袁 源 ，宿玲恰 ，張 康 ，朱昫飏 ，夏 偉 ，吳 敬

1. 江南大學(xué)/食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122

2. 江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122

幾丁質(zhì)又稱甲殼素，是自然界中含量僅次于纖維素的天然高分子多糖[1]，廣泛存在于蝦蟹、昆蟲等甲殼類動(dòng)物外殼及節(jié)肢動(dòng)物外骨骼中，是真菌細(xì)胞壁的基本組分。由于天然存在的幾丁質(zhì)性質(zhì)穩(wěn)定，難溶于水、稀酸、堿，只溶于強(qiáng)無機(jī)酸，故很難被高效利用[2]。殼聚糖是甲殼素部分脫乙酰基的衍生物，是天然多糖中唯一的堿性多糖[3]，殼聚糖具有優(yōu)異的生物學(xué)功能[4]，如抗菌、抗腫瘤、提高免疫力，且安全無毒，是擁有巨大應(yīng)用潛力的功能性生物材料。但殼聚糖分子量較大，人體難以吸收，未處理的殼聚糖只能溶于某些酸性溶液，黏度較高，使其在開發(fā)應(yīng)用上受到極大限制。

幾丁質(zhì)斷裂β-1,4-糖苷鍵生成的產(chǎn)物幾丁寡糖和殼聚糖解聚生成的殼寡糖統(tǒng)稱為氨基寡糖，聚合度低于10。氨基寡糖具有優(yōu)越的溶解性和多種生理功能，如益生元特性[5]；這些寡糖可作為碳源支持有益腸道細(xì)菌的選擇性生長；殼寡糖中的氨基和羥基可以結(jié)合養(yǎng)殖用水中的金屬離子，凈化養(yǎng)殖用水，防止金屬離子對水產(chǎn)動(dòng)物的毒害[6]。氨基寡糖具有高聚合度多糖不可比擬的優(yōu)越性能，在食品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域具有極好的應(yīng)用價(jià)值，其規(guī)?；a(chǎn)越來越受到關(guān)注。

幾丁質(zhì)酶 (EC 3.2.1.14) 能催化水解N-乙酰氨基葡萄糖 (GlcNAc) 多聚物中的β-1,4-糖苷鍵，根據(jù)與底物作用的位置不同，幾丁質(zhì)降解酶可分為β-N-乙酰葡萄糖苷酶、內(nèi)切幾丁質(zhì)酶和外切幾丁質(zhì)酶[7]。其中β-N-乙酰葡萄糖苷酶能夠從非還原末端切割糖苷鍵釋放GlcNAc單體；內(nèi)切幾丁質(zhì)酶能夠在多聚物中隨機(jī)切割糖苷鍵生成不同聚合度的寡糖；外切幾丁質(zhì)酶能夠在多聚物末端以二聚體為單位切割糖苷鍵生成幾丁二糖。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年海洋生物的幾丁質(zhì)合成量超10億噸[8]，水產(chǎn)及食品工業(yè)都會排放大量的甲殼素垃圾，造成嚴(yán)峻的環(huán)境問題。另一方面，通過幾丁質(zhì)酶高效降解幾丁質(zhì)及其衍生物的廢棄物以提高其利用率、獲得優(yōu)良的氨基寡糖具有廣闊前景[9]。本文將從海洋藻類中分離得到的地衣芽孢桿菌 (Bacillus licheniformis) 中的幾丁質(zhì)酶基因blchiA在枯草芽孢桿菌 (B. subtilis) 中進(jìn)行重組表達(dá)，表征其酶學(xué)性質(zhì)，重組酶有較廣泛的pH耐受性和良好的熱穩(wěn)定性，研究發(fā)現(xiàn)重組酶對殼聚糖和膠體幾丁質(zhì)的水解模式有明顯區(qū)別，可獲得不同類型和不同聚合度的氨基寡糖，為制備氨基寡糖的工業(yè)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

blchiA (WP_016886405) 經(jīng)密碼子優(yōu)化由上海捷瑞生物工程有限公司合成，并與載體pET-20b(+) 連接獲得pET-20b(+)-blchiA。表達(dá)載體pHY300PLK[10]和表達(dá)宿主菌B. subtilis WS9[10-11]由筆者實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建并保存，JM109感受態(tài)購于大連寶生物有限公司；無縫克隆試劑盒購于諾唯贊生物科技股份有限公司；蛋白濃度測定試劑盒購于碧云天生物公司；殼聚糖、殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品購于青島博智匯力生物科技有限公司；鹽酸氨基葡萄糖購于上海甄準(zhǔn)生物有限公司；膠體幾丁質(zhì)、N-乙酰氨基葡萄糖購于Sigma公司；其他分析純試劑均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LB培養(yǎng)基 (g·L-1)：酵母粉5.00，胰蛋白胨10.00，氯化鈉10.00；TB培養(yǎng)基 (g·L-1)：酵母粉24.00，甘油5.00，胰蛋白胨12.00，磷酸氫二鉀12.54，磷酸二氫鉀2.31。

1.2 方法

1.2.1 blchiA基因克隆與表達(dá)載體構(gòu)建

設(shè)計(jì)正向引物 (5'-CTGCGAGTGCTGAAGCCA TGGATAGCGGCAAAAATTATAAAATCATCGG-3')和反向引物 (5'-TTTTTATTACCAAGCTTTTATTCG CAGCCGCCGATAAG-3')，以 pET-20b(+)-blchiA為模板擴(kuò)增blchiA基因。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，回收目的基因片段。設(shè)計(jì)正向引物(5'-TAAAAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCCAA G-3') 和反向引物 (5'-CATGGCTTCAGCACTCGCA G-3') 通過PCR擴(kuò)增pHY300PLK載體，采用無縫克隆的方法將幾丁質(zhì)酶基因blchiA重組到質(zhì)粒p H Y 3 0 0 P L K載體上，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒pHY300PLK-blchiA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109中，挑選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行酶切驗(yàn)證并送測序。將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞B. subtilis WS9中，獲得枯草芽孢桿菌工程菌WS9/pHY300PLK-blchiA。

1.2.2 blchiA基因表達(dá)

將構(gòu)建的枯草芽孢桿菌工程菌接種至含有100 mg·L-1四環(huán)素(Tet)的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600達(dá)0.6～0.8時(shí)，調(diào)整溫度至33 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h，每隔6 h取樣。將菌液4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，適當(dāng)稀釋測定酶活。取OD600為5.0的菌體沉淀用一定體積的緩沖液重懸菌體，超聲破碎10 min (功率135 W，破碎3 s，間歇2 s)，將獲得的懸液12 000 r·min-1離心10 min，收集細(xì)胞破碎上清液。

1.2.3 重組酶BLCHIA的純化

利用親和層析鎳柱純化上述制備的重組蛋白。平衡液 (pH 7.4) 為 25 mmol·L-1Tris-HCl、500 mmol·L-1NaCl，0.45 μm濾膜過濾除菌；洗脫液 (pH 7.4)為 25 mmol·L-1Tris-HCl、500 mmol·L-1NaCl和300 mmol·L-1咪唑，0.45 μm 濾膜過濾除菌。梯度洗脫得到BLCHIA純化蛋白，將洗脫液超濾濃縮，用緩沖液復(fù)性并檢測幾丁質(zhì)酶活性，用Bradford方法測定其蛋白濃度，利用SDS-PAGE分析純化BLCHIA蛋白。

1.2.4 重組酶BLCHIA的膠體幾丁質(zhì)水解酶活

采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法[12-13]測定總還原糖量。以10 mg·mL-1的膠體幾丁質(zhì)為底物，250 μL膠體幾丁質(zhì)和150 μL磷酸檸檬酸鹽緩沖液(50 mmol·L-1) 在反應(yīng)溫度下預(yù)熱 10 min，加入100 μL適當(dāng)稀釋的發(fā)酵上清液/純酶液混合均勻，60 ℃水浴反應(yīng)1 h，加入2 mL的DNS混合均勻以終止反應(yīng)，在沸水中煮沸10 min，立即冷卻至室溫；以加入等量滅活的酶液作為空白對照。12 000 r·min-1離心5 min，取上清液于540 nm檢測吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。將60 ℃每分鐘釋放1 μmol GlcNAc所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位 (U)。

1.2.5 重組酶BLCHIA的殼聚糖水解酶活

以脫乙酰度＞95%的殼聚糖為反應(yīng)底物，在10 mg·mL-1的底物濃度和最適反應(yīng)條件下測定重組酶的酶活。350 μL的殼聚糖中加入50 μL稀釋的純酶液，混合均勻在60 ℃水浴反應(yīng)15 min，加入600 μL DNS混合均勻以終止反應(yīng)，在沸水中煮沸10 min，立即冷卻至室溫；以加入等量滅活的酶液為空白對照。12 000 r·min-1離心5 min，取上清液于540 nm檢測吸光度。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活。將60 ℃ 每分鐘釋放 1 μmol 氨基葡萄糖 (GlcN) 所需的酶量定義為1 U。

1.2.6 重組酶BLCHIA的酶學(xué)性質(zhì)研究

1) pH對重組酶BLCHIA酶活和穩(wěn)定性的影響。將重組酶BLCHIA用不同pH的50 mmol·L-1緩沖液稀釋 (pH為3.0的甘氨酸-鹽酸緩沖液、pH為4.0～8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液、pH為9.0～10.0的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液)，以1.2.4中的方法測定酶活，定義最高酶活為100%，計(jì)算不同pH下的相對酶活，確定重組酶的最適反應(yīng)pH。

將重組酶BLCHIA與不同pH的上述緩沖液混合，4 ℃保溫24 h，在最適pH下測定殘余酶活，以未處理的酶活為100%，計(jì)算各pH下重組酶的相對殘余酶活。

2) 溫度對重組酶BLCHIA酶活和穩(wěn)定性的影響。在不同溫度 (30～70 ℃) 和最適pH下以1.2.4中的方法測定BLCHIA的酶活。定義最高酶活為100%，計(jì)算不同溫度下的相對酶活，確定重組酶的最適反應(yīng)溫度。將重組酶在60 ℃保溫不同時(shí)間，在最適pH和溫度下測定酶活，以未處理的酶活為100%，計(jì)算保溫不同時(shí)間后重組酶的相對殘余酶活。

3) 金屬離子對重組酶BLCHIA活性的影響。選擇硫酸亞鐵 (FeSO4)、氯化鈣 (CaCl2)、氯化錳(MnCl2)、氯化銅 (CuCl2)、氯化鎳 (NiCl2)、氯化鎂 (MgCl2)、氯化鐵 (FeCl3)、氯化鋅 (ZnCl2)、氯化鈷 (CoCl2) 測定金屬離子對BLCHIA酶活性的影響。在最適pH下，將酶液與50 mmol·L-1的鹽溶液混合，確保最終反應(yīng)體系的金屬離子濃度為10 mmol·L-1，4 ℃ 保溫 24 h，以 1.2.4中的方法測定加入不同金屬離子的酶活，定義最高酶活為100%，計(jì)算加入金屬離子后重組酶的相對酶活。

1.2.7 重組酶BLCHIA水解特性測定

以脫乙酰度＞95%的殼聚糖、膠體幾丁質(zhì)為底物測定重組酶BLCHIA的水解特性。將純酶液按照3%的加量添加到30 mg·mL-1的殼聚糖溶液和膠體幾丁質(zhì)中，60 ℃、200 r·min-1反應(yīng)5 h，分別在反應(yīng)第15、第30、第60、第180、第300 分鐘時(shí)取樣，沸水浴10 min滅酶以終止反應(yīng)，采用薄層色譜法 (TLC) 鑒定產(chǎn)物組成。取5 μL標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在TLC Silica gel 60 F254高效硅膠板上每間隔10 mm進(jìn)行點(diǎn)樣，將硅膠板置于預(yù)飽和好的層析缸中，采用上行法展開。按V(正丁醇)∶V(甲醇)∶V(28% 氨水)∶V(水)=5∶4∶2∶1作為展開劑[14]，5%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，將充分展開后顯色的硅膠板置于95 ℃烘箱中觀察顯色情況。采用Shodex NH2P-50 4E色譜柱 (5 μm, 250 mm×4.6 mm) 進(jìn)行檢測，柱溫為30 ℃，乙腈-水為流動(dòng)相，以75%～50%的乙腈進(jìn)行梯度洗脫，流速設(shè)置為 1.0 mL·min-1，以10 μL 進(jìn)樣體積進(jìn)樣，檢測器為蒸發(fā)光散射檢測器。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

采用OriginPro 2021軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每組試驗(yàn)做3次平行，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 ()”表示。采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析 (P＜0.05)。

2 結(jié)果

2.1 表達(dá)載體構(gòu)建與重組酶的表達(dá)

使用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶對構(gòu)建的表達(dá)載體pHY300PLK-blchiA進(jìn)行酶切驗(yàn)證 (圖1)。在5 126和2 415 bp處有明亮的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。由金唯智生物技術(shù)有限公司測序確定表達(dá)載體pHY300PLK-blchiA構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌宿主菌WS9。將該重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵并每隔6 h取樣測定產(chǎn)酶情況 (圖2)。幾丁質(zhì)酶的酶活隨發(fā)酵時(shí)間延長不斷上升，48 h發(fā)酵上清液酶活可達(dá)0.72 U·mL-1。同時(shí)，檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)酵48 h的破碎上清液無幾丁質(zhì)酶酶活，表明幾丁質(zhì)酶BLCHIA已完全分泌到胞外。此外，本研究對將不含blchiA基因的空載體pHY300PLK轉(zhuǎn)化至WS9，搖瓶發(fā)酵后進(jìn)行了幾丁質(zhì)酶酶活的測定，未檢測到酶活。表明地衣芽孢桿菌來源的幾丁質(zhì)酶基因blchiA在枯草芽孢桿菌中成功表達(dá)。

圖1 pHY300PLK-blchiA表達(dá)載體的鑒定Fig. 1 Identification of pHY300PLK-blchiA expression vector

圖2 重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA搖瓶發(fā)酵過程的酶活Fig. 2 Enzyme activity of recombinant chitinase BLCHIA in shake flask fermentation

2.2 重組酶BLCHIA的純化

發(fā)酵上清經(jīng)過膜預(yù)處理后加載到親和層析柱上，經(jīng)梯度咪唑濃度對目的蛋白初步分離，SDSPAGE檢測結(jié)果見圖3。當(dāng)咪唑濃度為100 mmol·L-1時(shí)，洗脫液經(jīng)超濾濃縮，在66.4 kD左右處可見單一的目的蛋白條帶。經(jīng)測定，該條帶對10 mg·mL-1的膠體幾丁質(zhì)及脫乙酰度＞95%的殼聚糖均有水解活性。以膠體幾丁質(zhì)為底物測定BLCHIA純酶液的比活為 3.68 U·mg-1。

圖3 重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA的分離純化Fig. 3 Separation and purification of recombinant BLCHIA

2.3 重組酶性質(zhì)表征

2.3.1 pH對重組酶BLCHIA酶活和穩(wěn)定性的影響

重組酶在pH 4.0～9.0內(nèi)都有較高活性，在pH 6.0時(shí)，酶活達(dá)到最高 (圖4-a)，由此確定BLCHIA適合在中性偏弱酸的環(huán)境中進(jìn)行水解反應(yīng)；重組幾丁質(zhì)酶在pH 介于3.0～10.0內(nèi)能保持70%以上的活性，在pH介于4.0～8.0內(nèi)能保持90%以上的活性，在pH 7.0時(shí)酶活保持效果最佳 (圖4-b)，說明該酶具有較廣泛的pH耐受性。

圖4 重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA的最適pH (a) 和pH穩(wěn)定性 (b)Fig. 4 Optimal pH (a) and pH stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA

2.3.2 溫度對重組酶BLCHIA酶活和穩(wěn)定性的影響

提高反應(yīng)溫度可以增加酶促反應(yīng)速率，但溫度過高會破壞酶的三維結(jié)構(gòu)導(dǎo)致酶變性失活，而具有良好的熱穩(wěn)定性是酶制劑工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的基礎(chǔ)。重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA在溫度介于40～70 ℃內(nèi)均有一定活性，在50～60 ℃的活性較高，在60 ℃時(shí)酶活達(dá)到最高 (圖5-a)，由此確定BLCHIA的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，而溫度高于60 ℃酶活下降明顯。重組幾丁質(zhì)酶在60 ℃放置60 min時(shí)，殘留酶活為85%以上；60 min后BLCHIA開始變得不穩(wěn)定，酶活迅速降低；放置120 min后，酶活約為初始的50%；放置180 min殘留酶活約為初始的30% (圖5-b)。

圖5 重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA的最適溫度 (a) 和熱穩(wěn)定性 (b)Fig. 5 Optimal temperature (a) and thermal stability (b) of recombinant chitinase BLCHIA

2.3.3 金屬離子對重組酶BLCHIA活性的影響

金屬離子可能會影響蛋白分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或催化活性，適當(dāng)濃度的鹽可以減輕蛋白表面的靜電力，使蛋白不容易形成紊亂結(jié)構(gòu)，降低產(chǎn)生不可逆失活的概率[15]。加入 10 mmol·L-1銅離子 (Cu2+)可以使BLCHIA的酶活提至129.2%，亞鐵離子(Fe2+) 可以輕微提高BLCHIA的活性，而鎳離子(Ni2+)、鎂離子 (Mg2+)、鈣離子 (Ca2+)和鋅離子(Zn2+) 會在一定程度上抑制BLCHIA的活性，其中Ni2+和Mg2+將酶活降至40.2%和45.8%，抑制程度較明顯 (圖6)。有研究報(bào)道，Mg2+、Ca2+、Mn2+等多種金屬離子對幾丁質(zhì)酶活性均有明顯的抑制作用[16]，與其他報(bào)道的幾丁質(zhì)酶不同，重金屬離子Cu2+明顯提高了BLCHIA的活性。

圖6 金屬離子對重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA酶活的影響Fig. 6 Effect of metal ions on activity of recombinant chitinase BLCHIA

2.4 重組酶BLCHIA水解幾丁質(zhì)特性測定

通過薄層色譜分析了BLCHIA水解膠體幾丁質(zhì)的產(chǎn)物 (圖7)。反應(yīng)初期只有少量幾丁二糖生成，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，幾丁二糖逐漸累積并且沒有更大聚合度的幾丁寡糖生成。在以膠體幾丁質(zhì)為底物時(shí)，重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA僅表現(xiàn)出外切活性，能夠在幾丁質(zhì)末端以二聚體為單位切割β-1,4-糖苷鍵。

圖7 BLCHIA水解膠體幾丁質(zhì)的薄層色譜分析Fig. 7 TLC analysis of BLCHIA hydrolyzed colloidal chitin

2.5 重組酶BLCHIA水解殼聚糖特性測定

本研究首先測定了重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA純酶液對脫乙酰度＞95%的殼聚糖的水解活性，發(fā)現(xiàn)對殼聚糖的活性明顯高于膠體幾丁質(zhì)，在10 mg·mL-1的底物濃度和最適反應(yīng)條件下，以相同的酶活定義計(jì)算BLCHIA對殼聚糖的水解活性為4.52 U·mL-1，約為以膠體幾丁質(zhì)為底物酶活的4倍，說明BLCHIA更易和脫N-乙?；臍ぞ厶窍嗷プ饔茫焖俚厍懈顨ぞ厶擎湹奶擒真I。

進(jìn)一步通過薄層色譜檢測了殼聚糖的水解產(chǎn)物(圖8)，以3% BLCHIA加酶量在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)不同時(shí)間。反應(yīng)過程中有一系列不同聚合度的殼寡糖生成，在反應(yīng)初期只生成少量的殼二糖和殼三糖，以及較多的殼四糖、殼五糖。隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，殼二糖占比增加，殼五糖和殼六糖占比明顯減少，反應(yīng)3 h后，殼五糖和殼六糖基本消失，說明BLCHIA持續(xù)將高聚合度的殼寡糖水解成低聚合度的殼寡糖。

圖8 BLCHIA水解殼聚糖的薄層色譜分析Fig. 8 TLC analysis of BLCHIA hydrolyzed chitosan

本研究還將BLCHIA水解殼聚糖的產(chǎn)物進(jìn)行HPLC檢測，并采用面積歸一化法定量分析水解殼聚糖不同時(shí)間生成的各產(chǎn)物比例 (表1)。結(jié)果顯示，反應(yīng)30 min即有二糖到七糖生成，其中三糖到五糖的占比超過70%；反應(yīng)1 h以上，水解產(chǎn)物主要為二糖到五糖，其中殼三糖占比最高。反應(yīng)1～3 h，殼二糖的相對占比從17.35 %增至26.54%。根據(jù)殼四糖、殼五塘和殼二糖的相對占比可知BLCHIA持續(xù)將高聚合度的寡糖分解成低聚合的寡糖；水解后期生成的殼三糖的占比超過35%，但是氨基葡萄糖始終沒有明顯增加，占比不超過產(chǎn)物總量的1%。結(jié)果表明，根據(jù)實(shí)際需求通過控制反應(yīng)時(shí)間可獲得不同含量的聚合度為2～7的殼寡糖。

表1 BLCHIA水解殼聚糖的產(chǎn)物峰面積占比Table 1 Proportion of peak area of BLCHIA hydrolyzed chitosan %

3 討論

近年來，隨著對海洋生物資源的開發(fā)，利用海洋微生物來源的多糖降解酶對多糖進(jìn)行高效降解進(jìn)而獲得多種功能的低聚糖受到較高關(guān)注。幾丁質(zhì)及其衍生物是非常豐富且功能性很強(qiáng)的多糖資源，高表達(dá)量的幾丁質(zhì)降解酶對降解幾丁質(zhì)并生成有價(jià)值的氨基寡糖意義重大。如何獲得幾丁質(zhì)酶在食品安全菌中的高效表達(dá)并催化降解幾丁質(zhì)及其衍生物成為研究熱點(diǎn)。

目前已報(bào)道的海洋微生物來源的幾丁質(zhì)酶酶活普遍較低，嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophilia)幾丁質(zhì)酶QDC01在基礎(chǔ)發(fā)酵條件下所產(chǎn)粗酶液酶活為 0.21 U·mL-1[17]，優(yōu)化后最高酶活為 0.56 U·mL-1；海洋發(fā)光桿菌Photobacterium sp. LG-1幾丁質(zhì)酶經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化最大酶活為0.34 U·mL-1(根據(jù)文中數(shù)據(jù)，按照本文的酶活定義折算)[18]；近海海域的海泥中分離得到的擴(kuò)展短桿菌 (Brevibacterium linens)最適條件產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活為0.508 U·mL-1[19]。將分離到的幾丁質(zhì)酶在野生菌中表達(dá)，培養(yǎng)基成分復(fù)雜且發(fā)酵時(shí)間長達(dá)72～96 h。異源表達(dá)可以一定程度提高產(chǎn)量，根據(jù)實(shí)際需求選擇合適的表達(dá)宿主也很必要。大腸桿菌 (Escherichia coli)[20]雖然是使用最廣泛的表達(dá)宿主，但其周質(zhì)空間內(nèi)存在各種內(nèi)毒素，產(chǎn)品的安全性需要考量；畢赤酵母 (Pichia pastoris)[20]作為表達(dá)宿主雖然分泌效率高，但發(fā)酵周期長，其產(chǎn)品的安全性也需考量；枯草芽孢桿菌[21]具有非致病性的特點(diǎn)，安全性高，同時(shí)培養(yǎng)周期短，對于工業(yè)生產(chǎn)縮短發(fā)酵周期也具有重要意義，是一種目前食品、藥品、畜牧等行業(yè)生產(chǎn)各種工業(yè)用酶的理想表達(dá)宿主。本研究將幾丁質(zhì)酶基因blchiA在枯草芽孢桿菌中重組表達(dá)，重組幾丁質(zhì)酶的酶活為0.72 U·mL-1，具有較高的最適反應(yīng)溫度和良好的pH耐受性，具有工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的潛力。

海洋生物外殼 (蝦、蟹殼) 是甲殼素類海洋多糖的主要來源，高度結(jié)晶致密，難以降解。對結(jié)晶甲殼素具有高活性的幾丁質(zhì)酶主要存在于GH18家族，且具有由2個(gè)幾丁質(zhì)插入結(jié)構(gòu)域 (CID) 形成深的催化裂隙增強(qiáng)底物結(jié)合的結(jié)構(gòu)特征，部分酶還含有幾丁質(zhì)結(jié)合域 (CBD)。此外，一些GH20家族的酶也具有該活性。本研究中的幾丁質(zhì)酶BLCHIA屬于GH18家族糖苷水解酶，同時(shí)具有幾丁質(zhì)和殼聚糖水解活性，且對殼聚糖的水解活性更高。與米曲霉 (Aspergillus oryzae) 來源的β-乙酰己糖苷酶AoN-agase[22]相似，AoNagase是能同時(shí)水解殼聚糖和幾丁質(zhì)的GH20家族β-乙酰己糖苷酶，該酶對膠體幾丁質(zhì)的水解活性也低于殼聚糖。據(jù)報(bào)道，幾丁質(zhì)酶對不同底物的偏好性可能是CBD和結(jié)合位點(diǎn)附近的芳香族殘基使其能夠更有效地降解結(jié)晶幾丁質(zhì)，而缺乏CBD的幾丁質(zhì)酶可能偏好較少的結(jié)晶形式[23-25]。此外，催化區(qū)域中催化裂隙和底物結(jié)合位點(diǎn)的長度和深度似乎對底物特異性也有影響。在底物相互作用方面，氨基的氮原子比亞氨基的氮原子更能發(fā)生氫鍵作用，而乙酰氨基的氧原子更能與鄰近的殘基形成接觸[26]。本研究推斷BLCHIA對殼聚糖的水解能力優(yōu)于幾丁質(zhì)可能由酶與兩種底物可及性的差異所造成，有必要進(jìn)一步研究BLCHIA的三維結(jié)構(gòu)以及催化結(jié)構(gòu)域與其功能的關(guān)系。

本研究進(jìn)一步檢測了重組酶BLCHIA降解幾丁質(zhì)的產(chǎn)物。BLCHIA降解膠體幾丁質(zhì)主要生成幾丁二糖，體現(xiàn)出外切活性，產(chǎn)物類型單一易于分離純化。在醫(yī)療方面，幾丁二糖能防止術(shù)后組織粘連，是一種安全性高、易吸收和降解的生物材料。此外，幾丁二糖被證明能強(qiáng)烈誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶在某些微生物中的表達(dá)，如鏈霉菌和蘑菇[27-28]。

殼寡糖是甲殼素類海洋多糖資源化利用的主要產(chǎn)品類型，目前其酶解制備主要存在降解效率低、酶解產(chǎn)物特異性差的問題。未經(jīng)降黏處理的高濃度的殼聚糖酶解效果普遍較差[29-30]，原因在于殼聚糖黏度過高影響酶的擴(kuò)散，會限制酶與底物的有效接觸。琚洋洋[31]報(bào)道的殼聚糖酶以30 mg·mL-1未降黏處理的殼聚糖為底物，58 U·g-1底物的加酶量在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)3 h才能達(dá)到水解終點(diǎn)；朱玉霞等[32]報(bào)道了一種商品殼聚糖酶以30 mg·mL-1未降黏處理的殼聚糖為底物，10 U·g-1底物的加酶量在最適反應(yīng)條件下反應(yīng)6 h生成的還原糖量基本趨于平緩。重組酶BLCHIA對殼聚糖有較強(qiáng)水解能力，在最適反應(yīng)條件下，以16.1 U·g-1底物加酶量與30 mg·mL-1未降黏處理的殼聚糖反應(yīng)15 min，殼聚糖的黏度顯著降低，同時(shí)生成多種聚合度的殼寡糖，在反應(yīng)1 h生成的寡糖總量便基本達(dá)到平衡，在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)氨基寡糖中有明顯優(yōu)勢。

上述結(jié)果表明重組幾丁質(zhì)酶對殼聚糖降解體現(xiàn)出內(nèi)切活性，可得到多種聚合度的殼寡糖。不同聚合度的殼寡糖在生理功能和活性上體現(xiàn)出差別。隨著聚合度的增大，殼二糖到殼五糖降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇和甘油三酯的作用逐漸減弱[31]；殼寡糖的抗腫瘤活性與其分子量有關(guān)，與低分子量的殼寡糖相比，高分子量的殼寡糖對小鼠 (Mus musculus) S180細(xì)胞具有更高的抑制活性[33]；因?yàn)榱u基、氨基等活性基團(tuán)的作用，殼寡糖具有很強(qiáng)的抗氧化活性，通過比較幾種低分子量殼寡糖的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)殼二糖和殼三糖比氨基胍、維生素B和一種維生素E類似物有更強(qiáng)的羥自由基清除活性[34]；此外，殼聚糖及其衍生物具有廣譜抗菌活性，研究表明隨分子量的升高，殼寡糖對金黃色葡萄球菌的抑制效果增強(qiáng)[35]。后期通過控制反應(yīng)時(shí)間及優(yōu)化加酶量有望獲得主產(chǎn)物為特定聚合度的殼寡糖。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了枯草芽孢桿菌工程菌株，并實(shí)現(xiàn)了幾丁質(zhì)酶基因blchiA在枯草芽孢桿菌中的重組表達(dá)。該重組幾丁質(zhì)酶BLCHIA具有廣泛的pH耐受性 (pH 3.0～9.0) 和較高的最適反應(yīng)溫度 (60 ℃)，適用于工業(yè)應(yīng)用。重組酶對殼聚糖和膠體幾丁質(zhì)的水解模式有明顯區(qū)別，有望通過條件優(yōu)化得到不同類型的氨基寡糖制品，對高效利用甲殼素類多糖具有較高的實(shí)際價(jià)值。