劉苡含，牟青山，陳珊宇，阮關(guān)海，胡 晉，關(guān)亞靜，*

(1.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058； 2.海南浙江大學(xué)研究院，海南 三亞 572025； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021)

向日葵(L.)屬菊科向日葵屬，一年或多年生，是僅次于大豆、低芥酸菜籽和花生的世界第四大油料作物，目前在世界各地廣泛種植。同時(shí)，它還是一種重要的觀賞性植物，其花穗、種子皮殼和莖稈可作為飼料或工業(yè)原料，花穗亦可供藥用，種子可供食用。我國(guó)有豐富的向日葵種質(zhì)資源，主要種植區(qū)分布于東北、華北和西北的半干旱或輕鹽堿地區(qū)。近幾年，向日葵作為“美好作物”被江浙一帶引進(jìn)，在美麗鄉(xiāng)村建設(shè)中發(fā)揮重要作用。但隨著我國(guó)新審定和從國(guó)外引進(jìn)的向日葵品種越來(lái)越多，市場(chǎng)上品種混雜、假冒偽劣種子頻現(xiàn)和品種侵權(quán)的現(xiàn)象屢見不鮮，且很多品種間存在性狀相似、命名混亂的狀況。因此，為有效區(qū)分不同品種與真?zhèn)畏N子，有必要對(duì)向日葵品種進(jìn)行遺傳多樣性分析并開展DNA指紋圖譜構(gòu)建工作。

種質(zhì)鑒定的方法有很多，傳統(tǒng)的鑒定方法一般采用田間種植鑒定，占地面積大、費(fèi)時(shí)費(fèi)工、受種植地光溫條件限制，而且向日葵的表型性狀復(fù)雜，田間表型性狀鑒定品種難以在短時(shí)間內(nèi)完成。DNA指紋圖譜鑒定技術(shù)是目前較為先進(jìn)的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，它能直接從DNA水平上反映生物個(gè)體之間的差異，具有簡(jiǎn)單穩(wěn)定、變異性高、位點(diǎn)豐富、專一性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)標(biāo)記因具有共顯性、多態(tài)性豐富、穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)單可靠等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于水稻、花生、玉米、棉花、小麥、甘蔗等作物的品種真實(shí)性檢測(cè)、遺傳多樣性分析和DNA指紋圖譜構(gòu)建中。目前，SSR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要采用聚丙烯酰胺-銀染法，雖然此方法靈敏度和分辨率高、操作簡(jiǎn)單，但難以讀取擴(kuò)增片段大小，且在分析的材料和位點(diǎn)較多、片段差異較小時(shí)，數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性會(huì)降低。高分辨率熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting curve analysis，HRM)依靠核酸分子片段大小、GC含量等物理性質(zhì)能夠準(zhǔn)確有效地區(qū)分SSR位點(diǎn)與不同基因型，識(shí)別產(chǎn)物片段中極小的堿基差異，是一種分辨率高且成本相對(duì)較低的DNA檢測(cè)技術(shù)。本研究將SSR分子標(biāo)記和HRM技術(shù)相結(jié)合，對(duì)向日葵的基因型進(jìn)行快速鑒定，并使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic averaging，UPGMA)對(duì)SSR-HRM原始數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析計(jì)算，依據(jù)分析結(jié)果構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為建立浙江省向日葵主栽品種的真實(shí)性和純度鑒定體系，以及向日葵育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的32份向日葵種質(zhì)資源搜集于浙江省各縣市，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。種質(zhì)編號(hào)、名稱、類型、特性與來(lái)源信息見表1。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與純化

從每個(gè)向日葵樣品中隨機(jī)取10顆種子播種，在合適的光溫條件下土培至長(zhǎng)出真葉，時(shí)間約2周。取真葉約0.5 g，液氮環(huán)境下使用組織磨樣機(jī)研磨。采用CTAB法提取樣品中總DNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用NanoDrop1000分光光度計(jì)檢測(cè)所提取DNA的純度和濃度，原液置于-20 ℃保存，工作液DNA調(diào)整終濃度為100 ng·μL，作為模板用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 SSR引物

查閱已公開發(fā)表文獻(xiàn)中引物的多態(tài)性和擴(kuò)增情況，結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列，設(shè)計(jì)并合成了95對(duì)候選SSR引物。

1.2.3 SSR-HRM引物篩選

根據(jù)材料特性和來(lái)源隨機(jī)抽取5份向日葵DNA材料(編號(hào)分別為2、7、15、24、31)進(jìn)行引物篩選。PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×PCRMasterMix (Vazyme)，2 μL模板DNA，上、下游引物(10 μmol·L)各1 μL，6 μLddHO；反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存；采用6%聚丙烯酰胺凝膠電泳，設(shè)置電壓為200 V，電流為160 mA，電泳2 h左右，經(jīng)快速銀染顯影后讀取條帶。選取條帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的引物用于SSR-HRM分析與DNA指紋圖譜構(gòu)建。

1.2.4 SSR-HRM的反應(yīng)體系和程序

SSR-HRM采用Touchdown快速PCR程序連同高分辨率熔解曲線的分析方法，以提取的32份向日葵DNA為模板，利用篩選出的17對(duì)核心SSR標(biāo)記引物，在Light Cycler 480Ⅱ型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增與熔解曲線分析。PCR反應(yīng)選用LightCycler480HighResolution Melting Master Mix，體系為20 μL：Mix10μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各0.4 μL(10 μmol·L)，dd HO 7.2 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃(20 s)，62～50 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，55個(gè)循環(huán)，退火溫度從第一個(gè)循環(huán)62 ℃開始遞減，每個(gè)循環(huán)減1 ℃直到50 ℃不再變化；HRM程序?yàn)椋?5 ℃變性60 s，立刻冷卻至40 ℃保持60 s，接著從65 ℃開始以0.02 ℃·s的速度升至97 ℃。每板跑32個(gè)DNA樣品，用1對(duì)引物，每個(gè)樣品3次生物學(xué)重復(fù)。

表1 三十二份向日葵種質(zhì)資源信息

1.2.5 SSR-HRM數(shù)據(jù)分析

待反應(yīng)程序結(jié)束，使用LightCycler96(Version 1.1.0.1320 Roche Applied Science，Mannheim，Germany)分析原始數(shù)據(jù)，分析時(shí)將delta Tm discrimination和curve shape sensitivity參數(shù)分別調(diào)至50%，得到每對(duì)引物反應(yīng)下32份向日葵材料的基因分型結(jié)果并記錄，重復(fù)性差的樣品記為“0”。

1.2.6 向日葵親緣關(guān)系分析

分析17對(duì)SSR引物對(duì)應(yīng)的高分辨率熔解曲線，得出基因分型結(jié)果，然后導(dǎo)入NT-SYS 2.10e軟件，采用非加權(quán)組平均法分析所有樣品的親緣關(guān)系，構(gòu)建聚類樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選結(jié)果

大部分引物均能擴(kuò)增出清晰整齊、多態(tài)性高的條帶，僅8對(duì)引物無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物。根據(jù)引物篩選結(jié)果，選用條帶清晰、多態(tài)性穩(wěn)定的17對(duì)引物用于32份材料的SSR-HRM分析與DNA指紋圖譜構(gòu)建。篩選出的17對(duì)核心引物的擴(kuò)增結(jié)果見圖1，引物信息見表2。

2.2 基于SSR-HRM的遺傳關(guān)系分析

32份向日葵種質(zhì)的高分辨率熔解曲線分析結(jié)果表明，標(biāo)記ORS543、ORS665、ORS229和ORS1114的多態(tài)性較好。以標(biāo)記ORS665的SSR-HRM分析結(jié)果為例，32份向日葵樣品的高分辨率熔解曲線均有差異，根據(jù)熔點(diǎn)等的不同，樣品被分成7個(gè)基因型組別，每組的高分辨率熔解曲線在形狀上明顯不同(圖2-A)；結(jié)合差異圖(圖2-C)得到32份向日葵樣品的基因分型結(jié)果(圖3)。7組的代表品種分別是YK18-10、YK18-13、龍賞葵5號(hào)、YK18-9、S117、S116和S144，將它們的熔解曲線和差異圖單獨(dú)列出，可以更加清晰地觀察到各基因型組別間的差異(圖2-B和圖2-D)。其余16對(duì)SSR標(biāo)記的分析結(jié)果與標(biāo)記ORS665類似，且均可有效區(qū)分供試的32份向日葵品種。根據(jù)17對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)32份向日葵樣品的基因分型結(jié)果，構(gòu)建了DNA數(shù)字指紋圖譜(表3)。

2.3 基于SSR-HRM的聚類分析結(jié)果

M，DNA 2000 marker；ORS543、ORS456等為引物名稱；圖片中品種從左至右依次為油葵T777、YK18-11、龍賞葵5號(hào)、觀賞S8、S117。M， DNA 2000 marker; ORS543， ORS456， etc. were the name of primers. The order from left to right represented oil sunflower T777， YK18-11， Longshangkui No.5， Ornamental sunflower S8 and S117.圖1 核心引物篩選結(jié)果Fig.1 Screening result of core primers

表2 十七對(duì)SSR引物信息

A，32份向日葵種質(zhì)資源的差異圖，顏色相同的線為同一基因型組；B，7個(gè)基因型分組中各代表品種的差異圖；C，32份向日葵種質(zhì)資源標(biāo)準(zhǔn)化高分辨率熔解曲線圖；D，7個(gè)基因型分組中各代表品種的標(biāo)準(zhǔn)化高分辨率熔解曲線圖。A， Difference plots of 32 sunflower germplasm resources， and the same line color indicates the same genotype calculated by HRM analysis; B， Difference plots of the seven distinguished sunflower germplasm resources; C， Normalized HRM melting curve of 32 sunflower germplasm resources; D， Normalized HRM melting curve of the seven distinguished sunflower germplasm resources.圖2 ORS665分子標(biāo)記對(duì)32份向日葵種質(zhì)資源的SSR-HRM分析結(jié)果Fig.2 SSR-HRM analysis of 32 sunflower germplasm resources with the SSR marker ORS665

圖3 ORS665對(duì)32份向日葵樣品的基因分型結(jié)果Fig.3 Genotype group of 32 sunflower germplasm resources with SSR marker ORS665

采用UPGMA法對(duì)SSR-HRM分型結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，17對(duì)引物可有效區(qū)分32份向日葵材料(圖4)，32份向日葵樣品在遺傳相似系數(shù)為0.20處被分為兩大類群，分別記為A、B。其中，來(lái)自美國(guó)的觀賞型紫色向日葵(Purple sunflower)獨(dú)立組成B類群，它與A類群中同為觀賞型的紅暈向日葵(Red sunflower)和多頭向日葵(Multipoint sunflower)親緣關(guān)系最近，與來(lái)自河北的油用型品種油葵M985(Oil sunflower M985)親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。A類群分為多個(gè)亞類群，同一類型或相同地理來(lái)源的向日葵材料多聚類在一簇；不同類型和地理來(lái)源的材料間聚類相對(duì)較分散。14種油用向日葵材料中，來(lái)自吉林、黑龍江的大部分材料親緣關(guān)系較為接近，說(shuō)明其在育種上很可能存在性狀相似、親本來(lái)源較為狹窄的問題；13種觀賞型向日葵材料間遺傳多樣性最高，其親緣關(guān)系與地理來(lái)源無(wú)明顯相關(guān)，說(shuō)明國(guó)內(nèi)外向日葵種質(zhì)資源間具有豐富的遺傳多樣性；5種食用型向日葵材料親緣關(guān)系與地理來(lái)源相關(guān)性一般，遺傳多樣性相對(duì)較高，但可能存在樣本量小、不具有代表性的問題。

表3 三十二份向日葵材料的數(shù)字化指紋圖譜

圖4 三十二份向日葵品種基于SSR標(biāo)記的聚類圖Fig.4 Dendrogram of 32 sunflower cultivars based on SSR analysis

3 結(jié)論與討論

我國(guó)存在向日葵傳統(tǒng)地方品種老化、種植良種混雜、育成品種稀缺等問題，亟需進(jìn)行種質(zhì)篩選鑒定與創(chuàng)制工作。一個(gè)準(zhǔn)確、快速、高效的分子鑒定技術(shù)對(duì)向日葵的品種鑒定具有重要意義。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷發(fā)展，DNA指紋圖譜在種質(zhì)鑒定中發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。SSR分子標(biāo)記是構(gòu)建DNA指紋圖譜的首要選擇，HRM技術(shù)在構(gòu)建遺傳指紋圖譜等領(lǐng)域的應(yīng)用也有較大的拓展。國(guó)內(nèi)外已有大量學(xué)者將SSR與HRM技術(shù)融合應(yīng)用于植物的品種鑒定。Pereira等將HRM技術(shù)應(yīng)用于橄欖油和葡萄酒的真實(shí)性鑒定。An等將自主開發(fā)的絲瓜基因組SSR分子標(biāo)記與高分辨率熔解曲線融合，成功應(yīng)用于絲瓜的基因型分析。殷豪等在西洋梨中的研究也證明，HRM技術(shù)是SSR標(biāo)記分型的有效手段。陳媞穎等應(yīng)用HRM技術(shù)對(duì)已知的7對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，為金銀花種質(zhì)鑒定做出貢獻(xiàn)。趙均良等驗(yàn)證了HRM技術(shù)應(yīng)用于水稻SSR、InDel和SNP標(biāo)記基因型分析的可行性和可靠性。

本文基于SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)32份向日葵種質(zhì)資源進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析和聚類分析。篩選出的17對(duì)可以有效區(qū)分32份向日葵樣品的SSR引物，且聚類結(jié)果與樣品的地域來(lái)源、表型特征、親緣關(guān)系基本一致，這說(shuō)明SSR-HRM技術(shù)在向日葵基因分型和種質(zhì)資源的鑒定中是可靠的。32份向日葵種質(zhì)資源中，同類型和同來(lái)源的材料間親緣關(guān)系較為接近，也有部分不同類型、不同來(lái)源的材料間遺傳相似系數(shù)較大，說(shuō)明它們之間沒有明顯界限，推測(cè)其親本來(lái)源可能較為狹窄，也間接說(shuō)明SSR分子標(biāo)記輔助向日葵育種是可行的。

在向日葵品種鑒定上，可以利用本研究篩選出的核心引物開展向日葵DNA指紋庫(kù)的深入研究，建立完整的向日葵品種真實(shí)性和純度鑒定體系。在向日葵核心種質(zhì)創(chuàng)制方面，可以輔助利用SSR-HRM技術(shù)，避免重復(fù)無(wú)效育種，多拓寬親本來(lái)源，多利用親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的野生種質(zhì)和國(guó)外種質(zhì)資源如紫色向日葵(觀賞，美國(guó))、富陽(yáng)酸橙(觀賞，日本)等，以提高向日葵育成品種的遺傳多樣性。