陳 林，趙偉杰，張楓琳，楊曉華，朱曉彤，王麗娜，高 萍，束 剛，江青艷，王松波

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院/廣東省動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510642)

肥胖是體內(nèi)脂肪過度沉積引起的一種代謝綜合征，已成為全球流行的公共健康問題[1]。在人類健康中，肥胖能使人體血脂異常，引發(fā)心血管疾病、癌癥和降低女性生育能力[2-4]。在動(dòng)物生產(chǎn)中，肥胖能降低動(dòng)物繁殖性能、泌乳能力和產(chǎn)仔數(shù)[5]。因此，調(diào)控機(jī)體脂肪沉積、減少肥胖，在動(dòng)物生產(chǎn)和人類健康中均具有重要意義。

共軛亞油酸 (Conjugated linoleic acid，CLA)是含有共軛雙鍵的亞油酸異構(gòu)體混合物。其中，順9，反11-共軛亞油酸(c9,t11-CLA)和反10，順12-共軛亞油酸(t10,c12-CLA)為發(fā)揮生理功能的主要異構(gòu)體。CLA具有減肥[6]、降脂[7]和防治糖尿病[8]等生理作用。目前研究發(fā)現(xiàn)CLA的減脂分子機(jī)制主要有：抑制成脂分化；誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；CLA與過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferatoractivated receptor，PPAR)相互作用；增加呼吸鏈解偶聯(lián)蛋白-1 (Uncoupling protein 1,UCP-1)和肉堿-棕櫚油轉(zhuǎn)移酶-1 (Carnitine palmitoyltrans-ferase 1,CPT-1)的表達(dá)，促進(jìn)脂肪降解[9-10]。脂肪代謝過程受多種因素影響，因此CLA對(duì)脂肪沉積的調(diào)節(jié)機(jī)制仍值得探究。

脂肪組織是機(jī)體的能量調(diào)節(jié)器。當(dāng)機(jī)體能量過剩時(shí)，多余的能量以中性甘油三酯的形式儲(chǔ)存在脂肪組織中，進(jìn)而使機(jī)體肥胖[11]，因此，能量代謝是調(diào)節(jié)肥胖的重要因素。腸道微生物作為日糧與機(jī)體健康之間的橋梁，與機(jī)體的脂肪含量、能量代謝和免疫功能等密切相關(guān)[12-13]。已有研究報(bào)道，肥胖小鼠體內(nèi)雙歧桿菌Bifidobacterium豐度降低[14]；給無(wú)菌小鼠移植從肥胖人體分離出來(lái)的腸道微生物會(huì)導(dǎo)致無(wú)菌小鼠肥胖[15]。綜上所述，能量代謝和腸道微生物均會(huì)影響機(jī)體脂肪沉積，而目前關(guān)于CLA對(duì)能量代謝和腸道微生物的影響知之甚少。

本研究通過普通日糧中添加不同CLA異構(gòu)體飼喂小鼠一段時(shí)間后，對(duì)小鼠進(jìn)行能量代謝檢測(cè)和腸道微生物分析，探討日糧添加不同CLA異構(gòu)體對(duì)小鼠脂肪含量、能量代謝和腸道微生物的影響。研究結(jié)果可望完善共軛亞油酸減少脂肪沉積的機(jī)制，對(duì)于生產(chǎn)中降低脂肪過量沉積，提高生產(chǎn)效益，以及臨床上肥胖癥、糖尿病等代謝紊亂相關(guān)疾病的治療，均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和樣品采集

選取24只健康狀況良好的8周齡C57BL/6J雄性小鼠。預(yù)飼1周后按體質(zhì)量平均且隨機(jī)地分為 3 組，即對(duì)照組 (CK)、c9,t11-CLA 組和 t10,c12-CLA組，分別飼喂普通日糧、普通日糧添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 2% 的 c9,t11-CLA 或 t10,c12-CLA，飼料配方見表1。c9,t11-CLA(w≥ 44%)和 t10,c12-CLA(w≥ 44%)均購(gòu)自武漢祥和化工有限公司。每組8個(gè)重復(fù)，單籠飼養(yǎng)。每周測(cè)量體質(zhì)量和采食量，持續(xù)12周，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采集小鼠血液，分離不同部位組織并稱質(zhì)量，收集盲腸內(nèi)容物，并于-80 ℃保存。

表1 飼料組成和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1)Table 1 Feed composition and content w/(g·kg-1)

1.2 試驗(yàn)材料和儀器

小鼠購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物中心(廣東佛山)；MesoQMP23-060H型小動(dòng)物體組成分析及成像NMR儀器(上海紐邁公司)；CLAMS小動(dòng)物新陳代謝系統(tǒng) (美國(guó) Sable Systems International公司)。

1.3 指標(biāo)檢測(cè)與方法

1.3.1 小鼠體成像及體組成檢測(cè) 小鼠飼喂第11周時(shí)，進(jìn)行體成像和體組成檢測(cè)。打開小動(dòng)物體組成分析及體成像NMR儀，放入標(biāo)品自檢并預(yù)熱30 min。

體組成檢測(cè)：刺激小鼠排糞排尿后稱質(zhì)量，再將小鼠放入機(jī)器中，輸入小鼠體質(zhì)量后進(jìn)行小鼠體內(nèi)脂肪、肌肉和水分的檢測(cè)分析。

體成像檢測(cè)：根據(jù)體組成的分析結(jié)果，每組選取2只代表性小鼠，給小鼠腹腔注射100～200 μL(根據(jù)體質(zhì)量適當(dāng)增減)的50 g/mL水合氯醛溶液，待小鼠昏迷且不再動(dòng)彈后，將小鼠放入機(jī)器中，進(jìn)行小鼠體成像記錄。

1.3.2 小鼠能量代謝檢測(cè) 小鼠飼喂第11周時(shí)，稱取小鼠體質(zhì)量后，將小鼠放入代謝籠中，適應(yīng)24 h后，打開機(jī)器記錄小鼠的耗氧量、產(chǎn)熱量、二氧化碳產(chǎn)出量和呼吸交換率 (Respiratory exchange rate,RER)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.3.3 小鼠腸道微生物的測(cè)序及分析 用無(wú)菌管收集3組小鼠盲腸內(nèi)容物，并于-80 ℃保存，隨后送至北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行小鼠盲腸內(nèi)容物中腸道微生物的16S rRNA測(cè)序分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

文中數(shù)據(jù)結(jié)果均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示，不同組間的比較用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)分析均用Sigmaplot 14.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響

在試驗(yàn)12周后，統(tǒng)計(jì)小鼠體質(zhì)量和周平均采食量，結(jié)果(表2)顯示：與對(duì)照組相比，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA組小鼠體質(zhì)量分別降低了22.79%和 25.04% (P＜0.05)，c9,t11-CLA 組和 t10,c12-CLA組小鼠周平均采食量也顯著降低。

表2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠生長(zhǎng)的影響1）Table 2 Effects of two conjugated linoleic acid isomers on growth of mice

2.2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠脂肪沉積的影響

體成像和體組成結(jié)果顯示，c9,t11-CLA組和t10,c12-CLA組小鼠脂肪含量分別降低了57.98%和 59.41% (P＜0.05) (圖1、圖2A)；采樣后小鼠不同脂肪質(zhì)量與體質(zhì)量的百分比統(tǒng)計(jì)也表明，c9,t11-CLA組和t10,c12-CLA組顯著降低小鼠褐色脂肪、皮下脂肪和附睪脂肪含量(圖2B)。以上結(jié)果說明，日糧添加CLA不同異構(gòu)體能顯著降低小鼠脂肪沉積。

圖1 小鼠體成像結(jié)果Fig. 1 Body imaging results of mice

圖2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠脂肪沉積的影響Fig. 2 Effect of two conjugated linoleic acid isomers on fat deposition in mice

2.3 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠能量代謝的影響

代謝籠結(jié)果顯示，c9,t11-CLA 組和 t10,c12-CLA組均顯著增加小鼠白天耗氧量(圖3A)和產(chǎn)熱量(圖3B)，以及有增加二氧化碳產(chǎn)出量的趨勢(shì)(圖3C)，其中，t10,c12-CLA 顯著降低夜間 RER(圖3D)。以上結(jié)果表明，日糧添加CLA不同異構(gòu)體能促進(jìn)小鼠能量代謝，其中t10,c12-CLA促進(jìn)供能物質(zhì)由碳水化合物轉(zhuǎn)向脂肪。

圖3 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠能量代謝的影響Fig. 3 Effects of two conjugated linoleic acid isomers on energy metabolism in mice

2.4 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腸道微生物的影響

腸道微生物16S rRNA生物信息分析中，PCA結(jié)果顯示，對(duì)照組和2種CLA異構(gòu)體組小鼠的腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異(圖4)。功能相對(duì)豐度聚類分析結(jié)果表明，c9,t11-CLA 和 t10,c12-CLA均能促進(jìn)與新陳代謝相關(guān)的菌群豐度，且t10,c12-CLA能促進(jìn)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的菌群豐度(圖5)。

圖4 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腸道微生物主成分的影響Fig. 4 Effects of two conjugated linoleic acid isomers on the principal components of gut microflora in mice

圖5 聚類分析2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠功能性腸道微生物相對(duì)豐度的影響Fig. 5 Cluster analysis of the effects of two conjugated linoleic acid isomers on the relative abundance of functional intestinal microorganisms in mice

從Lefse分析可知，c9,t11-CLA可上調(diào)小鼠放線菌門Actinobacteria以及目、科、屬3個(gè)水平的雙歧桿菌 (Bifidobacteriales、 Bifidobacteiaceae、Bifidobacterium)豐度。此外，c9,t11-CLA可上調(diào)擬桿菌門的Bacteroidates、Bacteroidia、 Bacteroidales 和 Muribaculaceae豐度，下調(diào)疣微菌門的Verrucomicrobia、Akkermansia以及厚壁菌門的Ileibacterium豐度(圖6A)。

圖6 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠腸道微生物（LDA）的影響Fig. 6 Effects of two conjugated linoleic acid isomers on gut microflora(LDA score) in mice

t10,c12-CLA可上調(diào)擬桿菌門的Lachnospiraceae bacteriumA2和放線菌門Actinobacteria豐度，下調(diào)門、綱、目3個(gè)水平的擬桿菌(Bacteroidates、 Bacteroidia、 Bacteroidales)和疣微菌 (Verrucomicrobia、Verrucomicrobiae、 Verrucomicrobialea)豐度(圖6B)。

3 討論與結(jié)論

3.1 2種共軛亞油酸異構(gòu)體對(duì)小鼠脂肪沉積的影響

脂肪過度沉積引起肥胖，在人類健康和畜禽生產(chǎn)中均會(huì)產(chǎn)生不良影響。共軛亞油酸(CLA)作為功能性脂肪酸，已有多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)其可在機(jī)體代謝中發(fā)揮功能性的調(diào)控作用，如抗癌、抗高血壓和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等[16]。本研究在普通日糧中分別添加 c9,t11-CLA 和 t10,c12-CLA 飼喂小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種CLA均能顯著降低小鼠體質(zhì)量和脂肪含量。目前也有多項(xiàng)研究表明CLA具有減脂作用。例如，給肥胖(db/db)小鼠灌胃CLA一段時(shí)間后，可顯著降低小鼠體質(zhì)量和采食量[17]；在給小鼠飼喂共軛亞油酸不同異構(gòu)體研究中也發(fā)現(xiàn)，t10,c12-CLA能降低小鼠白色脂肪含量[18]，c9,t11-CLA能降低倉(cāng)鼠脂肪沉積[19]，這與我們的研究結(jié)果一致，即2種CLA異構(gòu)體均能降低小鼠脂肪沉積。

3.2 2種共軛亞油酸異構(gòu)體降低小鼠脂肪沉積與能量代謝有關(guān)

大量研究表明共軛亞油酸具有降低機(jī)體脂肪沉積的作用，但其降脂的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍值得探究。能量代謝可促進(jìn)脂質(zhì)代謝，減少脂肪含量，因此，我們進(jìn)行了小鼠代謝籠試驗(yàn)，監(jiān)測(cè)小鼠的新陳代謝。結(jié)果顯示，c9,t11-CLA 和 t10,c12-CLA 均顯著增加小鼠的耗氧量和產(chǎn)熱量。耗氧和產(chǎn)熱均能促進(jìn)脂肪代謝，因此，2種CLA異構(gòu)體可能通過促進(jìn)小鼠產(chǎn)熱降低小鼠體質(zhì)量。此前的研究也發(fā)現(xiàn)，日糧中添加CLA能促進(jìn)小鼠褐色脂肪和白色脂肪中解偶聯(lián)蛋白-2(UCP-2)的mRNA和蛋白表達(dá)，而UCP-2能增加能量消耗，與脂肪代謝和能量調(diào)控密切相關(guān)[20-21]。也有研究發(fā)現(xiàn)日糧中添加CLA能顯著增加小鼠白色脂肪中CPT-1和UCP-1的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)脂肪代謝[22-23]。其中，t10,c12-CLA顯著降低RER值(當(dāng)RER值為0.7時(shí)，機(jī)體的供能全部來(lái)源于脂肪；RER值為1時(shí)，機(jī)體的供能全部來(lái)源于葡萄糖)，表明t10,c12-CLA能顯著促進(jìn)機(jī)體對(duì)脂肪的消耗，而c9,t11-CLA對(duì)RER無(wú)顯著影響。Park等[24]的研究也表明，與富含c9,t11-CLA的飲食相比，攝入富含t10,c12-CLA的飲食可以顯著降低體內(nèi)脂肪含量。綜上所述，2種CLA異構(gòu)體均能促進(jìn)小鼠能量代謝，因此共軛亞油酸減脂作用可能與能量代謝有關(guān)。

3.3 2種共軛亞油酸異構(gòu)體降低小鼠脂肪沉積與腸道微生物有關(guān)

由上文可知，日糧添加 c9,t11-CLA 和 t10,c12-CLA可能通過促進(jìn)能量代謝，降低小鼠體質(zhì)量。大量文獻(xiàn)報(bào)道，腸道微生物是機(jī)體重要的微生態(tài)系統(tǒng)，能參與調(diào)控機(jī)體多項(xiàng)代謝過程。因此，我們對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物進(jìn)行了微生物分析。結(jié)果顯示，c9,t11-CLA和t10,c12-CLA均能改變小鼠的腸道微生物結(jié)構(gòu)，促進(jìn)與新陳代謝相關(guān)的菌群豐度，且t10,c12-CLA能促進(jìn)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的菌群豐度；c9,t11-CLA可上調(diào)小鼠放線菌門Actinobacteria以及目、科、屬3個(gè)水平的雙歧桿菌(Bifidobacteriales、Bifidobacteiaceae、Bifidobacterium)豐度。有研究發(fā)現(xiàn)，Actinobacteria和雙歧桿菌能促進(jìn)機(jī)體能量代謝和降低脂肪含量[25-27]。此外，c9,t11-CLA可下調(diào)疣微菌門的Verrucomicrobia、 Akkermansia以及厚壁菌門的Ileibacterium豐度。值得注意的是，有研究表明在高脂和肥胖模型中，Akkermansia和Ileibacterium豐度均與脂肪沉積呈負(fù)相關(guān)[28-30]，這與我們的結(jié)果不一致，可能是由于模型不同導(dǎo)致的。

t10,c12-CLA也可上調(diào)放線菌門Actinobacteria豐度，下調(diào)門、綱、目3個(gè)水平的擬桿菌(Bacteroidates、Bacteroidia、 Bacteroidales)和疣微菌 (Verrucomicrobia、Verrucomicrobiae、 Verrucomicrobialea)豐度。值得注意的是，2種單體均能上調(diào)厚壁菌豐度，降低擬桿菌豐度，使厚壁菌與擬桿菌比值增加(腸內(nèi)厚壁菌多于擬桿菌，能更有效吸收食物中的熱量從而導(dǎo)致肥胖)[31]。由上可知，CLA能上調(diào)促進(jìn)脂質(zhì)代謝的腸道微生物豐度，改變菌群結(jié)構(gòu)。因此，2種CLA異構(gòu)體減少脂肪沉積可能與改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。

腸道微生物和能量代謝密切相關(guān)。腸道微生物分析結(jié)果表明，c9,t11-CLA 和 t10,c12-CLA 均能顯著上調(diào)與新陳代謝相關(guān)的菌群豐度。Lee等[32]表明腸道微生物能改變機(jī)體能量代謝。c9,t11-CLA和t10,c12-CLA均顯著上調(diào)放線菌門菌群豐度，也有研究發(fā)現(xiàn)放線菌能促進(jìn)機(jī)體能量代謝[25]。因此，2種CLA異構(gòu)體提高能量代謝可能與改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。

綜上所述，日糧添加 c9,t11-CLA 或 t10,c12-CLA，可顯著降低小鼠脂肪沉積，而這可能與CLA促進(jìn)機(jī)體能量代謝和改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)有關(guān)。