高坤鵬，孫建安，毛相朝,

1. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

2. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237

維生素A參與機體的多種代謝活動，具有改善皮膚[1]、抗氧化[2]、增強免疫力[3]、維持正常視力[4]等多種生理功能。維生素A也被應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，有研究表明在養(yǎng)殖前期添加維生素A可以促進(jìn)凡納濱對蝦 (Litopenaeus vannamei) 的生長，還能夠提高其血清中溶菌酶和酚氧化酶的活力，增強其非特異性免疫反應(yīng)[5]。建鯉 (Cyprinus carpio var. Jian) 飼養(yǎng)實驗表明維生素A缺乏可能會導(dǎo)致幼建鯉飼料利用率下降，從而降低其生長速度，還會使其血液中的白細(xì)胞數(shù)量和溶菌酶活力下降，導(dǎo)致免疫功能受損[6]?？梢?，保證維生素A的攝入對機體的生長發(fā)育以及維持正常免疫力非常必要。然而，維生素A對光、熱、氧不穩(wěn)定，容易被氧化分解，而且過量的維生素A還會對皮膚產(chǎn)生一定的刺激作用。針對上述問題，目前已有大量研究通過化學(xué)法或酶法將維生素A轉(zhuǎn)化為維生素酯來改善其不穩(wěn)定性和刺激性[7-8]。與化學(xué)法相比，酶催化合成法更環(huán)保，副產(chǎn)物的積累也更少[9]；但卻存在酶法催化處理量較小，成本較高的問題。針對這些問題，可以通過無溶劑體系反應(yīng)、固定化酶等策略進(jìn)行改善。已有研究通過脂肪酶催化合成了維生素A月桂酸酯[10]、維生素A棕櫚酸酯[11-12]、維生素A乳酸酯[13]等不同種類的維生素A酯。由于這些維生素A酯的酰基供體不同，它們的理化性質(zhì)和功能活性也表現(xiàn)出一定的差異。維生素A琥珀酸單酯由于暴露出一個羧基而表現(xiàn)出更好的親水性[14]，而維生素A乳酸酯則由于乳酸的作用[15]而對改善皮膚表現(xiàn)出更好的活性。

二十二碳六烯酸 (Docosahexaenoic acid, DHA,22:6n-3) 是一種被廣泛報道的ω-3多不飽和脂肪酸，能夠促進(jìn)大腦[16]和視網(wǎng)膜[17]的發(fā)育，同時還具有抗衰老[18]、抗菌[19]、抗氧化和抗炎[20]等多種生理活性。天然的DHA主要存在于海洋魚類和藻類中，是最具代表性的海洋脂質(zhì)，也是目前最風(fēng)靡的海洋來源保健品之一。然而天然魚油及藻油中DHA的濃度均較低[21]，需要進(jìn)一步提高濃度才能更好地發(fā)揮其作用。DHA乙酯 (Ethyl docosahexaenoate, EDHE) 是最常見的富含DHA的產(chǎn)品 (其相對含量甚至可達(dá)90%)，但是其生物利用度明顯低于甘油酯和游離脂肪酸[22]。已有研究利用脂肪酶或磷脂酶A1催化酯交換反應(yīng)將EDHE轉(zhuǎn)化為甘油酯[23]或磷脂[24]的形式，從而提高DHA的營養(yǎng)價值和生物利用度。李金章等[25]利用脂肪酶催化富含多不飽和脂肪酸的乙酯型魚油與甘油酯發(fā)生酯交換反應(yīng)，合成了多不飽和脂肪酸含量大于45%的甘油酯。孫兆敏等[26]則使用磷脂酶A1催化合成了含8.0% EPA和17.8% DHA的磷脂。

實際上，維生素A也可以作為DHA的?；荏w，它與DHA形成的酯化產(chǎn)物還可能兼具兩者的生理活性。為了改善維生素A的穩(wěn)定性，同時提高EDHE的生物利用度，本研究利用脂肪酶催化維生素A醋酸酯 (Vitamin A acetate, VAAE) 與EDHE發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)合成維生素A二十二碳六烯酸酯(Vitamin A docosahexaenoate, VADHE)。在液相和質(zhì)譜鑒定基礎(chǔ)上，利用硅膠柱層析法對合成產(chǎn)物進(jìn)行了純化，并對其全波長吸收和核磁共振碳譜進(jìn)行了表征。最后分別對有機溶劑反應(yīng)體系和無溶劑反應(yīng)體系中的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，使其在較短時間便可達(dá)到較高的轉(zhuǎn)化率，為VADHE的大批量制備和后期功能活性研究奠定了基礎(chǔ)。同時，本研究還可為一些具有特定性質(zhì)的新型脂質(zhì)的設(shè)計和合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

VAAE購自麥克林，純度高于95.5%；乙酯型藻油購自西安仁邦生物科技有限公司，DHA相對含量88.9%；脂肪酶Novozyme435購自諾維信公司；C18填料 (Copure? C18 SPE Cartridges) 購自深圳逗點生物技術(shù)有限公司；色譜級甲醇用于液相檢測；其余試劑如石油醚、正己烷等均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 有機溶劑體系中 VADHE 的合成

稱取0.100 mmol VAAE于棕色反應(yīng)瓶中，加入20 μL藻油和20 mg固定化酶Novozyme435，再加入2 mL有機溶劑溶解底物。反應(yīng)體系充氮后立即密封，將反應(yīng)瓶置于37 ℃水浴搖床上開始反應(yīng)。反應(yīng)6 h后離心除去固定化脂肪酶，用甲醇將上層反應(yīng)液稀釋50倍，稀釋液過膜后用于液相檢測。本環(huán)節(jié)依次對有機溶劑 (石油醚、正己烷、異辛烷、環(huán)己烷、乙腈、異丙醇、二甲亞砜)、VAAE添加量 (0.050、0.075、0.100、0.125、0.150 mmol)、反應(yīng)溫度 (25、30、35、40、45、50、55、60 ℃)、加酶量 (10、15、20、25、30、35 mg)、反應(yīng)時間(1、3、6、9、12、24 h) 及含水量 (0、4、8、12、16、20 μL) 進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.2 無溶劑體系中 VADHE 的合成

稱取1.000 mmol VAAE于棕色反應(yīng)瓶中，再加入一定體積的藻油和50 mg固定化酶Novozyme-435。反應(yīng)體系充氮后立即密封，將反應(yīng)瓶置于37 ℃水浴搖床開始反應(yīng)。反應(yīng)6 h后離心除去固定化脂肪酶，用甲醇將上層反應(yīng)液梯度稀釋1 000倍，稀釋液過膜后用于液相檢測。本環(huán)節(jié)依次對藻油添加量 (500、600、700、800、900、1 000 μL)、反應(yīng)溫度 (25、30、35、40、45、50、 55、 60 ℃)、加酶量 (25、50、75、100、125、150 mg) 及反應(yīng)時間 (30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h) 進(jìn)行了優(yōu)化。

1.2.3 反應(yīng)體系中 VADHE 的純化

用甲醇充分浸泡C18填料2 h，攪拌均勻后吸取硅膠粉末懸液裝柱 (60 mm×10 mm)，再使用甲醇充分沖洗，保證填料均勻且致密。將無溶劑體系反應(yīng)后的反應(yīng)液與4倍體積的甲醇混合，吹打均勻后吸取500 μL混合液上樣，以甲醇為流動相 (流速2 mL·min-1) 進(jìn)行洗脫。舍棄前30 mL洗脫液，之后用10 mL離心管接取洗脫液，每管收集8 mL。每管吸取洗脫液200 μL至96孔板，用全波長酶標(biāo)儀(Thermo Scientific Multiskan FC) 測定其在327 nm處的吸光度。初步確定樣品的保留時間。將可能含有目標(biāo)化合物的樣品用于液相檢測，間隔5管測定。將純度較高的幾管樣品合并后用液相檢測其純度，剩余樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲醇，用氘代氯仿復(fù)溶后用于核磁表征。

1.2.4 VADHE的分析檢測

1) 參考高澤鑫[27]方法對反應(yīng)體系中的各組分進(jìn)行液相檢測。使用日本島津高效液相色譜儀，甲醇作為流動相，流速1 mL·min-1，C18液相色譜柱(150 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm)，柱溫箱 35 ℃，紫外檢測波長為327 nm。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率 (%) 計算公式如下：

式中：RC為反應(yīng)轉(zhuǎn)化率；S1為液相檢測中VADHE的峰面積；S2為底物VAAE的峰面積；S3為水解產(chǎn)物游離維生素A的峰面積。

2) 液相-質(zhì)譜聯(lián)用鑒定。液相條件和上文一致，質(zhì)譜分析采用正離子模式，掃描范圍為50～700 eV。

3) 核磁共振碳譜表征。使用安捷倫Pro pulse 500 MHz核磁共振波譜儀，在室溫條件下掃描6 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 維生素A-DHA酯的鑒定、純化及初步表征

反應(yīng)體系中各組分的液相檢測結(jié)果見圖1-a，按照出峰順序，3.154 min為VAAE的水解產(chǎn)物維生素A，3.967 min為底物VAAE，4～8 min可能是維生素A降解產(chǎn)物，14～21 min為藻油中脂肪酸乙酯與VAAE發(fā)生酯交換反應(yīng)獲得的產(chǎn)物，其中，16.333 min出峰為目的產(chǎn)物VADHE。采用高分辨液相-質(zhì)譜聯(lián)用 (安捷倫) 技術(shù)進(jìn)一步對產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，圖1-b展示了產(chǎn)物的質(zhì)譜鑒定結(jié)果，其中，614.481 9是目的產(chǎn)物[M+NH4]+的分子量，635.424 3則是目的產(chǎn)物[M+K]+的分子量。

圖1 維生素A-DHA酯 (VADHE) 的液相 (a) 和質(zhì)譜 (b) 鑒定Fig. 1 Identification of vitamin A docosahexaenoate(VADHE) by HPLC (a) and MS (b)

利用柱層析法進(jìn)行目標(biāo)化合物的分離，參照液相檢測時的洗脫條件，獲得的洗脫曲線見圖2-a，從圖中可以清楚地看到兩組峰。液相檢測結(jié)果表明第一組化合物 (第0—第15管) 主要是VAAE以及水解副產(chǎn)物維生素A，兩者不能被很好地分離，目的化合物VADHE主要在第二組 (20管之后)中。對第二組化合物進(jìn)行間隔取樣檢測，測定了第21、第26、第31、第36和第41管樣品的組分，發(fā)現(xiàn)第26—第36管樣品純度較高，第36管樣品往后出現(xiàn)了較多其他脂肪酸與維生素A形成的酯。利用第31管樣品 (純度＞93%) 測定了目標(biāo)化合物在不同波長下的吸光度，結(jié)果表明其最大吸收波長為325 nm (圖2-b) 。將第26—第36管樣品混合均勻后液相檢測其組分。結(jié)果表明，其純度可以達(dá)到90%以上，可以用于核磁表征及后期的生理活性實驗。

圖2 VADHE的純化洗脫曲線 (a) 、全波長掃描 (b) 和核磁共振碳譜 (c) 結(jié)果Fig. 2 Elution curve (a), full wavelength scanning (b) and 13C NMR (c) of VADHE

核磁共振碳譜結(jié)果見圖2-c，參照維生素A棕櫚酸酯[28-29]和EDHE[30]的13C NMR結(jié)果，可以推斷出不同化學(xué)位移出峰所對應(yīng)的碳原子?；瘜W(xué)位移從高到低分別是173.18 (C20), 139.22 (C12), 137.96(C5), 137.72 (C16), 136.74 (C4), 135.94 (C15),132.2～125.9 (C10、C11、C13、C14、C17、C26、C27、C29、C30、C32、C33、C35、C37、C39、C41、C42),77.16 (CDCl3), 61.42 (C18), 39.77 (C1), 34.40 (C3),33.22 (C21), 29.85 (C6), 29.11 (C2), 25.75 (C28、C31、C34、C37、C40), 22.98 (C7、C8), 21.88 (C43),20.71 (C9), 19.42 (C23), 14.43 (C24), 12.90 (C44)。

2.2 有機溶劑體系合成VADHE反應(yīng)條件優(yōu)化

針對有機溶劑體系中的合成反應(yīng)，本研究首先對有機溶劑的種類進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨有機溶劑的logP增大而增加，石油醚體系最有利于產(chǎn)物的生成 (圖3-a)。Novozyme435在正己烷、環(huán)己烷和異辛烷這類非極性較強的溶劑中也能較好地發(fā)揮作用，而在異丙醇和二甲基亞砜中轉(zhuǎn)化率極低。VAAE添加量的優(yōu)化結(jié)果表明，隨著VAAE添加量的提高，VADHE產(chǎn)量逐漸升高，但VAAE的轉(zhuǎn)化率呈下降趨勢 (圖3-b)。從VADHE的產(chǎn)量變化曲線也可以看出，在VAAE添加量從0.050 mmol升至0.100 mmol的過程中，VADHE產(chǎn)量增長幅度較大，而當(dāng)VAAE添加量繼續(xù)升高時，VADHE產(chǎn)量的增長幅度變小。為節(jié)約成本，選擇添加0.100 mmol VAAE進(jìn)行后續(xù)研究。反應(yīng)溫度優(yōu)化的結(jié)果表明 (圖3-c)，從25 ℃到40 ℃，隨著溫度升高，目的產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率也有所提高，可能因為溫度升高加快了分子運動，從而更有利于酶分子與底物分子的接觸。當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，較高的溫度加速了酶的失活，因此轉(zhuǎn)化率出現(xiàn)明顯下降，最終以40 ℃作為最佳反應(yīng)溫度。另外，從圖3-c中也能觀察到，當(dāng)溫度從25 ℃升至40 ℃時，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率只是緩慢增加，因此，即使不控制溫度，在室溫條件下也可獲得較高的產(chǎn)量，有利于節(jié)約能源。

圖3 VADHE在有機溶劑體系中合成反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig. 3 Optimization of synthetic reaction conditions in organic solvent systems of VADHE

本研究測定了不同酶添加量條件下反應(yīng)體系中目的產(chǎn)物的含量，結(jié)果表明，從10 mg到25 mg反應(yīng)轉(zhuǎn)化率有比較明顯的提高；當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時，轉(zhuǎn)化率提升幅度較小，因此選擇添加25 mg固定化酶來進(jìn)行后續(xù)研究 (圖3-d)。反應(yīng)時間對轉(zhuǎn)化率的影響見圖3-e，前6 h由于底物VAAE含量較高，脂肪酶能夠較快地催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率隨著時間延長明顯提高。當(dāng)反應(yīng)時間繼續(xù)延長時 (6～24 h)，由于反應(yīng)體系中VAAE濃度大大降低，轉(zhuǎn)化率的提高幅度明顯變小，趨于穩(wěn)定，因此選用6 h作為最適反應(yīng)時間。最后，含水量對反應(yīng)轉(zhuǎn)化率影響的實驗表明，含水量對Novozyme435催化產(chǎn)物生成的效率影響不是很大，并沒有呈現(xiàn)出較強的規(guī)律性(圖3-f)。Jahangiri等[31]同樣利用脂肪酶Novozyme-435催化轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，水分活度與轉(zhuǎn)酯反應(yīng)效率呈現(xiàn)出負(fù)相關(guān)關(guān)系。當(dāng)水分活度為0時，脂肪酶可以比較好地催化胭脂素和山梨醇發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，合成降胭脂樹素山梨醇酯。而當(dāng)水分活度逐漸升高時，脂肪酶轉(zhuǎn)酯反應(yīng)效率大大降低，轉(zhuǎn)而催化水解反應(yīng)生成降胭脂樹素。從這個角度來看，當(dāng)用Novozyme435催化VADHE的合成時，反應(yīng)體系中的微量水 (1%以下) 不會很明顯地抑制轉(zhuǎn)酯反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率更加穩(wěn)定。

2.3 無溶劑體系合成VADHE反應(yīng)條件優(yōu)化

相較于有機溶劑體系，無溶劑體系可以減少有機溶劑的使用，有利于保護(hù)環(huán)境，消除有機溶劑殘留的風(fēng)險，減弱有機溶劑對酶的毒害作用，還可以大量制備目的產(chǎn)物。反應(yīng)優(yōu)化的結(jié)果表明不同藻油添加量對于轉(zhuǎn)化率的影響不是很大，最高值和最低值的差值還不到2%，700 μL的藻油更有利于反應(yīng)的進(jìn)行 (圖4-a)。藻油添加量較小時會導(dǎo)致體系流動性不佳，不利于反應(yīng)的進(jìn)行，而當(dāng)藻油添加量較大時，一方面降低了體系中VAAE的濃度，另一方面，藻油本身含有微量的水，大量添加藻油時，體系中的含水量也會增加，部分脂肪酶可能會被用于EDHE的水解，也不利于合成反應(yīng)的進(jìn)行。無溶劑體系中的溫度梯度實驗表明，在55 ℃下進(jìn)行反應(yīng)更有利于底物轉(zhuǎn)化為目的產(chǎn)物 (圖4-b)，這與有機溶劑體系中的優(yōu)化結(jié)果相差較大。推測可能是在較低的溫度下，體系比較黏稠，不利于傳質(zhì)，而在更高的溫度時，反應(yīng)體系具備更好的流動性，從而增加了傳質(zhì)效率，有利于兩種底物和酶的接觸。

圖4 VADHE在無溶劑體系中合成反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig. 4 Optimization of synthetic reaction conditions in solvent-free systems of VADHE

無溶劑體系中加酶量的優(yōu)化結(jié)果見圖4-c，轉(zhuǎn)化率隨著加酶量的增加呈現(xiàn)出一個先升高再平緩的變化趨勢。當(dāng)加酶量由25 mg增加至50 mg時，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率明顯提高，當(dāng)加酶量繼續(xù)提升到100 mg時，轉(zhuǎn)化率也出現(xiàn)一定程度的提升，隨著加酶量的繼續(xù)增加，變化趨勢趨于平緩?？紤]到酶的成本，選擇100 mg固定化酶添加量繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)時間的優(yōu)化。反應(yīng)轉(zhuǎn)化率隨著時間呈現(xiàn)先升后降的變化趨勢 (圖4-d)，反應(yīng)2 h已經(jīng)能夠達(dá)到40%，4 和8 h的轉(zhuǎn)化率幾乎一樣，均為56%左右，12 h的轉(zhuǎn)化率降低至51.25%。因此選擇4 h作為最佳反應(yīng)時間，此時的轉(zhuǎn)化率為56.39%?？梢钥闯觯瑹o溶劑體系的轉(zhuǎn)化率明顯高于有機溶劑反應(yīng)體系，且相較于有機溶劑體系，用4倍的酶量就可以處理10倍的底物 (以VAAE的添加量計)，這對于節(jié)約成本也具有重要意義。Nurshakila等[32]同樣分別在有機溶劑體系和無溶劑體系中嘗試了己酸乙酯的酶促合成，在兩種體系中的轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到68%和48%；結(jié)果與本文相反，可能是脂肪酶本身的性質(zhì)以及反應(yīng)底物的種類不同，導(dǎo)致Novozyme435更適合于在無溶劑體系中催化VAAE與EDHE的轉(zhuǎn)酯。然而值得注意的是，無溶劑體系需要添加較多的藻油來維持體系的流動性，因此在一定程度上造成了EDHE的浪費，后期有必要嘗試將反應(yīng)體系中未反應(yīng)的EDHE 分離回收，日后用來繼續(xù)反應(yīng)以減少浪費。

3 結(jié)論

本研究立足于維生素A的不穩(wěn)定性以及EDHE的低生物利用度，設(shè)計了VADHE這種新型化合物，繼而利用脂肪酶Novozyme435催化乙酯型藻油中的EDHE與VAAE發(fā)生轉(zhuǎn)酯反應(yīng)，實現(xiàn)了VADHE的合成。此外，還利用柱層析法對反應(yīng)體系中的VADHE進(jìn)行了純化，并對其全波長吸收和核磁共振碳譜進(jìn)行了表征。同時，經(jīng)液相檢測，純化后目的產(chǎn)物的純度可以達(dá)到90%以上。為了提高目的化合物得率，本研究進(jìn)一步對有機溶劑體系和無溶劑體系中的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化。在有機溶劑體系中，以石油醚作為反應(yīng)溶劑，藻油用量20 μL，VAAE用量0.100 mmol，反應(yīng)溫度40 ℃時，25 mg脂肪酶可在6 h內(nèi)催化40.61%的VAAE轉(zhuǎn)化為VADHE；在無溶劑體系中，100 mg脂肪酶在4 h內(nèi)即可催化56%以上的VAAE 轉(zhuǎn)化為VADHE (VAAE用量為1.000 mmol)。本文首次報道了VADHE的合成，且能夠通過比較簡單的純化方式獲得純度較高的樣品，這也為對該化合物進(jìn)行更進(jìn)一步的功能活性研究打下了基礎(chǔ)。由于維生素A和DHA均有利于維持視力，且均具有抗衰老、抗氧化的生理活性，兩者的酯化產(chǎn)物可能會表現(xiàn)出更強的生理活性。另一方面，VADHE可能是一種同時具有維生素A和DHA生物活性的雙功能分子，使其有可能應(yīng)用于更廣泛的領(lǐng)域。后期還需要更多的實驗對合成產(chǎn)物的穩(wěn)定性、功能活性等進(jìn)行研究，從而評估該化合物的應(yīng)用潛力。