王航宇 楊文義 韓大正 魏書(shū)堂 武利萍 徐夢(mèng)陽(yáng) 閆春曉 譚莉霞 董 勇 楊國(guó)威 華 靜 杜瑩瑩

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)可逐步發(fā)展成肝硬化，甚至肝癌[1-2]。NASH發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，與肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)堆積、氧化應(yīng)激、線粒體損傷等多重因素有關(guān)[3]。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)微小RNA(microRNA，miRNA)參與NASH中胰島素抵抗、脂代謝紊亂和細(xì)胞凋亡等生物病理進(jìn)程[4]，同時(shí)外周血miR-223可有效反映慢性乙肝纖維化患者乙型肝炎病毒的感染情況和肝纖維化嚴(yán)重程度。FOS樣抗原2(FOS-like antigen 2，F(xiàn)osl2) 是FOS基因家族成員之一，參與腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等惡性行為。研究[5]顯示，下調(diào)Fosl2表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。中性粒細(xì)胞顆粒蛋白(neutrophilic granule protein，NGP)是一類(lèi)半胱氨酸蛋白酶抑制劑，廣泛存在于各種生命體中，可以調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)。本研究通過(guò)分析miR-223/Fosl2/NGP在NASH小鼠中表達(dá)水平，初步探討其影響NASH小鼠肝纖維化的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SPF級(jí)小鼠60只，4～8周齡，體質(zhì)量20～22 g，均購(gòu)于廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司，許可證號(hào)：SCXK(粵)2021-0057；在本院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中心于20℃～25℃溫度分籠飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由采食進(jìn)水，光照/黑暗周期為12 h/12 h。

1.2 儀器與試劑 熒光倒置顯微鏡購(gòu)自廣州市明美光電技術(shù)有限公司，Cytation 1細(xì)胞成像酶標(biāo)儀購(gòu)于北京安麥格貿(mào)易有限公司。電泳儀購(gòu)于武漢科昊佳生物科技有限公司；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)ZF-288購(gòu)于上海金鵬分析儀器有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀(IQTM5型)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；紫外分光光度計(jì)UV1810購(gòu)于東莞市譜標(biāo)實(shí)驗(yàn)器材科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于艾美捷科技有限公司；胎牛血清購(gòu)于愛(ài)必信(上海)生物科技有限公司；RNA提取試劑TRIzol及轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000均購(gòu)于武漢極捷生物科技有限公司；RIPA蛋白裂解液、油紅O染色試劑盒及二辛可寧酸(bicinchoninic acid assay，BCA)法蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；ECL發(fā)光液購(gòu)于北京伊塔生物科技有限公司；總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase，ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase，AST)酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購(gòu)于四川邁克生物科技股份有限公司；肝纖維化四項(xiàng)指標(biāo)試劑盒購(gòu)于上海心語(yǔ)生物科技有限公司； Fosl2、NGP抗體購(gòu)于Invitrogen公司。

1.3 小鼠模型建立及分組[6]60只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分成正常組、模型組(MCD組)、MCD+miR-NC組和MCD+miR-223 mimic組，每組15只。正常組給予普通飼料，其余3組給予蛋氨酸膽堿缺乏(methionine choline deficiency，MCD)飼料(南通特洛菲飼料科技有限公司)。連續(xù)飼養(yǎng)4周后，取模型組小鼠2只，觀察其肝組織病理，顯示出典型的脂肪性肝炎特征，則造模成功。小鼠建模成功后，MCD+miR-NC組經(jīng)尾靜脈注射120 nmol/kg miR-NC 100 μL，MCD+miR-223 mimic組經(jīng)尾靜脈注射120 nmol/kg miR-223 mimic 100 μL，連續(xù)5 d；正常組和MCD組小鼠通過(guò)尾靜脈注射相應(yīng)體積的無(wú)菌生理鹽水，連續(xù)5 d。繼續(xù)飼養(yǎng)3周。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)(倫理批準(zhǔn)號(hào)：JZLLSC2020-0150)。

1.4 血清及肝臟組織生化指標(biāo) 取小鼠外眼周血300～500 μL，離心取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清TC、TG、ALT和AST水平。

1.5 肝纖維化指標(biāo) 取小鼠血液300～500 μL，離心分離上清液。采用放射免疫分析法檢測(cè)肝纖維化指標(biāo)[透明質(zhì)酸(hyaluronic acids，HA)、層粘連蛋白(laminin，LN)、Ⅳ型膠原(collagentype Ⅳ，Ⅳ-C)]，操作過(guò)程嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測(cè)miR-223和Fosl2 mRNA水平 采用Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，采用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定RNA的濃度。按TaqManMicroRNA Reverse Transcription kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA并置于4℃保存，進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增，置于RT-qPCR儀中進(jìn)行測(cè)定，設(shè)置反應(yīng)條件：95℃，10 min預(yù)變性；95℃變性15 s，60℃ 退火45 s，65℃延伸1 min，4℃ 10 min擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。引物序列：miR-223上游5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3’，下游5’- TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGGGGTAT -3’；Fosl2上游5’-GAGAGGAACAAGCTGGCTGC-3’，下游5’-GCTTCTCCTTCTCCTTCTGC-3’； GAPDH上游5’-GATATTGTTGCCATCAATGAC-3’，下游5’-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-223和Fosl2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 小鼠肝臟組織病理學(xué)檢查 處死小鼠，取小鼠肝臟組織，10%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片，采用HE染色5 min，用二甲苯處理后封片，置于生物顯微鏡下觀察肝臟病理變化。

1.8 油紅O染色 處死小鼠后，取小鼠肝臟組織，進(jìn)行聚乙二醇和聚乙烯醇水溶性混合物(opti-mum cutting temperature compound，OCT)包埋切片，置于油紅溶液中染色30 min，37 ℃溫浴，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)清洗3次。蘇木素染色30～60 s，1%鹽酸酒精分化，1%氨水返藍(lán)。PBS清洗3次后，用濾紙吸干殘余水分，用甘油明膠封片，置于生物顯微鏡下觀察。

1.9 Western blot實(shí)驗(yàn) 取小鼠肝臟組織，剪碎，加入放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h；加入一抗(1∶5 000)，4℃孵育過(guò)夜；次日PBS洗滌3次，然后加入相應(yīng)二抗(1∶1 000)，室溫孵育1 h，PBS洗滌3次，發(fā)光液進(jìn)行顯色，選擇內(nèi)參GAPDH。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝組織miR-223和Fosl2 mRNA表達(dá)水平比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組

miR-223表達(dá)水平降低，F(xiàn)osl2表達(dá)水平升高(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組中miR-223表達(dá)水平升高，F(xiàn)osl2表達(dá)水平下降(P<0.05)；MCD組和MCD+miR-NC組中miR-223、Fosl2表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各小鼠肝組織中miR-223和Fosl2 mRNA表達(dá)比較

2.2 小鼠肝臟損傷指標(biāo)比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟組織出現(xiàn)中或重度肝細(xì)胞空泡化和明顯肝細(xì)胞肥大的脂肪性肝炎特征；與MCD組和MCD+ miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織肝細(xì)胞空泡化現(xiàn)象減少，肝細(xì)胞肥大程度降低，見(jiàn)圖1。與正常組相比，MCD組和MCD+ miR-NC組小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平上升(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平下降(P<0.05)。MCD組和MCD+ miR-NC組各指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

圖1 各組小鼠肝組織病理?yè)p傷觀察(HE染色)

表2 各組小鼠肝損傷指標(biāo)比較

2.3 小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟中出現(xiàn)大量的脂質(zhì)滴(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織中脂質(zhì)滴減少(P<0.05)；MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟脂質(zhì)滴差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較(油紅O染色)

表3 各組小鼠肝臟組織脂肪堆積情況比較

2.4 各組小鼠肝纖維化指標(biāo)比較 與正常組比較，MCD組和MCD+miR-NC組HA、LN和Ⅳ-C水平升高(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組HA、LN和Ⅳ-C水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表4。

2.5 各組小鼠肝臟組織中蛋白表達(dá)水平比較 與正常組相比，MCD組和MCD+miR-NC組小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平上升，NGP蛋白水平下降(P<0.05)；與MCD組和MCD+miR-NC組相比，MCD+miR-223 mimic組小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平下降，NGP蛋白水平上升(P<0.05)。MCD組和MCD+miR-NC組蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖3和表5。

表4 各組小鼠肝纖維化指標(biāo)比較

圖3 各組小鼠肝組織蛋白表達(dá)電泳圖

表5 各組小鼠肝組織蛋白表達(dá)情況比較

3 討論

NASH是由于脂肪在肝臟中沉積引起的一種代謝性肝損傷疾病，與過(guò)量飲酒、肥胖和肝炎病毒感染等多種因素誘導(dǎo)肝臟持續(xù)性炎癥反應(yīng)有關(guān)，以肝組織纖維化為主要病理特征[7-8]。進(jìn)展期肝纖維化和肝硬化是NASH主要的臨床終點(diǎn)，探討影響NASH纖維化的機(jī)制，對(duì)預(yù)防疾病發(fā)展進(jìn)程具有重要意義。

本研究采用RT-qPCR檢測(cè)小鼠肝臟組織中miR-223和Fosl2 mRNA表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在NASH小鼠肝臟組織中miR-223低表達(dá)，F(xiàn)osl2高表達(dá)。目前，miR-223在小鼠肝組織纖維化中的調(diào)控作用尚存在爭(zhēng)議。有研究[4]結(jié)果顯示，miR-223在長(zhǎng)期高脂飲食喂養(yǎng)的小鼠肝細(xì)胞中上調(diào)，且miR-223基因缺失可以促進(jìn)高脂飲食或MCD誘導(dǎo)的NASH以及長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠肝癌的進(jìn)展。但也有研究[9]認(rèn)為，miR-223低表達(dá)可以促進(jìn)肝纖維化，推進(jìn)疾病惡性進(jìn)展，甚至誘導(dǎo)肝癌發(fā)生。本研究中，miR-223在MCD模型小鼠肝臟組織中低表達(dá)，與文獻(xiàn)報(bào)道存在部分差異，推測(cè)與病情嚴(yán)重程度、發(fā)展進(jìn)程以及模型建立方法不同有關(guān)，表明miR-223表達(dá)與NASH發(fā)展可能有關(guān)。

此外，本研究通過(guò)Western Blot檢測(cè)小鼠肝臟組織中Fosl2和NGP蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，NASH小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平明顯上升，NGP蛋白水平下降；高表達(dá)miR-223后NASH小鼠肝臟組織中Fosl2蛋白水平下降，NGP蛋白水平上升。Fosl2屬于激活蛋白-1轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，參與脂肪代謝。有研究[10]顯示，F(xiàn)osl2表達(dá)受多種miRNAs調(diào)控，參與脂肪的代謝過(guò)程?；谇叭说难芯縖11]結(jié)果，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)miR-223和Fosl2在NASH中也可能存在類(lèi)似的靶向關(guān)系，影響脂代謝過(guò)程，進(jìn)而影響NASH發(fā)展進(jìn)程。但本研究并未深入研究?jī)烧唛g的靶向關(guān)系，存在一定局限性。

NASH的病理機(jī)制復(fù)雜，其與肝脂質(zhì)代謝紊亂、肝脂質(zhì)過(guò)氧化增加等因素相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，NASH小鼠肝臟組織出現(xiàn)中或重度肝細(xì)胞空泡化和明顯肝細(xì)胞肥大的脂肪性肝炎特征。上調(diào)miR-223表達(dá)后，小鼠肝細(xì)胞空泡化現(xiàn)象明顯減少，肝細(xì)胞肥大程度降低。同時(shí)，經(jīng)油紅O染色結(jié)果顯示，NASH小鼠肝臟表現(xiàn)出典型的脂肪性肝炎特征，出現(xiàn)大量脂質(zhì)滴，而高表達(dá)miR-223小鼠肝臟脂質(zhì)滴顯著減少，提示高表達(dá)miR-223可減輕NASH的發(fā)展進(jìn)程。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，NASH小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平上升；上調(diào)miR-223 表達(dá)后小鼠血清中TC、TG、ALT和AST水平下降。NASH的主要特征在于脂肪在肝細(xì)胞中以含有TG的脂滴形式積累，TG積累初期可保護(hù)機(jī)體免受脂毒性的損傷，但TG積聚到超過(guò)肝臟代謝能力時(shí)可引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步加劇肝損傷。ALT是參與人體蛋白質(zhì)新陳代謝的酶，廣泛存在于人體各組織、器官中，當(dāng)1%肝細(xì)胞破壞時(shí)，ALT會(huì)大量釋放入血，使血液中該酶活性顯著提高[12-13]。當(dāng)AST增高超過(guò)ALT時(shí)，提示病變的慢性化和進(jìn)展性。AST和ALT異常提示肝臟的炎癥反應(yīng)及損傷程度。上述結(jié)果提示，NASH脂質(zhì)代謝紊亂，可能是過(guò)度攝入脂肪使肝臟內(nèi)脂質(zhì)大量沉積，導(dǎo)致肝臟脂類(lèi)代謝能力減弱，進(jìn)而發(fā)生炎癥使肝細(xì)胞壞死甚至纖維化，上調(diào)miR-223表達(dá)在一定程度上改善了NASH小鼠臟臟脂類(lèi)代謝能力。NASH患者通常伴有肝細(xì)胞損傷，可導(dǎo)致進(jìn)展性肝纖維化，本研究通過(guò)檢測(cè)各組小鼠肝纖維化指標(biāo)評(píng)估m(xù)iR-223對(duì)肝纖維化的影響。結(jié)果顯示，NASH小鼠血清中HA、LN和Ⅳ-C水平高于正常小鼠，而高表達(dá)miR-223后，小鼠血清中HA、LN和Ⅳ-C水平降低，提示高表達(dá)miR-223可能改善NASH小鼠肝纖維化情況。本研究結(jié)果提示，高表達(dá)miR-223可能通過(guò)調(diào)控Fosl2/NGP通路影響NASH進(jìn)程。

綜上所述，本研究初步分析高表達(dá)miR-223改善NASH小鼠模型脂質(zhì)代謝、降低肝纖維化指標(biāo)水平、改善肝臟損傷，可能與Fosl2/NGP通路有關(guān)。