林 震，郭潔梅，陳 鵬，肖 艷，張 鵬，張英杰，蘇友新*

（1.福建中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.福建衛(wèi)生職業(yè)技術學院，福建 福州 350101；3.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州 350122）

90%膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）患者伴有不同程度的滑膜炎癥，且滑膜炎癥貫穿KOA發(fā)病的始終，其炎癥進展與KOA的病情發(fā)展呈正相關［1］。課題組前期從動物組織層面展開了研究，發(fā)現(xiàn)具有“痹痿同治”功效的壯骨健膝方可有效抑制兔KOA滑膜炎癥［2-4］。滑膜巨噬細胞作為KOA滑膜炎中的主要參與者［5］，可用于壯骨健膝方抗炎功效的研究。血清藥理學是以機體含藥血清代替藥物干預細胞的實驗方法，被廣泛應用于中藥復方的機制研究［6］。然而不同濃度的含藥血清對細胞的影響是多樣的［7］，高濃度血清在起效的同時可能會對細胞產生毒性作用，低濃度血清可能由于藥效物質濃度較低，達不到起效濃度，從而出現(xiàn)假陰性結果。因此在開展含藥血清干預細胞的相關研究時，有必要對效應濃度進行摸索。故本研究通過CCK8法和ELISA法研究壯骨健膝方含藥血清干預LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應的效應濃度，為后續(xù)相關實驗提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與細胞 3月齡普通級新西蘭大白兔12只，體質量（2.0±0.25）kg，由上海市松江區(qū)松聯(lián)實驗動物場提供，許可證編號：SCXK（滬）2017-0008。委托福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心代購并飼養(yǎng)，許可證號：SYXK（閩）2014-0006。兔膝滑膜巨噬細胞由上海青旗生物技術發(fā)展有限公司提供，貨號：BFN2101831。

1.2 實驗藥物 壯骨健膝方組成：骨碎補15 g，杜仲9 g，川牛膝12 g，生地黃15 g，獨活6 g，雞血藤15 g，秦艽9 g，徐長卿9 g，土鱉蟲6 g。上述藥材均購于福建中醫(yī)藥大學國醫(yī)堂，并經福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合研究院曾建偉副研究員鑒定，符合《中華人民共和國藥典》要求。全方中藥飲片置于600 mL水中浸泡20 min后，用武火煎煮至沸騰，然后轉文火煎煮15 min，倒出藥液。再次加水400 mL，煎煮30 min。將2次所煎得的藥液混合，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮成含生藥1 g/mL的壯骨健膝方藥液備用。

1.3 實驗試劑 DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號：AE29163339）；胎牛血清（澳洲ExCell Bio公司，批號：11G362）；烏拉坦（上海源葉生物科技有限公司，批號：Z28N10Y104506）；脂多糖（中國Biosharp公司，貨號：BS007）；兔白介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質金屬蛋白酶-3（MMP-3）和MMP-13 ELISA試劑盒（江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號：2112023、2112015、2112030、2112033）；CCK8試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，批號：16J29C60）。

1.4 實驗儀器 ELX800型全自動酶標儀（美國Bio-Tek公司）；IC-1000型Countstar細胞計數(shù)儀（上海睿鈺生物科技有限公司）；DMIL/DFC295型倒置相差顯光學微鏡（德國LEICA公司）；TDZ4A-WS型低速離心機（湖南湘儀儀器有限公司）；E163302型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific公司）；RE-52AA型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

2 方法與結果

2.1 含藥血清與空白血清制備 12只新西蘭大白兔，隨機分為壯骨健膝方組6只和空白組6只，根據(jù)前期研究并參照人與動物體質量折算的等效劑量［8］，壯骨健膝方組按4.58 mL/（kg·d）予壯骨健膝方藥液灌胃，空白組予等體積生理鹽水灌胃，分上下午2次，持續(xù)3 d。于末次給藥后1 h，應用20%烏拉坦（5 mL/kg）對兔進行腹腔注射麻醉，待角膜反射消失后行腹主動脈采血，全血靜置于4℃冰箱4 h后，2 500 r/min離心30 min，分離血清，將同組血清混合，56℃水浴滅活30 min，用0.22μm過濾器過濾，分裝即得。

2.2 不同濃度的血清完全培養(yǎng)液制備 取離心管，依次加入細胞培養(yǎng)液、壯骨健膝方含藥血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液，配制成5%、10%、15%、20%、25%壯骨健膝方含藥血清完全培養(yǎng)液（以下簡稱含藥完培），同法配制相同濃度空白血清完全培養(yǎng)液（以下簡稱空白完培）和10%胎牛血清完全培養(yǎng)液（以下簡稱普通完培），于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊用LSD檢驗，方差不齊時采用Games-Howell檢驗，不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)檢驗。

2.4 CCK8法篩選含藥血清干預濃度實驗 取生長狀況良好的兔膝滑膜巨噬細胞，按7×103個細胞/孔的密度接種于96孔板，隨機分為對照組、空白血清組及含藥血清組，分別采用普通完培、含藥完培（5%、10%、15%、20%、25%）和空白完培（5%、10%、15%、20%、25%）培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)液，加入10%CCK8溶液避光孵育2 h，使用酶標儀在450 nm處測定每孔的吸光度。實驗結果顯示，5%、10%、15%含藥血清組細胞活性與同濃度下空白血清組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故篩選出對細胞沒有毒性的3個含藥完培濃度（5%、10%、15%）作為后續(xù)實驗的干預濃度，見表1。

表1 不同血清培養(yǎng)液干預后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較（±s）

表1 不同血清培養(yǎng)液干預后兔膝滑膜巨噬細胞活性比較（±s）

注：與同濃度空白血清組比較，1）P＜0.05。

組別對照組空白血清組含藥血清組n6 66666 66666含藥血清干預濃度/%-5 10 15 20 25 5 10 15 20 25細胞活性/%100.00±0.00 99.86±0.75 98.69±1.28 98.58±1.69 97.32±0.89 99.67±1.12 99.16±1.03 99.68±1.25 98.13±0.87 88.26±0.791）87.79±1.361）

2.5 篩選LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞致炎時間實驗 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個細胞/孔的密度接種于24孔板，隨機分為空白組和LPS組。空白組加入普通完培，LPS組加入含1.0μg/mL的LPS培養(yǎng)液，分別培養(yǎng)12、24、36、48 h后，收集各組細胞上清液，ELISA法檢測IL-1β、TNF-α含量。結果表明各組別上清液中于各檢測時間點均可見IL-1β、TNF-α的分泌。與空白組比較，LPS組各時間點的兔膝滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量均明顯升高（P＜0.05）；LPS組內各時間點比較，刺激12 h后滑膜巨噬細胞上清液中IL-1β、TNF-α的含量最高（P＜0.05），見表2。結合文獻［9］，以IL-1β、TNF-α含量較高的12 h作為后續(xù)實驗LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞致炎的時間。

表2 空白組和LPS組不同時間干預后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較（±s）

表2 空白組和LPS組不同時間干預后細胞上清液IL-1β、TNF-α含量比較（±s）

注：與相同時間的空白組比較，1）P＜0.05；與12 h LPS組比較，2）P＜0.05；與24 h LPS組比較，3）P＜0.05；與36 h LPS組比較，4）P＜0.05。

組別空白組LPS組干預時間12 h 24 h 36 h 48 h 12 h 24 h 36 h 48 h IL-1β/（ng/L）12.55±1.01 13.05±1.51 13.90±1.34 11.50±0.33 41.20±1.341）26.70±0.671）2）24.34±0.331）2）19.29±3.371）2）3）4）TNF-α/（pg/L）284.89±10.00 292.90±26.01 280.89±18.01 290.90±4.00 410.99±40.031）356.94±22.011）2）346.94±8.011）2）338.93±12.011）2）

2.6 ELISA法檢測各組細胞上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量 兔膝滑膜巨噬細胞以1×105個/孔接種于6孔板，隨機分為空白組、模型組和5%、10%、15%含藥血清組，空白組添加10%空白完培，模型組和5%、10%、15%含藥血清組經1.0μg/mL的LPS培養(yǎng)液致炎12 h后，模型組添加10%空白完培，5%、10%、15%含藥血清組分別添加5%、10%、15%含藥完培，24 h后收集各組細胞上清液，ELISA法檢測各組上清中IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量。結果顯示，各組均可見IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13的分泌，與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，10%、15%含藥血清組IL-1β、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量均明顯降低（P＜0.05）。見表3。

表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（n＝3，±s）

表3 各組兔膝滑膜巨噬細胞上清液IL-1β、TNF-α、MMP-3及MMP-13含量比較（n＝3，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別空白組模型組5%含藥血清組10%含藥血清組15%含藥血清組IL-1β/（ng/L）51.56±2.56 96.43±2.731）93.13±0.87 77.25±1.962）74.43±1.592）TNF-α/（pg/mL）456.88±11.25 587.67±8.561）582.33±15.22 526.94±18.522）519.17±15.892）MMP-3/（μg/L）18.97±1.57 44.35±1.011）41.95±1.67 33.87±0.892）31.86±1.362）MMP-13/（μg/L）130.61±3.49 220.94±4.011）217.18±3.78 173.13±4.212）168.50±2.712）

3 討論

KOA的發(fā)病雖以關節(jié)軟骨退變?yōu)橹?，但其病理變化并不僅限于軟骨局部［10-11］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，滑膜炎癥與KOA的發(fā)生和發(fā)展密切相關，滑膜炎癥過程中各種因素反復刺激滑膜組織，促使炎癥因子、基質金屬蛋白酶等被大量釋放，它們在加重滑膜炎癥反應的同時，又反復刺激關節(jié)軟骨，造成軟骨的損害，進一步加劇KOA的進展［12-14］。

壯骨健膝方是蘇友新教授根據(jù)KOA“痹痿同病”病機特點所創(chuàng)立的效驗方，該方由骨碎補、杜仲、川牛膝等藥物組成，具有補肝腎、強筋骨、祛風濕、止痹痛之功用，臨床療效顯著［2-3］。本研究采用血清藥理學的方法，通過LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應，研究壯骨健膝方含藥血清抑制滑膜炎癥的效應濃度。結果發(fā)現(xiàn)5%、10%、15%壯骨健膝方含藥血清對兔膝滑膜巨噬細胞無毒性作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，10%、15%壯骨健膝方含藥血清可有效抑制LPS誘導的兔膝滑膜巨噬細胞炎性因子IL-1β和TNF-α以及基質金屬蛋白酶MMP-3和MMP-13的生成，發(fā)揮抑制滑膜炎癥的功效，為該方含藥血清的效應濃度，且二者抗炎作用相當。而5%壯骨健膝方含藥血清無顯著的抗炎作用，推測可能是血清濃度較低，血清中的有效成分濃度尚未達到起效水平所致。

綜上所述，本實驗結果表明10%、15%壯骨健膝方兔含藥血清為干預LPS誘導兔膝滑膜巨噬細胞炎癥反應的效應濃度，由于二者抗炎作用相近，為節(jié)約血清成本，故建議后續(xù)研究采用10%含藥血清更為適宜。