黃勝男， 張 穎， 王如然， 馮艷華， 黃浩然， 陳 君

(中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院南區(qū)， 北京 102618)

骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)是一種常見的骨骼疾病，多見于絕經(jīng)后婦女和老年男性。該病以骨量減少、骨微觀結(jié)構(gòu)退化為病理特征，易導(dǎo)致脆性骨折的嚴(yán)重后果[1]。當(dāng)前針對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療藥物主要基于鈣制劑、維生素D以及雙磷酸鹽類藥物[2]。中醫(yī)認(rèn)為，骨質(zhì)疏松屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨枯”“骨空”等范疇。《景岳全書》左歸丸是經(jīng)典的補(bǔ)腎壯骨名方，由熟地黃、山藥、枸杞、山茱萸、鹿角膠、龜板膠、菟絲子、川牛膝組成，具有滋陰補(bǔ)腎、填精益髓之效，臨床用藥歷史悠久，如采用經(jīng)方左歸丸治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松[3]、肝腎不足證骨質(zhì)疏松[4]等。課題組前期在臨床與實(shí)驗(yàn)研究中，應(yīng)用左歸丸治療腎虛型骨質(zhì)疏松療效確切[5，6]。當(dāng)前針對(duì)左歸丸的作用機(jī)制研究取得了一定的進(jìn)展。有報(bào)道顯示，其可通過(guò)調(diào)控AMPK/mTOR信號(hào)通路促進(jìn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠骨形成[7]。另有研究顯示，左歸丸對(duì)于去勢(shì)骨質(zhì)疏松模型大鼠的Wnt/β-catenin通路具有一定的調(diào)控作用[8]。此外，OPG/RANKL信號(hào)通路[9]以及鈣轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路[10]也被證明是左歸丸的潛在作用機(jī)制，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制的相關(guān)性還有待進(jìn)一步闡明。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物分子、作用靶點(diǎn)、疾病三者的生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，預(yù)測(cè)藥物對(duì)疾病作用機(jī)制的新興學(xué)科[11]，并以其具有的整體性、系統(tǒng)性的學(xué)科特點(diǎn)，與傳統(tǒng)中醫(yī)整體觀、辨證論治的個(gè)性化治療高度契合，因此被廣泛用于中藥及其復(fù)方藥效成分與作用機(jī)制相關(guān)性的預(yù)測(cè)。本研究將運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探討左歸丸多靶點(diǎn)、多途徑治療骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，以闡釋其“補(bǔ)腎壯骨”治法的生物學(xué)基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 左歸丸中藥信息收集及靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建

從《中華人民共和國(guó)藥典》一部(2020年版)(簡(jiǎn)稱《藥典》)查找左歸丸所含8味中藥(熟地黃、山藥、枸杞子、鹿角膠、龜甲膠、川牛膝、菟絲子)的歸經(jīng)信息；以中藥的拼音名為檢索詞，從TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)和/或BATMAN-TCM(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索該中藥化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)。TCMSP的篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30%、類藥性(drug-likeness, DL)≥0.18[12]，剔除沒(méi)有靶標(biāo)信息的化學(xué)成分，從 Uniprot(http://www.uniprot.org/)將相應(yīng)靶標(biāo)蛋白名轉(zhuǎn)換為基因名；BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選標(biāo)準(zhǔn)為Score cutoff ≥20、P值≤0.05，收集化學(xué)成分和靶標(biāo)[13]。

1.2 骨質(zhì)疏松相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建

以“osteoporosis”為檢索詞，搜集DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.disgenet.org/)[14]和Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.drugbank.ca/)[15]中治療骨質(zhì)疏松的潛在靶點(diǎn)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選標(biāo)準(zhǔn)為Score_gda≥0.4；Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中“targets”名稱通過(guò) Uniprot轉(zhuǎn)換為基因名。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

利用Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建和分析左歸丸治療骨質(zhì)疏松的中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)。中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是將中藥拼音名和相應(yīng)歸經(jīng)分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，分析網(wǎng)絡(luò)參數(shù)(連接度)；靶標(biāo)-疾病網(wǎng)絡(luò)是導(dǎo)入高質(zhì)量蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)HINT(High-quality INTeractomes)中物種為人的高質(zhì)量二元蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)作為背景網(wǎng)絡(luò)[16]，把骨質(zhì)疏松疾病基因映射到HINT網(wǎng)絡(luò)，提取疾病基因網(wǎng)絡(luò)，再將左歸丸靶標(biāo)基因與疾病基因取交集后，映射到疾病基因網(wǎng)絡(luò)，提取網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和邊，保留最大連通片，再進(jìn)行Community cluster(Glay)分析并分解成網(wǎng)絡(luò)子模塊。

1.4 重要靶標(biāo)功能富集分析

采用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)平臺(tái)分別對(duì)左歸丸靶標(biāo)分布較多的網(wǎng)絡(luò)子模塊中節(jié)點(diǎn)基因進(jìn)行功能富集分析[17]。選擇蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，分析網(wǎng)絡(luò)子模塊蛋白功能；通過(guò)京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路分析，獲得左歸丸治療骨質(zhì)疏松的重要信號(hào)通路。

2 結(jié)果

2.1 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析

左歸丸所含的8味中藥歸肝(Liver)、腎(Kidney)、脾(Spleen)、心(Heart)、肺(Lung)經(jīng)(見圖1)，網(wǎng)絡(luò)連接度排名前2位的是腎經(jīng)、肝經(jīng)，分別為8、7，即左歸丸所含的8味中藥全部都?xì)w腎經(jīng)，7味歸肝經(jīng)，2味歸脾經(jīng)，各有1味中藥歸肺經(jīng)和心經(jīng)。

注：① 圓形節(jié)點(diǎn)代表歸經(jīng)，方形節(jié)點(diǎn)代表中藥；②圖形面積越大連接度越大圖1 中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 左歸丸含化合物及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)

山藥、枸杞子、川牛膝、菟絲子的成分及靶點(diǎn)信息來(lái)源于TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)，鹿角膠和龜甲膠來(lái)源于BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)，熟地黃來(lái)源于TCMSP和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)。左歸丸復(fù)方中包含73個(gè)化合物537個(gè)靶標(biāo)(見表1)。

表1 左歸丸包含中藥所含化合物及潛在靶標(biāo)個(gè)數(shù)

2.3 骨質(zhì)疏松相關(guān)基因

以“osteoporosis”為檢索詞，從DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)獲得366個(gè)靶點(diǎn)基因，從Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得50個(gè)基因，其中9個(gè)基因同存在于該2個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)，去重后共獲得407個(gè)可能與骨質(zhì)疏松相關(guān)的靶點(diǎn)基因，與左歸丸靶標(biāo)基因數(shù)據(jù)庫(kù)取交集獲得51個(gè)重復(fù)基因(見圖2)。DisGeNET、Drugbank、左歸丸靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫(kù)三者交集3個(gè)基因，即ESR1、ESR2、FDPS。

圖2 左歸丸靶標(biāo)與骨質(zhì)疏松基因數(shù)據(jù)庫(kù)韋恩圖

2.4 左歸丸靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析

Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建左歸丸靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，取最大連通片進(jìn)行分析(見圖3)。該網(wǎng)絡(luò)有118個(gè)節(jié)點(diǎn)，聚成7個(gè)子模塊，不同子模塊代表功能密切相關(guān)蛋白之間相互作用下完成特定的分子功能。左歸丸靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)主要分布在子模塊1、2、3。通過(guò)計(jì)算受控分衡量左歸丸對(duì)靶標(biāo)作用的強(qiáng)弱，即中藥-化合物靶向某靶標(biāo)的數(shù)量[16]，網(wǎng)絡(luò)中共有11個(gè)節(jié)點(diǎn)的受控分大于或等于5。從靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖可見，受控分排名靠前的節(jié)點(diǎn)是PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等。

注：藍(lán)色節(jié)點(diǎn)為骨質(zhì)疏松疾病基因，紅色節(jié)點(diǎn)為左歸丸治療骨質(zhì)疏松的靶標(biāo)基因；節(jié)點(diǎn)大小與受控分?jǐn)?shù)成正比圖3 左歸丸靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 左歸丸重要靶標(biāo)的功能富集分析

將左歸丸靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖主要的3個(gè)子模塊(見圖3)節(jié)點(diǎn)基因分別輸入DAVID中進(jìn)行功能富集分析。

在DAVID中選擇蛋白相互作用(Protein Interactions)功能聚集分析(Functional Annotatin Clustering)，模塊1中28個(gè)基因，聚成runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(Runt-related transcription factor 1，RUNX1)、維生素D受體(vitamin d receptor，VDR)及叉頭盒蛋白O3(forkhead box protein O3，F(xiàn)OXO3)蛋白之間相互作用網(wǎng)絡(luò)。模塊2中25個(gè)基因，聚成血小板衍生生長(zhǎng)因子B(platelet derived growth factor subunit b，PDGFB)、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin 1，THBS1)、血小板衍生生長(zhǎng)因子A(platelet derived growth factor subunit a，PDGFA)等蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；模塊3中20個(gè)基因，聚成有絲分裂原激活蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、有絲分裂原激活蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3,MAPK3)等蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

在DAVID中選擇通路分析(Pathways)中KEGG_PATHWAY分析，3個(gè)模塊共獲得70個(gè)信號(hào)通路，刪除其他疾病通路(如結(jié)腸直腸癌、Ⅰ型人T淋巴細(xì)胞白血病病毒感染等)，且P-value<1×10-2，共16個(gè)信號(hào)通路，其中子模塊1、2、3分別有4個(gè)、5個(gè)、7個(gè)信號(hào)通路(見表2)。

表2 左歸丸靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)子模塊靶標(biāo)富集的KEGG信號(hào)通路比較

3 討論

隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)在生命科學(xué)中的應(yīng)用和系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)這一研究領(lǐng)域進(jìn)展迅速，它基于系統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，通過(guò)構(gòu)建“活性成分-靶標(biāo)-疾病”相互作用網(wǎng)絡(luò)，探討藥物和疾病之間復(fù)雜關(guān)系的研究方法[18]。近年來(lái)廣泛應(yīng)用于中藥方劑配伍規(guī)律、中藥藥效等研究中[19]。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析了左歸丸對(duì)骨質(zhì)疏松的潛在藥效機(jī)制。首先，基于《藥典》中中藥及歸經(jīng)信息，構(gòu)建中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)；結(jié)合疾病基因數(shù)據(jù)庫(kù)和中藥活性成分及靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)重要靶標(biāo)干預(yù)的生物學(xué)通路，揭示左歸丸“補(bǔ)腎壯骨”用藥依據(jù)和多成分、多靶點(diǎn)分子機(jī)制。

中藥-歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中，左歸丸君藥熟地黃入肝、腎經(jīng)，滋腎填精益髓；山藥歸脾、肺、腎經(jīng)，養(yǎng)肝滋腎，平補(bǔ)三陰；山茱萸、枸杞子歸肝、腎經(jīng)，補(bǔ)腎益精；龜甲膠歸肝、腎、心經(jīng)，鹿角膠歸肝、腎經(jīng)，二者為血肉有情之品，峻補(bǔ)精髓，5味中藥共為臣藥；菟絲子歸肝、腎、脾經(jīng)，川牛膝歸肝、腎經(jīng)，二者益肝腎、強(qiáng)腰膝、健筋骨，為佐藥。諸藥合用，組成入肝腎經(jīng)為核心的歸經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，為詮釋左歸丸“補(bǔ)腎壯骨”的科學(xué)內(nèi)涵奠定基礎(chǔ)。

左歸丸的靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)是一個(gè)多靶點(diǎn)參與的復(fù)雜交錯(cuò)網(wǎng)絡(luò)，其中PTGS2、PIK3CG、PPARG、AR、BAX等是受控分排名靠前，可能是左歸丸的關(guān)鍵靶標(biāo)。研究顯示，PTGS2是前列腺素生成的限速酶，前列腺素可誘導(dǎo)核因子-κβ受體活化因子配體的表達(dá)，促進(jìn)破骨細(xì)胞分化[20]；PPARG抑制骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化[21]；AR是雄激素受體，雄激素與成骨細(xì)胞表面AR結(jié)合促進(jìn)成骨分化[224]；促凋亡因子BAX與骨細(xì)胞凋亡相關(guān)[23]，可見左歸丸可能通過(guò)多靶點(diǎn)影響成骨、破骨細(xì)胞分化及骨細(xì)胞凋亡等發(fā)揮治療作用。

重要靶標(biāo)的功能富集分析顯示，左歸丸可能作用于多個(gè)信號(hào)通路：①靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)子模塊1主要涉及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β,TGF-beta)、雌激素(Estrogen)、甲狀腺激素(Thyroid hormone)等信號(hào)通路，它們均與成骨分化有關(guān)。Thyroid hormone信號(hào)通路中甲狀腺激素影響堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)的表達(dá)，從而影響骨鈣蛋白和成骨細(xì)胞分化[24]；TGF-β信號(hào)通路可通過(guò)下游Smad通路調(diào)節(jié)成骨分化和骨形成[25]；Estrogen信號(hào)通路可利用雌激素調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨分化[26]；②靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)子模塊2主要涉及磷脂酰肌醇3激酶和蛋白激酶B(Phosphatidylinositol 3-kinase and protein kinase B,PI3K-Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Ras相關(guān)蛋白1(Ras-related protein 1，Rap1)等信號(hào)通路。PI3K-Akt信號(hào)通路是調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的信號(hào)通路網(wǎng)中心，具有調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞功能的雙重作用[279]；MAPK信號(hào)通路主要包含細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(Extracellular regulated kinase 1/2, ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5(extracellular signal regulated kinase,ERK5)通路，可激活各自不同的轉(zhuǎn)錄因子且相互聯(lián)系，誘導(dǎo)成骨分化和骨形成[28]；Rap1屬Ras超家族小分子量G蛋白，骨組織、骨細(xì)胞有RAS分布，一些調(diào)控骨代謝的信號(hào)分子(如TGF-β) 促進(jìn)Ras與GTP結(jié)合及活化，啟動(dòng)Ras-MAPK磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活ERK1/2，調(diào)控下游骨細(xì)胞活動(dòng)[29]；③靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)子模塊3主要涉及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(Neurotrophin)、鞘脂類(Sphingolipid)、破骨細(xì)胞分化(Osteoclast differentiation)等信號(hào)通路。Osteoclast differentiation通路也與PI3K-Akt、NF-κβ、MAPK等多個(gè)信號(hào)通路密切相關(guān)，調(diào)控破骨細(xì)胞的分化與成熟；Neurotrophin是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)相關(guān)信號(hào)通路，Sphingolipid是鞘脂類信號(hào)通路，它們與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性尚不明確?？梢?，左歸丸可能作用于多個(gè)信號(hào)通路，且不同的信號(hào)通路之間還存在廣泛的相互作用及復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，為左歸丸作用機(jī)制研究帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。

本研究為提高網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法預(yù)測(cè)結(jié)果的可信度，分別納入TCMSP、BATMAN-TCM 2個(gè)中藥數(shù)據(jù)庫(kù)和Drugbank、DisGeNET 2個(gè)疾病靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)，視數(shù)據(jù)量大小取兩類數(shù)據(jù)庫(kù)的交集或并集構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)。在左歸丸靶標(biāo)篩選中發(fā)現(xiàn)，ESR1、ESR2、FDPS在DisGeNET、Drugbank、TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中均有收錄，提示它們作為左歸丸潛在標(biāo)靶可信度非常高。ESR1、ESR2編碼雌激素受體，介導(dǎo)雌激素發(fā)揮生物學(xué)作用的核內(nèi)生物大分子；FDPS是雙膦酸鹽類藥物關(guān)鍵靶點(diǎn)。研究表明，左歸丸含藥血清能上調(diào)成骨細(xì)胞MC3T3-E1雌激素受體蛋白表達(dá)[30]，能協(xié)同唑來(lái)膦酸抗骨質(zhì)疏松[31]。左歸丸是否具有雌激素和雙膦酸鹽樣雙重作用，在實(shí)驗(yàn)研究中值得關(guān)注。