丁 瑋，陽樹英，劉 洋，張亞寧，張 波

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院,湖南 長沙 410128)

生物炭是生物質(zhì)在有限供氧的密閉環(huán)境中經(jīng)高溫?zé)崃呀猱a(chǎn)生的一類富含碳素(碳質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥60%)的性質(zhì)穩(wěn)定、難溶以及具有一定程度高度芳香化的固體物質(zhì)，主要成分是烷基和芳香結(jié)構(gòu)碳。在土壤中加入生物炭，能夠均衡土壤有機(jī)碳庫[1]、提升肥料養(yǎng)分在作物中的利用率[2]以及提高作物產(chǎn)量[3]等。土壤微生物是土壤生態(tài)環(huán)境的重要組成部分，土壤微生物群落對(duì)土壤環(huán)境條件的變化十分敏感[4]，同時(shí)，土壤微生物也是土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和有機(jī)質(zhì)分解的關(guān)鍵因子，常被用于評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的生物學(xué)特性[5]。已有研究表明，生物炭可提供大量碳源以利于微生物活動(dòng)并成為微生物棲息地，為微生物提供了豐富的食物來源，促進(jìn)微生物繁殖，進(jìn)而活化土壤肥力[6-7]。還有研究表明，生物炭能夠影響微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)、改變土壤微生物利用碳源種類，張秀等[8]研究表明，施用生物炭能提高土壤中微生物群落碳源代謝活性及功能多樣性。前人研究結(jié)果表明，生物炭可影響土壤細(xì)菌群落，但不同水稻品種施用生物炭對(duì)其土壤細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)的影響差異性不甚明了。本研究選取廣東省江門縣臺(tái)山鎮(zhèn)潮土型雙季稻田土壤，種植6個(gè)品種的常規(guī)優(yōu)質(zhì)稻水稻，在收割前進(jìn)行土壤微生物取樣，通過Ion S5TMXL高通量測序技術(shù)，對(duì)16S rRNA基因V3-V4進(jìn)行測序和分析，比較研究不同水稻品種施用生物炭對(duì)其土壤細(xì)菌群落組成及結(jié)構(gòu)的影響差異性，以期為生物炭改善不同品種稻田土壤細(xì)菌群落環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)點(diǎn)與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)在廣東省江門市臺(tái)山市下川島試驗(yàn)田進(jìn)行，下川島地處北回歸線南側(cè)，N21°39′10.49″，E112°36′46.75″，屬亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，年平均氣溫 23℃，年均降雨量 2 279.5 mm，年均日照1 672.5 h，氣候溫和，四季如春。潮土種植 6 種水稻品種，分別為黃華占(Hua)、五常香稻(Wu)、象牙香占 (Ya)、湘晚秈 17(X)、農(nóng)香 32(N)、玉針香 (Yu)，供試生物炭是稻殼生物炭。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計(jì)。試驗(yàn)以生物炭處理為主區(qū)，以水稻品種為副區(qū)。其中，主區(qū)面積120 m2，副區(qū)面積20 m2，重復(fù)3次。潮土中生物炭施用量設(shè)3個(gè)處理，分別為 0（對(duì)照）、3.5 和 7.0 t/hm2，依次記作CK、Tr1和Tr2。在田間水稻移栽前，一次性通過人工翻耕將不同處理的生物炭施入土壤。施入前，各小區(qū)田埂均采用耐用的黑色塑料薄膜進(jìn)行覆蓋包裹，以防止不同處理之間發(fā)生竄肥竄水的情況，對(duì)試驗(yàn)地水稻按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)管理制度進(jìn)行日常管理。

1.3 樣品采集及分析方法

收割前利用取土鉆采集水稻土壤0～15 cm土層土壤樣品，五點(diǎn)土樣法取樣后迅速混勻，裝在聚乙烯自封袋中，放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，委托諾禾致源生物科技有限公司進(jìn)行土壤DNA的提取、文庫構(gòu)建以及高通量測序。

1.4 基因組DNA的提取和PCR擴(kuò)增及高通量測序

對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，檢測DNA的純度和濃度，使用無菌水稀釋樣本DNA至1 ng·μL-1。以稀釋后的基因組DNA為模板，選擇16S rRNA基因V3-V4區(qū)引物鑒定細(xì)菌多樣性。PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，檢測純化PCR產(chǎn)物，剪切回收目標(biāo)條帶。使用 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒進(jìn)行文庫的構(gòu)建，經(jīng)Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Ion S5TMXL進(jìn)行上機(jī)測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Ion S5TMXL下機(jī)數(shù)據(jù)，先對(duì)Reads進(jìn)行剪切、拆分，與注釋數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，去除其中的嵌合體序列得到最終的有效數(shù)據(jù)。全部Clean reads默認(rèn)以97%的一致性聚類成為OTUs，選取出現(xiàn)頻數(shù)最高的OTUs作為代表序列，與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析,序列進(jìn)行均一化處理。使用Qiime軟件(V1.9.1)計(jì)算Chao1、Shannon、Simpson和ACE指數(shù)，使用R軟件(V2.15.3)繪制稀釋曲線并進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析、Beta多樣性指數(shù)組間差異分析，繪制NMDS圖。數(shù)據(jù)采用SPSS(21.0)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序序列的質(zhì)量控制

通過對(duì)42個(gè)土壤樣品細(xì)菌V3-V4區(qū)高通量測序，根據(jù)優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)對(duì)所測序列去雜后，結(jié)果顯示共獲得 3 336 672 條 Clean reads，平均讀長大于 414 bp，相似度為0.97的條件下，對(duì)土壤中細(xì)菌的覆蓋率為97.9%～98.5%，由圖1可知，所有樣本OTU數(shù)量稀釋曲線都急劇上升后趨向平坦，表示各樣本高通量測序數(shù)據(jù)量漸近合理，能夠較準(zhǔn)確地反映土壤微生物的豐富度和多樣性。

圖1 土壤樣本稀釋曲線Fig. 1 Soil sample rarefaction curve

2.2 土壤細(xì)菌群落多樣性和豐富度分析

選用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)比較菌群中優(yōu)勢種種類的豐富程度，反映細(xì)菌群落多樣性，選用Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映細(xì)菌群落的數(shù)量豐富度。由表1可知，Shannon指數(shù)的范圍是6.708～9.706，Simpson指數(shù)的范圍是0.919～0.995，Chao1 指數(shù)的范圍是 3 024.949～4 746.209，ACE 指數(shù)的范圍是 3 169.582～4 339.961。Tr1、Tr2 處理均顯著提高了品種Yu的細(xì)菌群落多樣性(P＜0.05)，但Tr1、Tr2之間差異不顯著。Tr2處理顯著提高水稻品種Yu的細(xì)菌群落豐富度(P＜0.05)。Tr1處理顯著提高了水稻品種Hua的細(xì)菌群落豐富度(P＜0.05)。水稻品種Yu在CK處理時(shí)細(xì)菌群落多樣性顯著低于其他品種(P＜0.05)，但Tr2處理時(shí)水稻品種Yu的細(xì)菌群落豐富度顯著高于品種Hua、Wu和N(P＜0.05)。

表1 基于OTU的土壤細(xì)菌群落多樣性指數(shù)1)Table 1 Diversity index of soil bacterial community based on OTU

2.3 土壤細(xì)菌群落組成分析

本研究采用97%相似水平為標(biāo)準(zhǔn)界定OTU，對(duì)OTU代表序列進(jìn)行聚類和物種注釋，共檢測出細(xì)菌 73門、92綱、174目、298科、682屬和456種，細(xì)菌群落具有較高的多樣性。由圖2門水平的細(xì)菌相對(duì)豐度柱狀圖可知，在門水平上占優(yōu)勢水平的為變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、擬桿菌門Bacteroidetes、硝化螺旋菌門Nitrospirae、藍(lán)藻細(xì)菌門Cyanobacteria、酸桿菌門Acidobacteria、綠彎菌門Chloroflexi、泉古菌門Crenarchaeota、放線菌門Actinobacteria和廣古菌門Euryarchaeota。細(xì)菌群落第1優(yōu)勢類群為變形菌門，其相對(duì)豐度為30.0%～61.1%，主要包括3個(gè)亞類：γ-變形菌 (Gamma-proteobacteria)、δ-變形菌(Delta-proteobacteria)和α-變形菌 (Alphaproteobacteria)，其所占的比例范圍分別為9.1%～52.5%、5.7%～17.9%和2.9%～8.6%，其中，以γ-變形菌和δ-變形菌為優(yōu)勢菌綱。細(xì)菌群落第2大優(yōu)勢類群為厚壁菌門，其相對(duì)豐度為13.4%～30.6%；且絕大部分為芽孢桿菌綱Bacilli。細(xì)菌群落第3大優(yōu)勢類群為擬桿菌門，其相對(duì)豐度為3.3%～11.1%，其主要有擬桿菌綱Bacteroidia和懶桿菌綱Ignavibacteria。

圖2 生物炭不同施加量處理在門水平上對(duì)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度的影響Fig. 2 Effects of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at phylum level

細(xì)菌群落組成中優(yōu)勢菌門類型在生物炭不同施加量處理后無較大區(qū)別，但生物炭不同施加量處理間的細(xì)菌相對(duì)豐度有所區(qū)別。各水稻品種Tr2處理相較Tr1處理均使變形菌門的相對(duì)豐度上升，其中以品種Hua變化最為明顯，品種Hua的變形菌門相對(duì)豐度Tr2處理為53.5%，顯著高于CK處理(相對(duì)豐度為31.2%，P＜0.05)。Tr1處理降低了品種X、N、Yu的相對(duì)豐度，其中品種Yu的變形菌門相對(duì)豐度Tr1處理(30.0%)顯著低于CK處理(61.1%，P＜0.05)。品種Yu的擬桿菌門相對(duì)豐度隨著生物炭的施加而逐漸上升，Tr2處理的相對(duì)豐度(11.4%)較CK(3.3%)明顯上升(P＜0.05)。品種Hua的酸桿菌門相對(duì)豐度Tr2處理(4.5%)較CK(8.0%)明顯下降(P＜0.05)。廣古菌門的相對(duì)豐度則隨著生物炭的施加，Tr1處理較CK明顯上升，Tr2處理較CK明顯下降(P＜0.05)。厚壁菌門、硝化螺旋菌門在部分品種中同樣存在相似趨勢，但未表現(xiàn)出顯著性差異。水稻土壤在CK處理的各菌門相對(duì)豐度存在品種間的顯著性差異，其中，品種Yu的變形菌門相對(duì)豐度在CK處理時(shí)顯著高于除品種X外的其他品種(P＜0.05)，以γ-變形菌相對(duì)豐度52.5%相較其他品種存在極顯著差異(P＜0.01)；品種Hua的硝化螺旋菌門相對(duì)豐度在CK處理時(shí)顯著高于除品種Ya外的其他品種(P＜0.05)，品種Ya的硝化螺旋菌門相對(duì)豐度在CK處理時(shí)也顯著高于品種Yu(P＜0.05)。不同生物炭施加量對(duì)不同菌種門的相對(duì)豐度影響不盡一致；不同品種的水稻對(duì)土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度存在影響。

相對(duì)豐度較高的前20屬細(xì)菌中，根據(jù)各細(xì)菌類群的平均相對(duì)豐度排名，將未能在97%相似度上分類的歸類為Unidentified。由圖3可見，馬賽菌屬M(fèi)assilia相對(duì)豐度為1.2%～41.4%、芽孢桿菌屬Bacillus相對(duì)豐度為9.4%～24.1%，均為優(yōu)勢菌屬，除此之外，其他各細(xì)菌類群的平均相對(duì)豐度均小于2.0%，主要有不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、未鑒定的藍(lán)細(xì)菌(UnidentifiedCyanobacteria)、未鑒定的梭狀芽孢桿菌(UnidentifiedClostridiales)、膨脹芽胞桿菌屬Tumebacillus等。食酸菌屬Acidovorax、鞘氨醇單胞菌屬Sphingomonas、土地桿菌屬Pedobacter等菌屬的相對(duì)豐度均在Tr2處理時(shí)較CK組顯著上升(P＜0.05)，相對(duì)豐度較小或極小的菌屬易在生物炭處理后出現(xiàn)顯著性差異。馬賽菌屬在水稻品種Yu的CK處理相對(duì)豐度為41.4%，極顯著高于其他水稻品種(P＜0.01)；不動(dòng)桿菌屬在水稻品種Hua的Tr2處理相對(duì)豐度為14.1%，顯著高于其他水稻品種及處理(P＜0.05)?？梢?，生物炭處理引起了對(duì)應(yīng)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在屬水平上的變化，相對(duì)豐度較低或極低的土壤細(xì)菌類群更敏感，更容易受到生物炭的影響。

圖3 生物炭不同施加量處理在屬水平上對(duì)土壤細(xì)菌相對(duì)豐度的影響Fig. 3 Effect of different biochar application amounts on the relative abundance of soil bacteria at the genus level

2.4 不同土壤細(xì)菌群落間的關(guān)系分析

如圖4所示，對(duì)各土壤樣本序列進(jìn)行非度量多維尺度 (Non-metric multi-dimensional scaling,NMDS)分析，各水稻品種均顯示出Tr1處理組內(nèi)差異最小，CK則相對(duì)組內(nèi)差異較大，Tr2處理則相對(duì)組內(nèi)差異最大。盡管生物炭不同施加量處理下各樣本的組內(nèi)差異略大，但CK組較生物炭Tr1處理在空間位置上有明顯分離，而Tr2處理的土壤樣本與CK組土壤樣本的空間距離較近，說明各水稻品種均表現(xiàn)出在Tr1處理下相較CK組土壤細(xì)菌群落組成有差別。

圖4 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的非度量多維尺度(NMDS)分析Fig. 4 Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS)analysis of soil bacterial community structure

對(duì)門水平上的物種相對(duì)豐度進(jìn)行聚類分析，聚類結(jié)果(圖5)顯示，各處理在門水平上的細(xì)菌主要分為3個(gè)分支，主要以Tr1分類聚類在一起，CK與Tr2處理聚類在一起，說明施用生物炭Tr2處理與CK組的菌群豐度相似性較Tr1處理更高，Tr1處理對(duì)土壤細(xì)菌群落的分布存在影響。

圖5 門水平上的土壤細(xì)菌相對(duì)豐度聚類分析Fig. 5 Cluster analysis of relative abundance of soil bacteria at phylum level

3 討論與結(jié)論

3.1 生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性及豐富度的影響

研究表明，土壤微生物與其所處的環(huán)境密切相關(guān)，改變環(huán)境因素會(huì)引起微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成的變化[9]；土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)大，說明供微生物生長的營養(yǎng)物質(zhì)較豐富[10]。本研究表明，Tr1、Tr2處理均顯著提高了水稻品種Yu的土壤細(xì)菌群落多樣性，同時(shí)Tr2處理還顯著提高了水稻品種Yu的細(xì)菌群落豐富度；生物炭Tr1處理顯著提高了水稻品種Hua的細(xì)菌群落豐富度；相較于CK處理，生物炭Tr1處理對(duì)土壤群落結(jié)構(gòu)也存在影響，這與Muhammad等[11]、Doan等[12]研究生物炭在適宜施加范圍內(nèi)能夠改善微生物豐富度、群落多樣性[9,13]及群落結(jié)構(gòu)的結(jié)果一致。生物炭施加的促進(jìn)作用主要在于生物炭為細(xì)菌生長補(bǔ)充了豐富的碳源，土壤中溶解性有機(jī)碳是土壤微生物群落的能量和微生物細(xì)胞組成成分的主要來源以及土壤微生物新陳代謝的主要產(chǎn)物，適量的外部碳源能激發(fā)細(xì)菌的生長繁育[14]。生物炭Tr1處理較CK組顯著提高了水稻品種Hua的土壤細(xì)菌群落豐富度，但Tr2處理較CK無顯著性差異，這一結(jié)果與Dempster等[15]、常棟等[16]研究結(jié)果相似，可能是因?yàn)槲⑸飳?duì)有機(jī)質(zhì)正當(dāng)分解的碳氮質(zhì)量比為25∶1，所以當(dāng)生物炭施加后，需要消耗土壤中有效態(tài)氮素，但因土壤中的有效態(tài)氮素含量有限，因此當(dāng)生物炭施加過量時(shí)，土壤中碳氮比增大，反而導(dǎo)致微生物的分解作用變慢，抑制了土壤細(xì)菌群落多樣性以及物種豐富度[17]。

3.2 生物炭對(duì)土壤細(xì)菌群落組成的影響

本研究中發(fā)現(xiàn)，不同生物炭處理并沒有改變主要優(yōu)勢菌群門的種類，但優(yōu)勢類群的相對(duì)豐度存在顯著差異，各處理均以變形菌門為最優(yōu)勢菌門，其中以γ-、δ-、α-變形菌綱為優(yōu)勢亞群，具有豐富的代謝多樣性，Lesaulnier等[18]的研究還發(fā)現(xiàn)土壤中變形菌門大多為革蘭陰性菌，其中許多細(xì)菌負(fù)責(zé)固氮，可增加土壤中的氮素營養(yǎng)，參與N、P、C等元素循環(huán)[19-20]，促進(jìn)植物的生長[21-22]，這與周佳等[23]、毛立暉[24]研究得到的稻田土壤細(xì)菌優(yōu)勢菌群相似。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生物炭在Tr2處理的土壤中變形菌門相對(duì)豐度明顯上升，其中以水稻品種Hua的變化最為顯著，表明生物炭的施加促進(jìn)了土壤細(xì)菌群落的固氮功能。擬桿菌門具有降解糖類及一種分布廣泛的難降解的有毒有機(jī)物多環(huán)芳烴的能力[25]，試驗(yàn)結(jié)果表明，水稻品種Yu的擬桿菌門相對(duì)豐度隨著生物炭的添加而上升，表示提升了糖類降解的能力。生物炭施加使得變形菌門及擬桿菌門相對(duì)豐度的變化結(jié)果與馮慧琳等[26]、朱孟濤等[27]在生物炭施加對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響研究中所得結(jié)果一致。在屬分類水平，隸屬于變形菌門的馬賽菌屬以及隸屬于厚壁菌門的芽孢桿菌屬是優(yōu)勢屬，優(yōu)勢屬的相對(duì)豐度無顯著性差異；但生物炭Tr2處理顯著提升了食酸菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、土地桿菌屬等菌屬的相對(duì)豐度，這些菌主要隸屬于變形菌門或擬桿菌門，因此生物炭施加能夠促進(jìn)固氮的功能，而引發(fā)變化的主要原因可能在于生物炭的結(jié)構(gòu)特性是多孔并且具有巨大比表面積，炭表面的功能基團(tuán)具有專性吸附作用，能夠在土壤中有效吸附包括溶解性有機(jī)碳在內(nèi)的易礦化有機(jī)碳和NH4+[11]，所以當(dāng)生物炭被施入稻田后，稻田土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分含量發(fā)生了改變，土壤中相對(duì)豐度較低的細(xì)菌菌屬比優(yōu)勢菌屬對(duì)土壤環(huán)境因子的微小變化更敏感，因此也更容易發(fā)生改變[28]。雖然馬賽菌屬、芽孢桿菌屬等細(xì)菌的相對(duì)豐度在生物炭施加處理后也出現(xiàn)了波動(dòng)，但因其相對(duì)豐度較高，微小的外在環(huán)境變化并未改變其在群落結(jié)構(gòu)組成中的優(yōu)勢地位。

3.3 結(jié)論

生物炭Tr1、Tr2處理顯著提高了水稻品種Yu的土壤細(xì)菌群落多樣性，Tr2處理顯著提高了水稻品種Yu的細(xì)菌群落豐富度，生物炭Tr1處理顯著提高了水稻品種Hua的細(xì)菌群落豐富度。細(xì)菌群落組成中占優(yōu)勢的菌門類型在生物炭不同施加量處理間無較大區(qū)別，但處理間細(xì)菌相對(duì)豐度上有所區(qū)別，某些水稻品種的生物炭Tr1或Tr2處理主要提高了變形菌門、擬桿菌門以及廣古菌門的相對(duì)豐度，這些細(xì)菌在提高土壤養(yǎng)分方面具有一定作用。生物炭處理引起了對(duì)應(yīng)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成在屬水平上的變化，相對(duì)豐度較低或極低的土壤細(xì)菌類群更敏感，更容易受到生物炭的影響。與CK組相比，生物炭Tr1處理對(duì)土壤細(xì)菌群落組成及分布存在影響。水稻品種Hua和Yu的土壤細(xì)菌群落受生物炭施加影響變化較大。生物炭處理的差異主要體現(xiàn)在土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度上。