到促進(jìn)［11］。本試驗(yàn)研究結(jié)果與此相反，種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育情況與過氧化氫的最適濃度相關(guān)，0.3 μmol/L低濃度外源過氧化氫處理下的3種小麥種子的活力和萌發(fā)率均有促進(jìn)效果，這與李昆峰等［12］、盧金［13］報(bào)道的低濃度促進(jìn)種子萌發(fā)結(jié)果一致。同時中國春和Fielder幼苗株高和鮮重分別在0.3 μmol/L和0.1 μmol/L濃度下也表現(xiàn)出最佳促進(jìn)效果。上述結(jié)果表明適宜濃度的外源過氧化氫促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育，這可能與過氧化氫的殺菌作用有關(guān)，一定程度保護(hù)了種子免受細(xì)菌感染，提高了種子活力和萌發(fā)率［14］。另一方面，過氧化氫分解成氧氣，促進(jìn)呼吸作用，打破種子休眠，提高種子的活力，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育［13-15］。

過氧化氫作為活性氧（ROS），在適量情況下，可在一定程度內(nèi)通過酶促解毒系統(tǒng)（包括SOD、CAT、APX、POD等）和非酶促解毒系統(tǒng)（ASA、GSH等）多方面復(fù)雜的協(xié)同作用來清除過氧化氫，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的活性氧保持動態(tài)平衡［16］，即植物體通過提高自身的滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、增強(qiáng)植物體內(nèi)抗氧化酶活力等，保護(hù)體內(nèi)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)免受損害。但隨過氧化氫濃度的增大，試驗(yàn)結(jié)果顯示，周麥36幼苗高度和鮮重均出現(xiàn)抑制效果，并在1.2 μmol/L高濃度外源過氧化氫處理下，3種小麥種子的活力、萌發(fā)率以及幼苗高度和鮮重均出現(xiàn)最大抑制效果。這種現(xiàn)象有可能是由于高濃度的過氧化氫引起植物體內(nèi)的活性氧（ROS）在植物體內(nèi)過量積累，打破了植物體活性氧（ROS）保持的動態(tài)平衡狀態(tài)，造成了細(xì)胞質(zhì)膜過氧化，從而破壞植物體細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和機(jī)能，對植物造成氧化損傷［1］，抑制小麥種子的萌發(fā)和幼苗的生長。所以除周麥36外，整體表現(xiàn)出低濃度促進(jìn)、高濃度抑制效果；另外，上述試驗(yàn)結(jié)果還表明，不同品種對外源過氧化氫的敏感度不同，這可能和不同品種小麥內(nèi)源性過氧化氫積累水平相關(guān)。

植物根系的發(fā)育在農(nóng)業(yè)上具有重要意義，根系發(fā)育的好壞關(guān)系到幼苗存活情況。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3種小麥在低濃度時促進(jìn)發(fā)根長度，抑制發(fā)根數(shù)；高濃度促進(jìn)發(fā)根數(shù)，抑制發(fā)根長度。這可能與小麥?zhǔn)苓^氧化氫的逆境脅迫的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，高濃度過氧化氫處理，使根細(xì)胞受到了損害，抑制了根細(xì)胞伸長的過程，從而使其根長受到了抑制；亦或是施用過氧化氫會提前促進(jìn)次生壁的形成，抑制了根細(xì)胞的伸長；但過氧化氫在抑制細(xì)胞伸長的同時，卻沒有抑制細(xì)胞的分裂，即植物為了緩解脅迫，通過增加側(cè)根數(shù)量來增加根部總吸收表面積，來彌補(bǔ)過氧化氫抑制生長引起的根部的吸收表面積變小［17］。本試驗(yàn)中植物通過增加側(cè)根數(shù)量在一定程度上能緩解脅迫效應(yīng)，但也無法完全彌補(bǔ)高濃度過氧化氫造成的抑制作用，所以造成了高濃度過氧化氫處理下，雖然發(fā)根數(shù)多，但總體幼苗長勢相對較差的現(xiàn)象。這與相關(guān)研究報(bào)道的在低磷或缺磷情況下，根組織中過氧化作用增強(qiáng)，過氧化氫含量增加，小麥側(cè)根密度較高，平均側(cè)根長度降低［18］；高濃度的過氧化氫處理后的小麥根細(xì)胞生長受到抑制［13］；鋁脅迫下大麥根尖細(xì)胞過氧化氫大量累積會導(dǎo)致根系細(xì)胞死亡，從而抑制根系的伸長［16］；低劑量的過氧化氫可以增加根的質(zhì)量和長度，過氧化氫誘導(dǎo)的氧化脅迫能促進(jìn)幼苗新根生成，抑制根伸長［17］等試驗(yàn)結(jié)果一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)漬水脅迫下，外源乙烯和過氧化氫的處理促進(jìn)了小麥根系生長［19］。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，不同環(huán)境條件下試驗(yàn)研究結(jié)果不同；相同條件下，不同植物對過氧化氫處理的響應(yīng)也不盡一致。

過氧化氫可誘導(dǎo)酶促系統(tǒng)，提升清除活性氧的能力，一定程度緩解細(xì)胞膜的氧化損害［9］。由試驗(yàn)結(jié)果可知中國春幼苗在0.3 μmol/L過氧化氫處理下，其脯氨酸含量和丙二醛含量相對較低，過氧化氫酶活力略升高；在1.2 μmol/L濃度下3種生理指標(biāo)均表現(xiàn)為顯著增加趨勢，這表明適宜濃度過氧化氫處理有助于小麥幼苗的發(fā)育，而高濃度過氧化氫處理下，對植物已經(jīng)造成氧化損傷致使MDA積累增加，植物并通過提高脯氨酸及過氧化氫酶等來調(diào)節(jié)逆境脅迫的損害而減緩損傷程度。但逆境脅迫超過植物所能承受極限時，植物則表現(xiàn)為抗性降低而出現(xiàn)衰老死亡現(xiàn)象。比如，周麥36幼苗體內(nèi)脯氨酸、丙二醛的含量及過氧化氫酶活力隨過氧化氫處理濃度增大均表現(xiàn)出顯著升高，表明低濃度過氧化氫處理時，植物體受到氧化損傷信號刺激下提高了自身的抗性；而在高濃度（0.9～1.2 μmol/L）過氧化氫持續(xù)作用下，過氧化氫酶活性又表現(xiàn)為迅速降低現(xiàn)象。這充分說明隨植物遭受逆境脅迫壓力升高，植物體受傷程度加重，植物整體上抗性協(xié)調(diào)能力降低，過氧化氫酶活性隨之降低。

綜上所述，中國春小麥在0.3 μmol/L濃度下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢、幼苗株高和鮮重促進(jìn)效果最好，1.2 μmol/L濃度處理下表現(xiàn)出明顯抑制效果；Fielder小麥在0.3 μmol/L濃度下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢，在0.1 μmol/L濃度下幼苗株高和鮮重促進(jìn)效果最好，1.2 μmol/L濃度處理下表現(xiàn)出明顯抑制效果；周麥36在0.3 μmol/L濃度下種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢促進(jìn)效果最好，在0.1 μmol/L濃度下鮮重略有增加，隨過濃度增大幼苗株高和鮮重逐漸受抑制。過氧化氫參與種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育的調(diào)控，在植物體內(nèi)發(fā)揮著雙重的角色，即對小麥種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育均表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制現(xiàn)象，并且在植物發(fā)育的不同時期，以及同一作物不同品種之間對外源過氧化氫處理的敏感性不同。