肖冬冬，宗伍輩，孫康莉，李加俊，劉耀光，郭晶心

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,廣東 廣州 510642)

抽穗期是水稻重要的農(nóng)藝性狀，決定水稻品種對(duì)栽培季節(jié)和地域的適應(yīng)性，與產(chǎn)量密切相關(guān)。水稻抽穗期受光照和溫度等外部因素調(diào)控，同時(shí)也受內(nèi)在信號(hào)如苗齡和激素的作用[1]。水稻抽穗期主要由3個(gè)因素決定：基本營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)性、感光性和感溫性。水稻是典型的短日植物，短日促進(jìn)抽穗，長(zhǎng)日延遲抽穗[2]。

在長(zhǎng)日植物擬南芥中，光周期對(duì)開(kāi)花的主要調(diào)控途徑是GI-CO-FT[3]。GI是生物鐘構(gòu)成基因，CO是核心轉(zhuǎn)錄因子，長(zhǎng)日信號(hào)經(jīng)由GI等促進(jìn)CO在黃昏特異積累，激活成花素基因FT的轉(zhuǎn)錄。FT蛋白由葉片轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織促進(jìn)成花轉(zhuǎn)換[4]。

水稻中成花素基因是Hd3a和RFT1，是擬南芥FT的同源基因[5-7]。Ehd1是水稻特有的1個(gè)抽穗基因，編碼含341個(gè)氨基酸的B型反應(yīng)調(diào)節(jié)子，激活Hd3a和RFT1的表達(dá)，促進(jìn)抽穗[8-9]。有研究表明，水稻中存在長(zhǎng)日抑制途徑(Hd1/Ghd7/DTH8)-Ehd1-Hd3a/RFT1和短日促進(jìn)途徑Hd1-Hd3a/RFT1，協(xié)同調(diào)控抽穗期和感光性[10]。

在Ehd1、Hd3a/RFT1的上游，存在眾多調(diào)控基因。其中，水稻感光性的核心基因有Hd1、Ghd7、DTH8、OsPRR37。Hd1是克隆的第1個(gè)水稻抽穗期基因，是擬南芥CO的同源基因，蛋白含有B-box和CCT結(jié)構(gòu)域。在一定的遺傳背景中，Hd1具有雙重作用，長(zhǎng)日抑制、短日促進(jìn)抽穗，但Hd1的轉(zhuǎn)錄水平在長(zhǎng)、短日下并沒(méi)有明顯差異[11-13]。Ghd7為單子葉植物特有，編碼含有CCT結(jié)構(gòu)域的蛋白，長(zhǎng)日下特異表達(dá)，一因多效，對(duì)水稻株高、抽穗和穗粒數(shù)有顯著促進(jìn)作用[14]。DTH8編碼CCAAT-Box-Binding轉(zhuǎn)錄因子中NF-YB(也稱(chēng)為HAP3)亞基，長(zhǎng)日下依賴(lài)Ghd7促進(jìn)株高、抽穗和穗粒數(shù)[15-17]。OsPRR37編碼 PSEUDO-RESPONSE REGULATOR 7的類(lèi)似蛋白，也含有CCT結(jié)構(gòu)域，長(zhǎng)日下抑制抽穗提高產(chǎn)量[18-21]。

研究表明，Hd1、Ghd7、DTH8和OsPRR37之間存在復(fù)雜的遺傳和分子互作[10,22-23]。無(wú)論日長(zhǎng)如何，Hd1(在ghd7/dth8/OsPRR37背景中)促進(jìn)抽穗，Ghd7(在hd1/dth8/OsPRR37背景中)抑制抽穗。長(zhǎng)日下Hd1、Ghd7和DTH8存在雙基因和三基因的互作，形成不同的蛋白抑制復(fù)合體，從而部分抑制(雙基因組合)或完全沉默(三基因組合)Ehd1-Hd3a/RFT1開(kāi)花通路，使水稻不同程度地延遲抽穗或不抽穗。短日下，Ghd7的表達(dá)水平很低，Hd1原本促進(jìn)Hd3a/RFT1表達(dá)的作用與抑制復(fù)合體的作用存在競(jìng)爭(zhēng)，不同程度地促進(jìn)抽穗。其中，無(wú)論日長(zhǎng)如何，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗作用更強(qiáng)。

以往對(duì)Ghd7和DTH8的研究是基于其他核心基因有功能的遺傳背景，為在不同的遺傳背景中，特別是在hd1和prr37無(wú)功能的(hd1/prr37)背景中，深入了解Ghd7和DTH8調(diào)控水稻抽穗和農(nóng)藝性狀的遺傳互作關(guān)系，本研究鑒定了1個(gè)hd1/prr37背景下Ghd7和DTH8的雙基因分離群體，發(fā)現(xiàn)Ghd7和DTH8單基因均能抑制抽穗且不受日長(zhǎng)影響。DTH8單基因僅微弱抑制抽穗，卻能顯著增加二級(jí)枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)。在長(zhǎng)、短日下，Ghd7和DTH8雙基因組合更強(qiáng)烈抑制Ehd1-Hd3a/RFT1的表達(dá)，延遲抽穗，并且能夠明顯增加水稻株高、一級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)陳志強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)培育了恢復(fù)系‘航恢1179’、不育系‘寧A’及雜交稻‘寧優(yōu)1179’(粵審稻2014044)[24-25]，本研究從‘寧優(yōu)1179’后代中篩選培育了1個(gè)F6群體(hd1/prr37背景，Ghd7和DTH8雙基因分離)(簡(jiǎn)寫(xiě)為GgDd)，并從中鑒定得到4種基因型純合材料ggdd、ggDD、GGdd、GGDD。材料種植于廣東省廣州市天河區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)科研基地，按水稻常規(guī)方法栽培管理。在廣州自然短日和自然長(zhǎng)日條件下種植雙基因分離群體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分子標(biāo)記鑒定 采用王慧娜等[26]的方法提取水稻葉片基因組DNA。利用親本基因組中Hd1、Ghd7、DTH8和OsPRR37的序列差異設(shè)計(jì)分子標(biāo)記引物(表1)，通過(guò)PCR和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，鑒定F2～F6個(gè)體基因型。

表1 分子標(biāo)記引物序列Table 1 The primer sequences of molecular markers

1.2.2 表型調(diào)查 廣州 (23.13°N，113.27°E)自然長(zhǎng)日 (Natural long day，NLD：4 月下旬到 7 月中旬，包含了1 h曙暮光和日出到日落的時(shí)間，總計(jì)大于13.5 h)和自然短日 (Natural short day，NSD：8 月中旬到10月，包含了1 h曙暮光和日出到日落的時(shí)間，總計(jì)小于13.5 h)，以單株為單位每天調(diào)查抽穗期，本研究以該株主穗抽出1 cm作為始穗的標(biāo)準(zhǔn)，以種子萌動(dòng)到始穗的天數(shù)作為抽穗期。水稻材料成熟后，考察記錄株高、穗長(zhǎng)、一級(jí)枝梗數(shù)、二級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)、千粒質(zhì)量、分蘗數(shù)等農(nóng)藝性狀。

1.2.3 遺傳效應(yīng)的計(jì)算 以雙基因無(wú)功能型植株ggdd為參照，計(jì)算Ghd7、DTH8和兩者組合的凈遺傳效應(yīng)(e)[10]。單基因的凈遺傳效應(yīng)計(jì)算公式：e(ggDD) =D(ggDD) -D(ggdd)、e(GGdd) =D(GGdd) -D(ggdd)，雙基因的凈遺傳效應(yīng)計(jì)算公式：e(GGDD) =D(GGDD) -D(ggdd) -e(ggDD) -e(GGdd)；式中，D代表平均抽穗期。

1.2.4 感光指數(shù)的計(jì)算 以雙基因無(wú)功能型植株ggdd為參照，計(jì)算不同功能型組合感光指數(shù)(Photoperiod sensitivity index，PSI)[10]，用 mPSIb和mPSIc分別計(jì)算同一生長(zhǎng)季節(jié)和不同生長(zhǎng)季節(jié)的感光指數(shù)。以DTH8為例，mPSIb(ggDD) = (DALD-DNSD)/DNSD，mPSIc(ggDD) = (DNLD-DNSD)/DNSD，同樣計(jì)算其他基因型組合的感光指數(shù)；式中，ALD代表人工長(zhǎng)日，NLD代表自然長(zhǎng)日，NSD代表自然短日。

1.2.5 qRT-PCR 表達(dá)檢測(cè) 在自然短日和人工長(zhǎng)日 (Artificial long day，ALD：自然長(zhǎng)日同期種植材料，并在黃昏人工加光，使光照時(shí)間維持在14.0～14.5 h)下種植4基因型純合材料ggdd、ggDD、GGdd、GGDD，苗齡60 d，早上8:00取樣，取每個(gè)單株的倒一至倒三葉上半段，共取3次生物學(xué)重復(fù)。采用Trizol法提取植物總RNA，經(jīng)DNaseI處理后用Oligo d(T)反轉(zhuǎn)成cDNA，用目標(biāo)基因特異引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，以Actin作為內(nèi)參基因(表2)，通過(guò)計(jì)算2-△Ct值來(lái)確定目標(biāo)基因在4種純合型材料中的相對(duì)表達(dá)量[10]。

表2 qRT-PCR 引物序列Table 2 The sequences of qRT-PCR primers

1.2.6 對(duì)農(nóng)藝性狀貢獻(xiàn)度的計(jì)算 以雙基因無(wú)功能型植株ggdd為參照，計(jì)算不同功能型組合對(duì)農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度 (Contribution degree，CD)。以DTH8為例，CDDTH8/% = (ATggDD- ATggdd)/ATggdd，式中，AT表示各農(nóng)藝性狀(Agronomic trait)的平均值，同樣方法計(jì)算其他基因型組合的貢獻(xiàn)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 在 hd1/prr37背景中，Ghd7和 DTH8雙基因分離群體的構(gòu)建和抽穗表型

已有研究表明，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗作用更強(qiáng)[22]。為了深入揭示Ghd7和DTH8調(diào)控水稻抽穗和農(nóng)藝性狀的遺傳互作關(guān)系，本研究構(gòu)建了1個(gè)Ghd7和DTH8雙基因分離的重組自交群體(hd1/prr37背景，詳見(jiàn)“1.1”)?！畬嶢’攜帶功能型Hd1、DTH8和無(wú)功能型ghd7、prr37，‘航恢1179’攜帶無(wú)功能型hd1、dth8和功能型Ghd7、PRR37。本研究利用分子標(biāo)記，在‘寧A’和‘航恢1179’的F2代中選擇hd1/prr37純合無(wú)功能、Ghd7和DTH8為雜合的植株 (基因型為Ghd7ghd7DTH8dth8，GgDd)，自交留種并持續(xù)選擇到F5，從F5中選擇GgDd基因型單株自交留種，此F6群體用于下一步研究(圖1)。

圖1 ‘寧 A’(NA)與‘航恢 1179’(HH) 4 個(gè)抽穗基因的結(jié)構(gòu)和分子標(biāo)記Fig. 1 Structures and molecular markers of four heading date genes in ‘Ning A’ (NA) and ‘Hanghui 1179’ (HH)

我們?cè)趶V州自然短日和自然長(zhǎng)日條件下分別種植了116株和188株F6群體，觀察植株的抽穗期并進(jìn)行了分子標(biāo)記檢測(cè)。對(duì)植株的基因型進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，群體中Ghd7和DTH8獨(dú)立分配，分離符合孟德?tīng)栯p基因分離遺傳定律 9∶3∶3∶1，χ2(9∶3∶3∶1)＜χ20.05,df=3=7.82，無(wú)顯著差異 (表3)。

表3 F6 群體基因型的卡方檢驗(yàn)Table 3 The chi-square test of plant genotypes from F6 population

在自然長(zhǎng)日下，Ghd7和DTH8雙基因分離群體的抽穗期在 82～118 d 之間呈較連續(xù)分布，110 d為抽穗高峰；ggdd和ggD_(_代表DD純合或Dd雜合)基因型植株早抽穗，G_dd型抽穗稍晚，同時(shí)攜帶功能型G_D_的植株抽穗最晚(圖2a)。在自然短日下，分離群體的抽穗期分布在 66～97 d 之間，90 d為抽穗高峰；Ggdd、G_dd和ggDD基因型的植株抽穗明顯早于G_D_植株(圖2b)。在Ghd7和DTH8雙基因分離的群體中，長(zhǎng)、短日下二者組合植株抽穗最晚。我們從F6中篩選出4種基因型純合的植株自交留種，后續(xù)用這些純合體研究Ghd7和DTH8的遺傳互作和調(diào)控機(jī)制。

圖2 自然長(zhǎng)日 (a)、自然短日 (b)下 Ghd7、DTH8雙基因分離群體抽穗分布Fig. 2 The distribution of heading date in Ghd7，DTH8 segregating population under natural long day (a)natural short day (b) conditions

2.2 Ghd7和 DTH8 4 種基因型組合材料的抽穗期、感光性、遺傳效應(yīng)及其對(duì)下游基因的調(diào)控

我們?cè)趶V州自然短日、同期人工長(zhǎng)日以及自然長(zhǎng)日下種植了4種純合型植株ggdd、ggDD、GGdd和GGDD。觀察材料的抽穗期，計(jì)算基因的凈遺傳效應(yīng)和感光指數(shù)。

我們對(duì)比分析了Ghd7和DTH8單基因以及組合對(duì)抽穗的效應(yīng)。在自然長(zhǎng)日、人工長(zhǎng)日和自然短日3種日長(zhǎng)下，ggDD型植株分別比ggdd型晚抽穗6、5和6 d，表明DTH8有較弱的抑制抽穗的作用。GGdd型植株比ggdd型抽穗晚，Ghd7在3種日長(zhǎng)條件下分別抑制抽穗17、10和13 d。GGDD型植株在各種日長(zhǎng)條件下抽穗均為最晚，比ggdd型分別晚 31、24 和 29 d (圖3、圖4)。我們通過(guò)計(jì)算凈遺傳效應(yīng)(e)來(lái)分析Ghd7與DTH8組合對(duì)抽穗期的影響，結(jié)果表明，Ghd7和DTH8組合抑制抽穗的作用，在扣除了Ghd7和DTH8單基因的效應(yīng)后，還有8～10 d；這說(shuō)明二者組合后的效應(yīng)不是簡(jiǎn)單的加性關(guān)系。DTH8對(duì)抽穗的影響較小，和Ghd7組合在一起后二者產(chǎn)生了更高階的互作，表現(xiàn)出更強(qiáng)的抑制作用(表4)。感光指數(shù)用來(lái)衡量和比較材料的抽穗期對(duì)日長(zhǎng)的敏感程度，數(shù)值越大，感光性越強(qiáng)[10]。4種基因型材料ggdd、ggDD、GGdd和GGDD，在同一生長(zhǎng)季節(jié)人工長(zhǎng)日和自然短日的抽穗期，測(cè)得的感光指數(shù)(mPSIb)分別是0.08、0.06、0.03和0；在不同生長(zhǎng)季節(jié)自然長(zhǎng)日和自然短日的抽穗期，測(cè)得的感光指數(shù)(mPSIc)分別是0.19、0.17、0.20和0.15。由于本研究中材料在自然短日和人工長(zhǎng)日下的抽穗期是在同一生長(zhǎng)階段觀察到的，同一生長(zhǎng)季節(jié)感光指數(shù)更準(zhǔn)確。結(jié)果表明在hd1/prr37背景中，單基因Ghd7、DTH8以及二者組合株系的感光性弱。

圖3 4種純合型株系在自然長(zhǎng)日(a)和自然短日(b)下的表型Fig. 3 Phenotypes of four isogenic lines under natural long day (a) and natural short day (b) conditions

圖4 4種純合型株系在不同日長(zhǎng)條件下的抽穗期Fig. 4 Heading dates of four isogenic lines under different day-length conditions

表4 不同日長(zhǎng)條件下Ghd7、DTH8對(duì)抽穗的凈遺傳效應(yīng)(e)1)Table 4 Net genetic effect (e) on heading date of Ghd7 and DTH8 under different day-length conditions

為了研究Ghd7和DTH8不同組合對(duì)下游基因的調(diào)控，我們利用qRT-PCR檢測(cè)4種純合基因型材料的葉片(自然短日和人工長(zhǎng)日下，苗齡60 d，早上8:00取樣)中Ehd1、Hd3a、RFT1的表達(dá)。我們結(jié)合遺傳效應(yīng)來(lái)分析表達(dá)數(shù)據(jù)，GGDD型植株比ggDD型抽穗晚，Ghd7在長(zhǎng)、短日都下調(diào)Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá)，抑制抽穗；Ghd7和DTH8的組合在長(zhǎng)、短日下更明顯地抑制Ehd1、Hd3a和RFT1的表達(dá)，對(duì)抽穗的抑制作用更強(qiáng)；DTH8在長(zhǎng)、短日下微弱抑制抽穗，但對(duì)下游基因的調(diào)控卻沒(méi)有表現(xiàn)出相應(yīng)的規(guī)律 (圖5a～5f)。

圖5 4 種純合型株系人工長(zhǎng)日 (a～c)、自然短日 (d～f)下Ehd1、Hd3a和 RFT1的表達(dá)Fig. 5 Expression of Ehd1,Hd3a and RFT1 in the four isogenic lines under artificial long day (a-c) and natural short day(d-f) conditions

2.3 Ghd7和 DTH8 4 種基因型組合材料的農(nóng)藝性狀

已有的研究表明Ghd7和DTH8是多效性基因，調(diào)控抽穗期、分蘗數(shù)、千粒質(zhì)量等[14,16]。我們系統(tǒng)考察了自然短日和自然長(zhǎng)日下Ghd7與DTH8的4種組合材料的農(nóng)藝性狀，包括株高、穗長(zhǎng)、一級(jí)枝梗數(shù)、二級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)，千粒質(zhì)量和分蘗數(shù)。以ggdd基因型為參照，對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行單因素方差分析；總體上，無(wú)論日長(zhǎng)如何，Ghd7、DTH8以及雙基因組合都能不同程度地促進(jìn)株高、穗長(zhǎng)、一級(jí)枝梗數(shù)、二級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)和千粒質(zhì)量，但對(duì)分蘗數(shù)沒(méi)有顯著影響(表5)。

表5 4種純合型株系自然長(zhǎng)日、自然短日下的農(nóng)藝性狀1)Table 5 Agronomic traits of four isogenic lines under natural long day and natural short day conditions

以ggdd為參照，我們計(jì)算了Ghd7、DTH8及組合對(duì)農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度(圖6a、6b)。ggDD材料相比ggdd，在自然長(zhǎng)日下，DTH8對(duì)二級(jí)枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度分別為59.11%和40.93%；在自然短日下，DTH8對(duì)二級(jí)枝梗數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度為24.61%。雖然DTH8對(duì)抽穗的作用較弱，但其單基因長(zhǎng)、短日下均能顯著地促進(jìn)二級(jí)枝梗數(shù)。GGdd材料相比ggdd，在自然長(zhǎng)日下，Ghd7對(duì)二級(jí)枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度分別為84.19%和63.98%；在自然短日下，Ghd7對(duì)主穗粒數(shù)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，貢獻(xiàn)度為21.56%。DTH8和Ghd7單基因?qū)r(nóng)藝性狀的作用在長(zhǎng)日下明顯高于短日下。在長(zhǎng)、短日下，Ghd7和DTH8組合對(duì)抽穗期的調(diào)控存在更高階的互作，對(duì)株高、一級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)也有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有重要的應(yīng)用價(jià)值。

圖6 自然長(zhǎng)日 (a)和自然短日 (b)下 Ghd7、DTH8及組合對(duì)抽穗期和農(nóng)藝性狀的貢獻(xiàn)度Fig. 6 Contribution degree of Ghd7,DTH8 and their combination on heading date and agronomic traits under natural long day (a) and natural short day(b) conditions

3 討論與結(jié)論

本研究培育了hd1/prr37背景下Ghd7、DTH8雙基因分離的群體，深入揭示了無(wú)論日長(zhǎng)如何Ghd7和DTH8單基因均能抑制抽穗，Ghd7抑制抽穗更強(qiáng)。Ghd7和DTH8之間存在遺傳互作，二者更顯著抑制Ehd1-Hd3a/RFT1通路，延遲抽穗。二者的關(guān)系在Hd1/OsPRR37背景下同樣如此[10,27-28]，表明它們的互作非常穩(wěn)定，不受遺傳背景和日長(zhǎng)的影響。酵母雙雜交以及pull-down驗(yàn)證了Ghd7和DTH8存在分子互作，通過(guò)BiFC證明了互作發(fā)生在細(xì)胞核[29]。研究還發(fā)現(xiàn)，DTH8可以與NF-YC2形成異源二聚體，3個(gè)CCT亞家族的Ghd7、PRR37、Hd1分別可以與DTH8/OsNF-YC2形成三元復(fù)合物，進(jìn)而能夠結(jié)合特定的DNA序列[30]。因此，在充分的遺傳研究的基礎(chǔ)上，可以更為深入地研究Ghd7/DTH8復(fù)合體作用的分子機(jī)制，包括復(fù)合物的其他組分，如直接結(jié)合的DNA序列和調(diào)控的下游基因等。

在一定范圍內(nèi)，水稻抽穗期和產(chǎn)量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，抽穗期越長(zhǎng)，積累的生物量越多，產(chǎn)量越高[21,31]。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)DTH8單基因微弱抑制抽穗，卻能顯著增加二級(jí)枝梗數(shù)和主穗粒數(shù)。在長(zhǎng)、短日下Ghd7和DTH8的組合使抽穗期延長(zhǎng)，能最大限度地利用光熱資源，積累和轉(zhuǎn)運(yùn)更多的光合產(chǎn)物，明顯增加水稻株高、一級(jí)枝梗數(shù)、主穗粒數(shù)等農(nóng)藝性狀。盡管長(zhǎng)日下Ghd7和DTH8雙基因純合抽穗期較長(zhǎng)，但對(duì)雜交稻來(lái)說(shuō)，雙基因?yàn)殡s合狀態(tài)，抽穗相對(duì)純合型早一些，并且利用了二者對(duì)農(nóng)藝性狀的協(xié)同促進(jìn)作用，因此具有重要的應(yīng)用價(jià)值。這同時(shí)表明抽穗期基因以及不同組合調(diào)控了水稻整體的生長(zhǎng)發(fā)育，但它們是直接在穗部發(fā)揮作用，還是通過(guò)調(diào)控成花素間接調(diào)控農(nóng)藝性狀及產(chǎn)量，相關(guān)的機(jī)制值得深入研究。