楊瑰麗，張瑞祥，王 慧，陳 淳，黃翠紅，鄭陶陶，劉永柱

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510642)

水稻Oryza sativa是我國的主要糧食作物之一，是保障我國糧食安全的壓艙石。隨著社會(huì)發(fā)展和人民生活水平的提高，稻米品質(zhì)越來越成為人們關(guān)注的重點(diǎn)，稻米的食味品質(zhì)、香味等性狀越來越成為影響消費(fèi)者喜好的重要因素[1]，具有香味的稻米尤其更具有市場優(yōu)勢。除優(yōu)質(zhì)外，高抗病性也是好的雜交稻品種的必備品質(zhì)，而稻瘟病是我國水稻主要病害之一，近年來我國稻瘟病年發(fā)生面積約5×106hm2[2]。聚合多個(gè)稻瘟病抗性基因、培育高抗水稻品種是防控稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的途徑。分子標(biāo)記輔助選擇 (Molecular marker-assisted selection，MAS)技術(shù)通過與傳統(tǒng)雜交育種相結(jié)合，可快速聚合和轉(zhuǎn)移有利基因，進(jìn)而提高選擇效率，縮短育種年限，成為重要的育種輔助手段[3-7]?！阖SB’和‘廣8B’是具有優(yōu)良育種潛力的保持系材料，所分別對應(yīng)的‘恒豐A’和‘廣8A’育成的一系列三系雜交稻品種，豐產(chǎn)性好，優(yōu)勢明顯[8]，但是在抗病性上還有改良的空間，同時(shí)這2個(gè)保持系稻米缺乏香味。本研究以‘恒豐B’和‘廣8B’為材料，利用前期所創(chuàng)制的攜帶有Pita、Badh2等優(yōu)異等位基因的保持系材料‘B39’，結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇，對2個(gè)保持系稻瘟病抗性和米質(zhì)相關(guān)性狀進(jìn)行定向改良，以期得到優(yōu)質(zhì)、高抗的新保持系，為培育新的優(yōu)質(zhì)不育系和綜合性狀優(yōu)良的雜交稻組合奠定材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

輪回親本：保持系材料‘恒豐B’(廣東省農(nóng)科院水稻研究所利用‘黃殼香選’與保持系種質(zhì)‘113B’雜交選育)；保持系材料‘廣8B’(廣東省農(nóng)科院水稻研究所由‘增城絲苗-8選’和‘1325B’雜交選育)?！阖SB’和‘廣8B’稻米無香味；‘恒豐B’稻瘟病抗性表現(xiàn)為中抗，‘廣8B’稻瘟病抗性為抗。

供體親本：國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心選育的保持系材料‘B39’。該保持系材料具有香味，稻瘟病抗性表現(xiàn)為高抗。前期基因背景分析表明，‘B39’攜帶Pita、badh2等優(yōu)異等位基因。本研究重點(diǎn)為對以上基因位點(diǎn)進(jìn)行定向篩選。

1.2 群體構(gòu)建與后代篩選路線

在2017年早造，分別以‘恒豐B’和‘廣8B’為母本，以‘B39’為父本進(jìn)行雜交；2017年晚造，種植相應(yīng)F1，‘恒豐B’和‘廣8B’分別作為輪回親本，進(jìn)行回交獲得回交一代(BC1F1)；2018年早造，種植相應(yīng)BC1F1，‘恒豐B’和‘廣8B’分別作為輪回親本，進(jìn)行回交獲得回交二代(BC2F1)；2018年晚造，種植相應(yīng)BC2F1，‘恒豐B’和‘廣8B’分別作為輪回親本，進(jìn)行回交獲得回交三代(BC3F1)。每個(gè)回交世代中,根據(jù)株葉形態(tài)選擇外觀與輪回親本相似性最高的個(gè)體篩選目標(biāo)基因型，再根據(jù)株高、抽穗期和粒型等農(nóng)藝性狀，確定改良單株，繼續(xù)與輪回親本回交。2019年早造種植相應(yīng)BC3F1；2019年晚造種植相應(yīng)BC3F2，并對F2群體的單株進(jìn)行稻米品質(zhì)、稻瘟病抗性及農(nóng)藝性狀考察。具體流程見圖1。

1.3 水稻農(nóng)藝性狀調(diào)查與稻米品質(zhì)性狀鑒定

供試材料于2017年至2019年早、晚季種植于廣州市華南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)基地，田間管理(水、肥、病蟲害防治等)按當(dāng)?shù)卮筇锍Ｒ?guī)栽培要求實(shí)施。籽粒完熟期調(diào)查水稻主要農(nóng)藝性狀，稻谷收獲烘干后放置3個(gè)月，按照農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)米質(zhì)測定方法NY147—88[9]進(jìn)行碾磨品質(zhì)、外觀品質(zhì)、直鏈淀粉含量(Amylose content,AC)、膠稠度 (Gel consistency,GC)和堿消值 (Alkali spreading value,ASV)等理化指標(biāo)的測定。稻米香味的測定采用較為便捷和準(zhǔn)確的KOH浸泡法，稱取2 g糙米放入試管中，加入10 mL 0.3 mol/L KOH溶液，加蓋振蕩使溶液和米粒充分接觸，放入50 ℃烘箱加熱10 min后，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)香味樣品，打開試管進(jìn)行香味鑒別，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 分子標(biāo)記檢測

采用CTAB法提取水稻幼嫩葉片基因組DNA。目標(biāo)基因Badh2的基因分型采用毛細(xì)管電泳分析，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測采用自動(dòng)熒光毛細(xì)管電泳 (Fragment AnalyzerTM，USA)，利用 PROSize 3.0對電泳結(jié)果進(jìn)行分析，確定基因型?？剐曰騊ita的基因分型采用高分辨率溶解曲線分析(Highresolution melting analysis，HRM)技術(shù)，該技術(shù)利用基因組單堿基差異對目的基因型進(jìn)行區(qū)分，具體分析方法參考Luo等[10]。本試驗(yàn)中所涉及的引物由生工生物技術(shù)有限公司合成，具體序列信息見表1。

表1 目標(biāo)檢測基因及引物序列Table 1 Target genes and molecular marker sequences

1.5 抗稻瘟病測定

水稻材料的稻瘟病抗性鑒定采用病區(qū)自然誘發(fā)病鑒定方法[11]。2019年晚造親本和6份‘恒豐B’的BC3F2改良株系以及8份‘廣8B’的BC3F2改良株系種植于位于從化呂田的典型稻瘟病代表性自然誘發(fā)病圃，在該病圃進(jìn)行田間穗頸瘟抗性測驗(yàn)。每品系種5行，每行5穴，每穴2～3苗，周邊插植2行高感稻瘟病品種CO39。

1.6 改良株系測保

測定改良的后代株系對于相應(yīng)不育系的雄性不育保持力。2019年早造分別選取‘恒豐B’的BC3F1和‘廣8B’的BC3F1株系進(jìn)行單株測保檢測，2019年晚造套袋后調(diào)查單株不育系自交結(jié)實(shí)率。同時(shí)，利用碘-碘化鉀染色法鑒定水稻花粉育性，最終根據(jù)自交結(jié)實(shí)率及育性檢測結(jié)果保留測保全不育和高不育的保持系株系。

1.7 改良株系的遺傳背景回復(fù)率測定

選取7份BC3F2改良材料，利用水稻20K SNP芯片對改良材料的遺傳背景回復(fù)率進(jìn)行分析。該部分分析工作由石家莊博瑞迪生物技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 回交后代的分子標(biāo)記輔助篩選

對改良群體進(jìn)行抗病基因Pita和香味基因Badh2的分子標(biāo)記檢測，其中Pita利用HRM進(jìn)行基因分型分析，Badh2采用毛細(xì)管電泳進(jìn)行基因分型分析。每造選取雜合基因型的材料與輪回親本回交，BC3F2選取純合抗病基因型的單株進(jìn)行下一步篩選。香味基因分型結(jié)果顯示，BC3F2改良材料均為攜帶優(yōu)異香味基因Badh2(圖2)。對抗病基因Pita的HRM基因分型分析可以對親本及后代改良株系進(jìn)行有效鑒定與篩選(圖3)?！阖SB’與‘廣8B’的改良后代BC3F2株系在該位點(diǎn)均攜帶有Pita抗性基因。

圖2 親本和改良后代BC3F2株系Badh2基因分型毛細(xì)管電泳結(jié)果Fig. 2 Genotyping of Badh2 of parents and the genetically-improved BC3F2 lines detected by capillary electrophoresis

圖3 親本和改良后代BC3F2株系Pita基因分型HRM分析結(jié)果Fig. 3 HRM genotyping of Pita of parents and the genetically-improved BC3F2 lines

2.2 回交后代株系的稻瘟病抗性鑒定

2019年晚造送測‘恒豐B’的BC3F2改良材料6份、‘廣8B’的BC3F2改良材料8份，并進(jìn)行病區(qū)自然誘發(fā)病鑒病圃測定。測抗結(jié)果顯示，與輪回親本‘恒豐B’相比，改良后代材料發(fā)病率為5%～20%，穗瘟病級(jí)分布1～3級(jí)， 80%改良材料稻瘟病抗性評價(jià)為“抗”，20%表現(xiàn)為“高抗”，抗病表現(xiàn)明顯優(yōu)于‘恒豐B’(表2)。與輪回親本‘廣8B’相比，改良后代材料發(fā)病率為5%～20%，穗瘟病級(jí)分布1～3級(jí)，75%改良材料稻瘟病抗性評價(jià)為“抗”，25%表現(xiàn)為“高抗”，抗病表現(xiàn)較親本略有提升(表3)。

表2 ‘恒豐B’改良后代BC3F2稻瘟病抗性鑒定結(jié)果Table 2 Rice blast resistance identification of the genetically-improved BC3F2 lines from ‘Hengfeng B’

表3 ‘廣8B’改良后代BC3F2稻瘟病抗性鑒定結(jié)果Table 3 Rice blast resistance identification of the genetically-improved BC3F2 lines from ‘Guang 8B’

2.3 改良后代株系主要農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)性狀及香味鑒定結(jié)果

對‘恒豐B’和‘廣8B’相應(yīng)的BC3F2改良單株系主要農(nóng)藝性狀、稻米品質(zhì)性狀等進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示，BC3F2改良單株系株高、劍葉長寬性狀、結(jié)實(shí)率和長寬比等性狀與原輪回親本都較為相似。‘恒豐B’的BC3F2改良單株系雖然有效穗數(shù)均減少，但每穗粒數(shù)增加，因此千粒質(zhì)量相對于親本反而表現(xiàn)出一定優(yōu)勢；而‘廣8B’的BC3F2改良單株系則相反，有效穗數(shù)均表現(xiàn)為增加，每穗粒數(shù)較親本有的增加、有的減少，但總體而言千粒質(zhì)量相對于親本也表現(xiàn)出一定優(yōu)勢(表4)。改良后代株系在穗型方面較親本相比，部分表現(xiàn)出穗長增加、著粒更密(圖4、圖5)；而在株型方面，大多數(shù)改良后代株型比親本更緊湊(圖6、圖7)。

表4 親本和改良后代BC3F2株系的主要農(nóng)藝性狀Table 4 Main agronomic characteristics of parents and the genetically-improved BC3F2 lines

圖4 ‘恒豐B’及其后代改良株系H2和H4穗型對比Fig. 4 Panicles of ‘Hengfeng B’ and its genetically improved line，H2 and H4

圖5 ‘廣8B’及其后代改良株系G4和G5穗型對比Fig. 5 Panicles of ‘Guang 8B’ and its genetically improved lines,G4 and G5

圖6 ‘恒豐B’及其后代改良株系H2和H4株型對比Fig. 6 Plant types of ‘Hengfeng B’ and its genetically improved lines,H2 and H4

圖7 ‘廣8B’及其后代改良株系G4和G5株型對比Fig. 7 Plant types of ‘Guang 8B’ and its genetically improved lines，G4 and G5

‘恒豐B’和‘廣8B’的BC3F2改良株系在稻米堊白和碾磨品質(zhì)方面與相應(yīng)輪回親本差別不大；‘恒豐B’的BC3F2改良株系直鏈淀粉含量平均約為18.4%，‘廣8B’的BC3F2改良株系直鏈淀粉含量平均約為17.5%，基本保持了各自親本的低直鏈淀粉含量特性；在膠稠度方面，2個(gè)改良后代群體株系均表現(xiàn)出長膠屬性，膠長在60 mm以上，堿消值在5.7左右；香味鑒定結(jié)果顯示，所有改良材料均表現(xiàn)為有香味(表5)。

表5 親本和改良后代BC3F2株系的稻米品質(zhì)性狀Table 5 Rice quality traits of parents and the genetically-improved BC3F2 lines

2.4 改良材料測保結(jié)果

在2019年早造對‘恒豐B’和‘廣8B’的BC3F1進(jìn)行了單株測保檢測。2019年晚造測保結(jié)果顯示，23個(gè)BC3F1代材料對應(yīng)的測保小區(qū)中，16個(gè)小區(qū)不育等級(jí)為全不育和高不育、4個(gè)小區(qū)為半不育等級(jí)，3個(gè)小區(qū)材料為正?？捎燃?jí)。BC3F1測保材料中69.57%不育等級(jí)為全不育和高不育，17.39%為半不育，13.04%為正?？捎?，可育率達(dá)到30.43%。測保成功的株系花粉活力分析結(jié)果顯示，花粉染色為典型敗育類型(圖8A、8B)；測保不育株株型調(diào)查顯示，不育株株型正常(圖8C、8D)。

圖8 部分測保不育株花粉活力與株型調(diào)查結(jié)果Fig. 8 Pollen vigors and plant types of partial sterile lines

2.5 改良材料遺傳背景回復(fù)率

利用分布于水稻12條染色體上共26 170個(gè)SNP標(biāo)記探針，檢測改良后代材料的遺傳背景回復(fù)率。結(jié)果顯示，改良材料的平均遺傳背景回復(fù)率達(dá)到86.16%，其中最高達(dá)到89.16%，最低為81.29%(表6)。以上研究結(jié)果表明，經(jīng)過三代回交后改良材料的遺傳背景回復(fù)率達(dá)到預(yù)期目標(biāo)。雜合SNP位點(diǎn)所占比例約為3%，表明染色體上還存在一定比例的雜合位點(diǎn)。

表6 部分改良BC3F2株系遺傳背景回復(fù)率Table 6 Genetic background reversion rate of some genetically-improved BC3F2 lines

3 討論與結(jié)論

3.1 稻瘟病抗性和稻米香味性狀改良

水稻稻瘟病是水稻產(chǎn)區(qū)最主要的病害，培育稻瘟病抗性品種是育種專家的重要育種目標(biāo)。目前已經(jīng)報(bào)道了100多個(gè)主效抗病基因，其中36個(gè)已經(jīng)成功克隆，如Pi-ta、Pi2、Pi9、Piz-t、Pigm、Pik、Pi5、Pi1等[12]。利用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將稻瘟病抗性基因聚合是防治稻瘟病害最經(jīng)濟(jì)、最有效的途徑[13]。通過傳統(tǒng)育種方法與分子標(biāo)記輔助選擇方法的有機(jī)結(jié)合，可克服傳統(tǒng)表型鑒定的局限性，能夠快速準(zhǔn)確地對基因型進(jìn)行直接選擇，聚合多個(gè)有利基因，加快育種進(jìn)程[14-16]。本研究中，‘恒豐B’和‘廣8B’的稻瘟病抗性分別為中抗與抗級(jí)別，通過聚合Ptia后，部分改良材料表現(xiàn)出高抗水平。對稻瘟病抗性基因進(jìn)行聚合選擇，可以進(jìn)一步提高改良品種在廣東地區(qū)表現(xiàn)出普適的稻瘟病抗性。

另外，隨著優(yōu)質(zhì)香米市場需求的不斷增加，育種家對稻米香味性狀的培育也日益重視。已有研究表明，香味性狀的主效基因是位于水稻第8號(hào)染色體上的Badh2基因，該基因編碼甜菜堿醛脫氫酶，當(dāng)Badh2基因突變，突變類型中甜菜堿醛脫氫酶活性喪失，可能導(dǎo)致γ-氨基丁醛在體內(nèi)積累，進(jìn)而使γ-氨基丁醛轉(zhuǎn)化為1-吡咯啉，最終合成大量的2-AP積累，進(jìn)而使稻米產(chǎn)生香味[17-19]。用基于該香味基因設(shè)計(jì)的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇,為進(jìn)一步提高香稻育種選擇效率和準(zhǔn)確性提供了可能[20]。本研究中，利用香味分子標(biāo)記對改良材料進(jìn)行篩選，攜帶有Badh2有利等位基因的材料，經(jīng)香味鑒定稻米都具有香味，表明該分子標(biāo)記在香味性狀篩選中起到了有力的作用。

在保持系的改良中，對于供體親本的選擇，除了考慮是否攜帶控制目標(biāo)性狀的目的基因外，同時(shí)應(yīng)考慮對輪回親本保持力的影響，否則會(huì)對保持系的背景產(chǎn)生一定的干擾[21]。本研究中，BC3F1測保材料中還存在有部分半不育及可育現(xiàn)象，原因可能是供體親本‘B39’攜帶了恢復(fù)基因。因此，定向改良育種中，需要考慮供體親本的背景對改良對象的影響，否則可能會(huì)影響定向改良成功率。

通過分子標(biāo)記輔助篩選，結(jié)合抗病性鑒定、香味鑒定和農(nóng)藝性狀的選擇，本研究成功獲得14份含有目標(biāo)基因的BC3F2改良材料(其中，‘恒豐B’的改良材料6份，‘廣8B’的改良材料8份)；且多數(shù)株系的遺傳背景回復(fù)率在80%～90%之間，基本達(dá)到預(yù)期回復(fù)效果。改良后的目標(biāo)株系中87.5%香味評級(jí)為香味較濃；稻瘟病抗性有顯著提高，病圃抗性鑒定抗稻瘟病等級(jí)為抗或高抗稻瘟??；稻米品質(zhì)表現(xiàn)為米粒細(xì)長、低直鏈淀粉、低堊白；其他農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性狀與輪回親本相似。分子標(biāo)記輔助篩選與傳統(tǒng)選、育種的結(jié)合，切實(shí)地縮短了育種進(jìn)程、提高了種質(zhì)改良的成功率。