涂蘭蘭，許璟珅，陳潤莎，吳金鴻，李向紅，張 勇

1. 上海交通大學(xué)a. 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，b. 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海 200241

2. 長沙理工大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，湖南 長沙 410114

脂肪酶 (Lipase, EC 3.1.1.3) 作為一種絲氨酸水解酶，其可作用于長鏈甘油三酯的水解過程中，最后得到產(chǎn)物脂肪酸和甘油[1]。脂肪酶可以參與甘油酯類化合物的合成和水解反應(yīng)，還能催化酯合成反應(yīng)，包括酯化、酯交換、醇解和酸解[2]。脂肪酶在水產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，既可以添加到飼料中提高飼料利用率、魚的生長性能和腸道免疫力[3]，還可以添加到魚糜中，增強凝膠強度，改善魚糜凝膠特性[4]。此外，還有研究者利用脂肪酶的催化特性，對魚油進行水解處理，在最佳工藝條件下，魚油中EPA由3.0%提高至9.0%，DHA由4.3%提高至16.5%[5]。

1980年，Racusen和Foote[6]利用陰離子交換層析和親和層析技術(shù)首次分離純化得到Patatin酯酶。Patatin是一種脂肪酶，酶解活性好[7]，具有良好的乳化性[8]、起泡性[9]和凝膠性[10]。目前，關(guān)于Patatin酯酶已經(jīng)開展了其替代動物蛋白作為葡萄酒澄清劑[11]、作為添加劑制作干酪[12]和蛋白酶水解試驗[13]等研究，但關(guān)于其脂肪水解應(yīng)用研究還未深入。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)Patatin可以水解魚油從而達到富集多不飽和脂肪酸的目的，在Patatin最佳反應(yīng)條件下，魚油中的不飽和脂肪酸含量可以達到97.72%，其中EPA含量比原魚油多了4.20%，由此可見Patatin在魚油等水產(chǎn)脂質(zhì)的制備及加工方面具有潛在應(yīng)用價值。

游離的Patatin酯酶穩(wěn)定性差，且在工業(yè)生產(chǎn)中也很難被重復(fù)利用。酶的固定化技術(shù)可以改善以上缺點。脂肪酶的固定方法包括吸附法[14]、包埋法[15]、共價結(jié)合法[16]等。納米載體具有無毒無污染、比表面積大等優(yōu)勢，本實驗研究了納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合的最優(yōu)條件和固定化酶的酶解特性，以期為開發(fā)高穩(wěn)定性Patatin酯酶及其工業(yè)化應(yīng)用推廣提供新的技術(shù)思路和理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

馬鈴薯全粉：冷凍干燥制備，原料品種為克新1號；Q-Sepharose fast，美國GE Healthcare 公司；對硝基苯乙酸酯，美國Sigma公司；PB緩沖液 (0.2 mol·L-1, pH 7.2～7.4)，上海少辛生物科技有限公司；鹽酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；ConA，阿拉丁 (上海) 有限公司；BSA，阿拉丁 (上海) 有限公司；NHS固體，上海少辛生物科技有限公司；EDC固體，上海少辛生物科技有限公司；MES，上海少辛生物科技有限公司；磁珠 (SR600-20210114-1)，上海邁景生物科技有限公司。

1.2 Patatin酯酶溶液的制備

根據(jù)吳喬羽等[17]實驗方法以馬鈴薯全粉為原料，利用酸沉淀法提取得到粗蛋白質(zhì)液，再根據(jù)孫瑩等[18]實驗方法做適當(dāng)改進后，用Q-Sepharose Fast Flow (2.6 cm×20 cm) 柱子洗脫粗蛋白液，獲得Patatin酯酶溶液。

1.3 磁珠與ConA的偶聯(lián)及偶聯(lián)ConA磁珠上清的BCA實驗

1.3.1 磁珠與 ConA 的偶聯(lián)

取5 mg (200 μL) 磁珠分別置于4個離心管中，其中1組為對照管，另外3組為實驗管。移液器吸取 MEST 溶液 (50 mmol·L-1, pH 6.0) 500 μL置于每管，洗滌3次，每30 s換1次MEST溶液。之后使用移液器吸取500 μL配制好的NHS溶液(50 mg·mL-1) 置于每管中，然后吸取 500 μL 配置好的EDC溶液 (50 mg·mL-1) 置于每管中，混勻后放在旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)15 min?；罨Y(jié)束后利用磁力架吸附磁珠，移液槍吸取上清液，加入500 μL MEST溶液洗滌，重復(fù)3次。向?qū)φ展芗尤? 000 μL MEST溶液，實驗管加1 000 μL配置好的不同濃度梯度的ConA溶液，置于37 ℃恒溫箱中的旋轉(zhuǎn)混合儀上旋轉(zhuǎn)2 h后，保留上清，做BCA蛋白質(zhì)定量測試，磁珠加入1 000 μL封閉液洗滌，重復(fù)3次，再加1 000 μL的封閉液，在4 ℃冰箱旋轉(zhuǎn)混合儀上轉(zhuǎn)動12～15 h。將封閉過夜的磁珠實驗管放入磁分離架中，吸取上清液，然后取1 000 μL保存液，洗滌3次，加入500 μL保存液待用 (4 ℃冰箱) 。

1.3.2 偶聯(lián) ConA 磁珠上清的 BCA 實驗

將1.3.1中的上清液用BCA法定量測定蛋白質(zhì)濃度。取稀釋至濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5、1 mg·mL-1BSA 溶液待用，配置 0.7 mg·mL-1ConA待用。實驗共用1個標(biāo)準(zhǔn)曲線及ConA實驗結(jié)果。取酶標(biāo)板，先在每孔中加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品20 μL，每組做3個平行。吸取200 μL顯色液加入每孔中。全部加完后置于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min。取出后置于酶標(biāo)儀上于波長為562 nm條件下測定蛋白濃度及標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 Patatin酯?；饷腹潭ɑ瘲l件優(yōu)化

1.4.1 Patatin 酯酶活性的測定方法

參照Racusen和Foote[6]的方法，稍作修改。稱取63 mg對硝基苯乙酸 (PNP-acetate)，溶解于10 mL乙醇中，4 ℃保存?zhèn)溆?。測定時，取1 mL對硝基苯乙酸的乙醇溶液加入9 mL去離子水定容至10 mL。取純化的目的蛋白質(zhì)Patatin溶液，若溶液有渾濁，則在3 000 r·min-1條件下離心5 min，取上清液作為實驗用蛋白質(zhì)液。反應(yīng)體系見表1。

表1 Patatin酯酶活性測定反應(yīng)體系Table 1 Reaction system for patatin lipase activity

水浴保溫20 min后，加入600 μL無水乙醇終止反應(yīng)，待冷卻至室溫后用酶標(biāo)儀在波長430 nm下測定吸光值。每組實驗平行重復(fù)3次，A430nm每分鐘變化0.01定義為1個酶活力單位，按照以下公式來計算酶的比活：

式中：U表示酶比活力 [U·(min·g)-1]；ΔA表示反應(yīng)時間內(nèi)吸光值的變化值；W表示樣品中蛋白質(zhì)的質(zhì)量 (g)；T表示反應(yīng)總時間 (min)。

1.4.2 Patatin 酯酶固定化條件的優(yōu)化

由于在固定化過程中，酶的活力會受到固定化材料、時間、溫度等外部條件的影響。其他固定化條件相同，探究固定化材料 (聚丙烯酸PAA、琥珀酸SA、聚苯乙烯PS)、固定化時間 (20、30、40、50、60 min)、固定化溫度 (20、25、30、35、40、45 ℃) 以及載體量 (1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg) 對固定化Patatin酯酶活力的影響。

1.4.3 Box-Benhnken 響應(yīng)面實驗優(yōu)化 Patatin 酯酶固定化條件

采用Box-Benhnken響應(yīng)面分析法，以Patatin酯酶比酶活力為響應(yīng)值，以固定化時間 (A)、固定化溫度 (B)、磁珠添加量 (C) 為自變量，設(shè)計三因素三水平共17個試驗點來優(yōu)化Patatin酯酶的固定化條件，其中選取5個試驗點作為中心點用于估計試驗誤差，其余12個試驗點均為析因點。響應(yīng)面試驗因素和水平見表2。

表2 固定條件Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 2 Box-Benhnken response surface factors and levels of immobilization conditions

1.5 Patatin酯酶固定化納米磁珠特性分析

采用原子力顯微鏡觀察與測定Patatin酯酶固定化前后的表面特征與ζ-電勢。

1.6 固定化Patatin酯酶最佳酶解條件測定

其他酶解條件相同，探究pH (4、5、6、7、8、9、10、11)和溫度 (20、25、30、35、40、45、50、55 ℃) 對固定化Patatin酯酶的影響，根據(jù)所測酶活力繪制固定化相對酶活力。

1.7 固定化Patatin酯酶穩(wěn)定性及重復(fù)利用率測定

1.7.1 固定化前后 Patatin 酯酶耐熱性測定

保持其他處理條件相同，分別將固定化酶和游離酶放置在30、40、50、60、70 ℃的環(huán)境中1 h。處理1 h后將固定化酶和游離酶取出，測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制固定化酶和游離酶相對酶活力曲線，比較兩者對熱的耐受性。

1.7.2 固定化前后 Patatin 酯酶 pH 耐受性測定

保持其他處理條件相同，分別將固定化酶和游離酶放置在pH為4、5、6、7、8、9、10、11的環(huán)境中1 h。處理1 h后將固定化酶和游離酶取出，測定酶活力。根據(jù)酶活力繪制固定化酶和游離酶相對酶活力曲線，比較兩者pH耐受性。

1.7.3 固定化 Patatin 酯酶重復(fù)利用率測定

稱取制備好的固定化酶，在40 ℃、pH 7條件下連續(xù)反應(yīng)5次，以第一次反應(yīng)的酶活力為100%，探究該固定化酶的重復(fù)利用率。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

收集洗脫液，進行電泳分析 (圖1)。在相對分子量為43 kD左右的位置有1條主要的蛋白質(zhì)條帶，與文獻[17]中所得到的Patatin酯酶分子量基本一致。說明用Q-Sepharose Fast Flow 陰離子交換柱分離并用緩沖液Ⅱ洗脫下來的組分中含有目的蛋白質(zhì)。

圖1 親和色譜分離組分SDS-PAGE分析結(jié)果Fig. 1 SDS-PAGE of fractiones separated by affinity chromatography

2.2 磁珠與ConA的偶聯(lián)及其吸附率測定

根據(jù)1.3的方法繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.672 22x+0.140 16，R2=0.994 2，表明該模型可以解釋響應(yīng)值總變異的99.42%。

圖2 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2 Standard curve of protein concentration determined by BCA method

納米磁珠ConA吸附量及其吸附率3個批次測定結(jié)果見表3，實驗結(jié)果顯示，每毫克磁珠平均吸附33.77 μg ConA，平均吸附率為24.50%。

表3 磁珠與ConA的偶聯(lián)實驗結(jié)果Table 3 Results of coupling experiment between magnetic beads and ConA

2.3 Patatin酯酶固定化條件優(yōu)化

2.3.1 Patatin 酯酶最適固定化材料

PAA、SA、PS 3種材料中，PAA效果最好，SA效果最差 (圖3)。PAA有一定的親水性，同時又具有多孔的結(jié)構(gòu)，能夠增加載酶量的同時保證酶的高活性[20]。

圖3 固定化材料對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 3 Effect of immobilized materials on immobilized patatin lipase

2.3.2 Patatin 最適固定化時間

隨著固定化時間的增加，固定化效果呈現(xiàn)增加的趨勢 (P＜0.05，圖4) ，說明固定化Patatin酯酶量增加，當(dāng)時間超過50 min以后，隨著時間的增加，磁珠固定化效果下降，因此最佳固定化時間為50 min。時間超過50 min后磁珠固定化效果下降，可能是因為固定化溫度較高，固定化時間過長導(dǎo)致Patatin酯酶活性下降[21]。

圖4 固定化時間對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 4 Effect of immobilized time on immobilized patatin lipase

2.3.3 Patatin 最適固定化溫度

溫度介于20～25 ℃，納米磁珠固定化效果隨溫度升高而逐漸上升 (P＜0.05) ，并且在25 ℃時固定化效果達到最大 (圖5)。溫度超過25 ℃以后，納米磁珠固定化效果隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢(P＜0.05) 。納米磁珠固定化效果率隨溫度升高而達到最大值時的溫度被稱為最適固定化溫度，在本研究中最適固定化溫度為25 ℃。固定化溫度過低會導(dǎo)致磁珠固定化Patatin酯酶質(zhì)量較低，但是固定化溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而降低納米磁珠固定化效果。Patatin酯酶本質(zhì)是一類具有催化作用的活性蛋白質(zhì)，溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而部分或全部失去其水解活性[22]。

圖5 固定化溫度對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 5 Effect of immobilized temperature on immobilized patatin lipase

2.3.4 Patatin 最適磁珠添加量

磁珠添加量介于1.0～3.0 mg·mL-1，固定化效果隨磁珠添加量升高而逐漸上升(P＜0.05) ，并且在3.0 mg·mL-1時固定化效果達到最大(圖6)。磁珠添加量超過3.0 mg·mL-1以后，固定化效果隨磁珠添加量的升高呈現(xiàn)下降趨勢 (P＜0.05) 。固定化效果隨磁珠添加量升高而達到最大值時的添加量被稱為最佳磁珠添加量[23]，在本研究中最佳磁珠添加量為3.0 mg·mL-1。磁珠添加量過低會導(dǎo)致磁珠固定化Patatin質(zhì)量較低，但是磁珠添加量過高會導(dǎo)致磁珠相對表面積增大，從而降低納米磁珠固定化效果。

圖6 磁珠添加量對Patatin酯酶固定化效果的影響Fig. 6 Effect of magnetic bead addition on immobilized patatin lipase

2.3.5 Patatin 最適固定化條件 Box-Benhnken 響應(yīng)面實驗

Box-Benhnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表4。

表4 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Box-Benhnken response surface design and experimental results

利用Design-Expert對數(shù)據(jù)進行計算分析，得到固定化時間 (A)、固定化溫度 (B)、磁珠添加量(C) 3個因素的二次多項回歸模型 (變量為歸一化后的值) 為：

酶比活力=3.174 5-0.327 9A+0.052 6B+0.003 06C-0.006 2AB+0.003 0AC-0.009 0BC- 0.583 9A2-0.427 1B2-0.692 5C2

回歸模型的顯著性結(jié)果見表5，模型決定系數(shù)R2=0.995 1，說明該模型可以解釋響應(yīng)值總變異的99.51%，該回歸模型顯著 (P＜0.000 1)，失擬項不顯著 (P=0.200 2＞0.05)，說明該模型可以用來擬合各自變量 (固定化時間A、固定化溫度B、磁珠添加量C) 和因變量 (響應(yīng)值) 之間的關(guān)系，并且可以用該模型對實驗結(jié)果進行分析，可以利用該模型對酶解實驗結(jié)果進行分析和預(yù)測，確定Patatin酯酶最佳固定化條件。由回歸模型表達式可知，該模型最高次項為二次，不需要引入更高次數(shù)的項。

表5 Box-Benhnken響應(yīng)面分析試驗回歸模型方差分析表Table 5 Analysis of variance (ANOVA) and results of Box-Benhnken response surface

基于回歸模型建立響應(yīng)面分析曲線見圖7。由曲面圖中的曲面形狀和等高線分布情況可以看出，取得極值時的酶解反應(yīng)條件出現(xiàn)在所選取的實驗因素的范圍之內(nèi)。對回歸模型函數(shù)求偏導(dǎo)，得到極值點A=-0.3、B=0.1、C=0.0，將極值點換算成試驗條件并選擇整數(shù)值作為實際操作條件，即為固定化時間47 min，固定化溫度25 ℃，磁珠添加量為3 mg·mL-1。此條件下測得的酶比活力為3.223×104U·g-1。對求解所得的最佳酶解反應(yīng)條件進行實驗驗證，經(jīng)3次平行重復(fù)實驗測得Patatin酶比活力為3.149×104U·g-1，相對誤差為2.31%。實驗結(jié)果說明回歸模型有較好的擬合性，證明了回歸模型的可行性較高。

圖7 各因素交互作用對Patatin酯酶固定化效果的響應(yīng)曲面Fig. 7 Effects of various factors and their interactions on immobilized patatin lipase

2.4 Patatin酯酶固定化納米磁珠特性分析

2.4.1 固定化納米磁珠表面特征分析

Patatin酯酶固定化納米磁珠從表面上可以明顯看出其顆粒狀且顆粒大小及分布較為均勻，而與Patatin酯酶結(jié)合后顆粒狀消失并且形成較大且大小不均勻的塊狀物，可能是因為納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合，蛋白固定化覆蓋在磁珠表面形成較大顆粒，不易聚合 (圖8-a、8-b)。

圖8 Patatin酯酶固定化前 (a, b) 與固定化后 (c, d) 表面特征Fig. 8 Surface characteristics of magnetic beads before (a, b) and after (c, d) patatin lipase immobilization

2.4.2 固定化納米磁珠 ζ-電勢分析

Patatin酯酶在固定化前后ζ-電勢見表6，可以看出納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合之后，ζ-電勢絕對值降低，說明結(jié)合后顆粒直徑增大，分子間靜電斥力減少，顆粒間穩(wěn)定性降低。

表6 磁珠固定Patatin酯酶前后ζ-電勢Table 6 ζ- potential of patatin lipase before and after magnetic beads immobilization

2.5 固定化Patatin酯酶最佳酶解條件

2.5.1 固定化 Patatin 酯酶最佳酶解 pH

在不同的pH條件下，固定化Patatin酯酶的酶解活性呈現(xiàn)出一定的差異，其酶解活性隨pH先增大后降低，pH＜7時，固定化Patatin酯酶的酶解活性隨著pH的增加而顯著上升 (P＜0.05)，當(dāng)pH=7時，酶解活性達到最大值，pH＞7以后，酶解活性隨pH的增大而顯著下降 (P＜0.05，圖9)。固定化Patatin酯酶的最適pH與游離的Patatin酯酶相同，說明Patatin酯酶與納米磁珠載體結(jié)合后的構(gòu)象變化并沒有顯著影響到Patatin酯酶對于氫離子 (H+) 的敏感度。

圖9 pH對固定化Patatin酯酶酶解活性的影響Fig. 9 Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase

2.5.2 固定化 Patatin 酯酶最佳酶解溫度

溫度介于20～40 ℃，Patatin酯酶的酶解活性隨溫度的升高而逐漸上升 (P＜0.05)，并且在40 ℃時固定化效果達到最大 (圖10)。溫度超過40 ℃以后，納米磁珠固定化效果隨溫度的升高呈現(xiàn)下降趨勢 (P＜0.05)。固定化Patatin酯酶最適酶解溫度為40 ℃。Patatin酯酶本質(zhì)是一類具有催化作用的活性蛋白質(zhì)，溫度過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而部分或全部失去其水解活性。相較于游離的Patatin酯酶，固定化Patatin酯酶的最適溫度略微升高，可能是因為Patatin酯酶和納米磁珠結(jié)合后熱穩(wěn)定性提高而導(dǎo)致的。

圖10 溫度對固定化Patatin酯酶酶解活性的影響Fig. 10 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase

2.6 固定化Patatin酯酶耐性及回收率

2.6.1 固定化前后 Patatin 酯酶耐熱性

隨著處理溫度的升高，固定化Patatin酯酶和游離Patatin酯酶的活性降低 (圖11)。當(dāng)溫度超過30 ℃時，隨著溫度的升高，游離Patatin酯酶的相對活性大大降低，而固定化Patatin酯酶的相對活性則緩慢降低。這可能是由于固定化Patatin酯酶與游離Patatin酯酶相比，限制了酶的構(gòu)象變化，穩(wěn)定了固定化酶的相對酶活性，降低了酶的失活程度，提高了固定化Patatin酯酶的耐高溫性。

圖11 溫度對固定化前后Patatin酯酶穩(wěn)定性的影響Fig. 11 Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization

類比半抑制濃度 (Inhibitory concentration 50,IC50)，本文定義半抑制條件 (Inhibitory condition 50, IC50)。對固定化前后Patatin酯酶溫度耐受性結(jié)果利用SPSS進行線性回歸分析 (表7)。游離Patatin酯酶的IC50為18.87 ℃，固定化Patatin酯酶的IC50為42.01 ℃。固定化后溫度耐受性提高了123%左右。

表7 固定化前后Patatin酯酶溫度耐受性的回歸分析Table 7 Regression analysis of temperature tolerance before and after patatin lipase immobilization

2.6.2 固定化前后 Patatin 酯酶 pH 耐受性

固定化Patatin酯酶對pH的抗性并不高 (圖12)。只有在pH介于5～9，固定化Patatin酯酶保持稍微較高的酶相對活性。當(dāng)pH值為5和9時，酶的相對活性分別為52.56%和46.85%。

圖12 pH對固定化前后Patatin酯酶穩(wěn)定性的影響Fig. 12 Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization

對固定化前后Patatin酯酶pH耐受性結(jié)果利用SPSS進行多項式回歸分析，結(jié)果見表8。游離Patatin酯酶的IC50為2.815，固定化Patatin酯酶的IC50為1.915。固定化后Patatin酯酶的pH耐受性提高了47%左右。

表8 固定化前后Patatin酯酶pH耐受性的回歸分析Table 8 Regression analysis pH tolerance before and after patatin lipase immobilization

2.6.3 固定化 Patatin 酯酶操作重復(fù)利用率

固定化Patatin酯酶的重復(fù)利用率見圖13。固定化Patatin酯酶連續(xù)反應(yīng)5次后仍有56.60%的酶活力，相較于游離Patatin酯酶只能進行1次操作，固定化Patatin酯酶的重復(fù)利用率顯著提高。

圖13 固定化Patatin酯酶重復(fù)利用率Fig. 13 Reuse ratio of immobilized patatin lipase

3 結(jié)論

本文經(jīng)篩選確定了使用PAA-Fe3O4進行Patatin酯酶固定化，其最優(yōu)固定化條件為固定化時間47 min，固定化溫度25 ℃，磁珠添加量為3 mg·mL-1。固定化Patatin酯酶在40.0 ℃、pH 7時水解底物活性最高。從結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)納米磁珠與Patatin酯酶結(jié)合后，Patatin酯酶覆蓋在顆粒表面，顆粒直徑變大，顆粒穩(wěn)定性降低，有聚集顆粒形成。固定化Patatin酯酶的耐熱性相比于游離Patatin酯酶提高了123%左右，pH耐受性提高了47%左右，連續(xù)反應(yīng)5次后仍保留56.60%酶活力，說明納米磁珠固定化后提高了Patatin酯酶的酶催化特性，研究為Patatin在水產(chǎn)品尤其是魚油等脂類物質(zhì)中的加工應(yīng)用提供了有價值的參考。