李曉宇， 于燕妮**， 郭莉莉

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550004； 2.貴陽市第一人民醫(yī)院 病理科， 貴州 貴陽 550002)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，阿爾茨海默病(alzheimer's disease，AD)是癡呆癥的最常見類型，占癡呆病例的60%～70%[1]。AD的臨床表現(xiàn)隨著時間的推移而惡化：從早期健忘到語言、方向和行為的逐漸遺忘，以及后期嚴重的記憶力減退和一些身體機能障礙，直至最終死亡[2]。在AD病理生理改變中，存在明顯的氧化應激、線粒體異常和嚴重的突觸損傷和神經元死亡。研究表明，通過N-甲基-D-天冬氨酸受體(N-methyl-D-aspartate receptor subtype, NMDARs)調控的興奮性谷氨酸能神經傳遞通路對于神經元的突觸可塑性和存活至關重要[3-4]，但是過量的NMDARs激活引發(fā)興奮性毒性級聯(lián)反應促進細胞死亡，與AD發(fā)病的早期密切相關[5]。燈盞乙素(Scutellarin, Scu)是燈盞花中提取的藥效成分，近年來的研究表明Scu有保護神經細胞的作用[6]。本課題組對Scu進行深入研究，觀察到Scu能改善AD小鼠的癡呆癥狀[7]，并利用同位素標記相對和絕對定量技術得到了Scu調控阿爾茨海默病雙轉基因小鼠(APPswe/PS1dE9)腦組織谷氨酸神經系統(tǒng)傳遞通路相關蛋白的重要線索[8]。鑒于谷氨酸神經系統(tǒng)關鍵突觸元件NMDARs與AD的發(fā)病機制密切相關，本研究推測Scu可能通過調控NMDARs參與對神經細胞的保護作用，并采用Aβ1-42寡聚體作用于具有人神經元形態(tài)和特征的人源性神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞，誘導AD神經元損傷的細胞模型，并通過檢測NMDARs功能性亞基NMDAR1蛋白及mRNA表達情況，進一步探究Scu在Aβ寡聚體毒性背景下對NMDAR1的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用Scu(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度98%，批號為ZL20161012037)，Aβ1-42寡聚體(強耀生物科技有限公司，純度95.27%，貨號為04010011526)，人源性神經母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞株(中國科學院昆明細胞生物研究所，編碼為KCB2006107YJ)，NMDAR1抗體(博士德)，ROS、 T-SOD測定試劑盒(南京建成)，BIO-RAD電泳設備(美國Bio-Rad)，實時熒光定量PCR儀(ABI)，細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher)。

1.2 研究方法

1.2.1藥物處理 粉末狀β1-42寡聚體用預冷的六氟異丙醇(HFIP)充分溶解并分裝，使終濃度為1 mmol/L，風干、-80 ℃保存，使用前加不含酚紅的F12培養(yǎng)基充分溶解，4 ℃冰箱放置24 h后離心取上清使用[9]。 Scu精確稱量分裝后置4 ℃冰箱備用，使用前用高糖DMEM充分稀釋并用0.22微孔注射濾器過濾。

1.2.2細胞培養(yǎng)、分組及處理 SH-SY5Y細胞置于完全培養(yǎng)液(高糖 ∶血清 ∶抗生素比例為9 ∶1 ∶0.1)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為5% CO2、37 ℃，2 d換液1次，4 d傳代，取處于對數(shù)生長期細胞進行實驗[10]。細胞分為對照組、Aβ寡聚體處理組、Scu處理組和Scu+Aβ寡聚體處理組[11]，對照組常規(guī)培養(yǎng)不加任何藥物處理。根據(jù)課題組前期采用細胞增值及毒性實驗(CCK-8法)篩選確定本研究所用藥物濃度：Scu處理組10 μmol/L Scu 作用48 h，Aβ寡聚體處理組給予1 μmol/L Aβ寡聚體作用24 h，Scu+Aβ寡聚體處理組先予10 μmol/L Scu 預處理24 h、再加入1 μmol/L Aβ作用24 h[12]。收集細胞進行檢測。

1.2.3倒置相差顯微鏡觀穿細胞 將培養(yǎng)的活細胞放在倒置相差顯微鏡載物臺上，用40×放大鏡觀察對比各組細胞密度、輪廓胞質及分裂情況，并進行拍照記錄。

1.2.4蛋白印跡(Western blot)法檢測NMDAR1蛋白表達 將1.2.2步驟收集的各組細胞分別清洗3次，取適量總蛋白提取液與細胞作用，收集總蛋白，測定濃度；采用SDS-PAGE分離目標蛋白，進一步電轉至甲醇預處理的聚偏二氟乙烯膜；先后與蛋白一抗(β-actin稀釋比例1 ∶200、NMDAR1稀釋比例1 ∶500)和二抗(二抗稀釋比例1 ∶50 000)作用，顯影系統(tǒng)觀察結果 。用Bandscan分析灰度值，結果以目標蛋白條帶與β-action條帶的灰度比值作為目標蛋白的相對表達量。

1.2.5實時熒光定量PCR檢測NMDAR1 mRNA表達水平 RNA提?。?收集細胞，Trizol試劑裂解細胞，加氯仿分層，收集水相層RNA。RNA沉淀：加異丙醇搖均沉淀RNA。RNA清洗：收集沉淀，用無RNase的75%乙醇清洗2次；RNA干燥，溶解。RNA濃度測定：取2 μL溶解后的RNA用微量分光光度計測定OD260、OD280，換算OD260/OD280比值，比值在1.8～2.0滿足實驗要求。RNA濃度=OD260×稀釋倍數(shù)×40 mg/L，RNA于-80 ℃冰箱保存。逆轉錄cDNA(RNA上樣質量4.884 μg)。實時熒光定量PCR檢測：cDNA做6倍稀釋，反應體系為稀釋后cDNA 4 μL，F(xiàn)orward Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，Reverse Primer (10 μmol/L) 0.4 μL，SYBR Green Master Mix 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 0.4 μL，H2O 4.8 μL；引物序列為β-actin(Forward 5′-AGCGAG CATCCCCCAAAGTT-3′，Reverse 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3′，285 bp)， NMDAR1(Forward 5′-CCGTG AGAGACAACAAGCTG-3′，Reverse 5′-ATACCGAACCCACGTCTTGT-3′，227 bp)；反應條件為50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min，95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，40 cycles。繪制溶解曲線，最終數(shù)據(jù)以2-ΔΔCt進行分析。

1.2.6熒光探針法測定各組細胞氧自由基(ROS)水平 用PBS稀釋DCFH-DA探針，調整探針濃度為10 μmol/L。收集細胞，用稀釋好的DCFH-DA重懸細胞，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min，每隔5 min混勻，使探針與細胞充分接觸。多功能酶標儀檢測波長525 nm處熒光值，ROS熒光值與ROS的含量成正比。

1.2.7黃嘌呤氧化酶法測定各組細胞超氧化物歧化酶(T-SOD)的活力 收集各組細胞，反復凍融裂解細胞、離心，收集上清液。取96孔板，設定對照孔(蒸餾水)和測定孔(細胞上清)，依次加入工作液后混勻，37 ℃孵育40 min，各管加入顯色劑2 mL孵育10 min，于波長550 nm處測吸光度值并按公式換算T-SOD活力。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 形態(tài)學觀察

如圖1所示，倒置顯微鏡下可見對照組細胞密度較大，多數(shù)細胞呈梭形，少數(shù)細胞呈三角形，細胞輪廓清晰，樹突分支較多，胞質豐富，可見分裂細胞；與對照組比較，Scu處理組細胞密度、輪廓、胞質、分裂細胞的形態(tài)變化不大，但三角形分化的細胞增加，突觸縮短變粗；與對照組比較，Aβ寡聚體處理組梭形細胞及三角形細胞明顯減少，部分細胞突起縮短變細，樹突分支減少，胞質減少，細胞分裂少見；Scu+Aβ寡聚體處理組細胞密度及分支較Aβ寡聚體處理組增加，胞質較Aβ寡聚體處理組豐富。

注：A為對照組，B為Scu處理組，C為Aβ寡聚體處理組，D為Scu+Aβ寡聚體處理組。圖1 各組細胞培養(yǎng)48 h的形態(tài)學觀察(倒置顯微鏡，×40)Fig.1 Cells of each group after 48 h of cell culture (inverted microscope,×40)

2.2 NMDAR1蛋白表達

與對照組比較，Scu處理組細胞NMDAR1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細胞NMDAR1蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細胞中NMDAR1蛋白表達減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2和表1。

注：1-4分別為對照組，Aβ寡聚體處理組， Scu處理組，Scu+Aβ處理組。圖2 NMDAR1蛋白相對表達量Fig.2 Relative expression volume of NMDAR1 protein

2.3 NMDAR1 mRNA表達

與對照組比較，Scu處理組細胞NMDAR1 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細胞NMDAR1 mRNA表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細胞NMDAR1 mRNA表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組細胞NMDAR1蛋白及mRNA表達Tab.1 NMDAR1 protein and mRNA expression

2.4 ROS含量

與對照組比較，Scu處理組細胞ROS含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細胞ROS含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細胞ROS含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.5 T-SOD含量

與對照組比較，Scu處理組細胞T-SOD含量差異無統(tǒng)計學意(P>0.05)，Aβ寡聚體處理組細胞T-SOD含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與Aβ寡聚體處理組比較，Scu+Aβ寡聚體處理組細胞T-SOD含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組細胞ROS和T-SOD的含量Tab.2 ROS and T-SOD content of cells

3 討論

AD的發(fā)生機制復雜，其中基因突變學說、Aβ毒性學說、Tau蛋白異常修飾學說、氧化應激學說、線粒體障礙學說、炎癥學說等已成為當前研究的焦點[13]，但很少有研究關注AD的電生理特性，尤其是突觸可塑性。突觸可塑性是參與學習和記憶的重要機制，學習和記憶是高級神經活動的重要組成部分[14]，研究表明NMDARs通過參與長時程增強和長時程減弱的形成調控突觸的可塑性和神經細胞的活動[15]。NMDARs是谷氨酸興奮信號傳遞的關鍵蛋白之一，具有3種主要亞基：NMDAR1(NR1)，NMDAR2(NR2A-D)和NMDAR3(NR3)[16]。功能性NMDARs是由至少一個NR1亞基與兩個或多個NR2A-D亞基組成的四聚體，有時還包括NR3亞基，NMDAR1在整個大腦和整個發(fā)育的各個階段均表達[17]。盡管NMDARs活性是大腦生理功能所必須，但過量的NMDARs介導Ca2+超載并促進神經細胞死亡是AD發(fā)生神經退行性變的病理基礎[18]。

谷氨酸是大腦主要的興奮性神經遞質，在突觸傳遞正常的情況下，NMDARs的離子通道被Mg2+阻滯，并且僅在短時間內被谷氨酸激活，介導Ca2+適量進入細胞，參與突觸可塑性和細胞存活。在病理條件下，比如突觸間隙谷氨酸濃度病理性升高、NMDARs表達增加以及能改變靜息膜電位的其他干擾均可能會引起NMDARs的過度激活，NMDARs的過度激活介導大量Ca2+流入神經元，從而觸發(fā)各種可能導致細胞壞死或凋亡的過程[19]，包括介導線粒體的Ca2+超載和半胱氨酸蛋白酶及一氧化氮合酶(nNOS)等Ca2+依賴性酶激活，導致一氧化氮(NO)產量增加[20]。線粒體Ca2+超載會破壞膜的電化學梯度，從而使ATP合成失效，呼吸鏈故障，導致抗氧化與氧化失衡，T-SOD減少，ROS增加，例如NO與超氧陰離子(O2·-)反應生成過氧亞硝酸鹽(ONOO)，后者又可以氧化脂質、蛋白質和DNA[21-22]。上述過程是NMDARs介導的興奮性毒性級聯(lián)反應，NMDARs是興奮性毒性過程中重要的Ca2+通道，NMDARs 介導Ca2+超載損傷細胞是AD發(fā)病的重要機制之一[23-24]。

其他學者和本課題組前期研究均觀察到Aβ寡聚體與神經元作用后增加Ca2+流入神經元介導細胞損傷[25-26]，相同實驗條件下，本研究采用Aβ寡聚體與SH-SY5Y細胞孵育后，觀察到NMDAR1 mRNA及蛋白表達均增加，推測Aβ寡聚體可能調控了NMDAR1蛋白的轉錄程序，介導NMDAR1蛋白表達增加，Aβ寡聚體處理組還觀察到細胞的氧化應激指標ROS增加和T-SOD降低，倒置顯微鏡下見細胞減少和突觸縮短變細，提示Aβ寡聚體可能參與調控功能性亞基NMDAR1的表達介導Ca2+超載損傷神經細胞。美金剛是目前世界公認的可用于中重度AD患者改善記憶和認知缺陷的藥物[27-28]，其治療作用的關鍵在于可與NMDARs的非競爭性結合，研究表明美金剛與NMDARs通道為低親和力結合，抑制NMDARs通道的同時逐步解離失效以保留了部分NMDARs的生理功能，從而增強了美金剛的耐受性并且降低不良事件發(fā)生[29]。本研究用Scu預處理后，下調了Aβ寡聚體處理組NMDAR1蛋白的轉錄和表達，缺乏NMDAR1亞基的NMDARs不能正常介導Ca2+內流，但本研究結果提示Scu并不是完全中斷NMDAR1表達，仍然保留NMDAR1的活性，有類似于“美金剛”改善神經元損傷的作用，Scu+Aβ寡聚體處理組還觀察到ROS減低和T-SOD增加，提示細胞的氧化應激得到改善，其次該組細胞密度及樹突分支較Aβ寡聚體處理組增加，佐證了本研究上述推測。所以本研究認為Scu可能參與下調功能性亞基NMDAR1蛋白的轉錄、翻譯，從而對抗Aβ寡聚體的毒性作用。