譚海,員林娜,盧南巡,張中華,常景玲,2,李志剛,2*

1(河南科技學院 生命科技學院,河南 新鄉(xiāng),453003) 2(現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南 新鄉(xiāng),453003)

環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)作為生物體內(nèi)重要的生理活性物質,主要用于心腦血管疾病、白血病、肝腎功能損傷、糖尿病以及皮膚病等的治療,并普遍作為飼料添加劑和藥物中間體使用[1]。利用發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP時,培養(yǎng)基中含有嘌呤類物質能夠激活補救途徑,直接利用前體物質用于產(chǎn)物合成,相比于從頭合成途徑,補救途徑包含的酶促反應少,同時減少了ATP消耗,更有利于cAMP的合成[2]。前期研究表明,通過補加2 g/L次黃嘌呤,cAMP生產(chǎn)效率提高了39.10%,但產(chǎn)量提高幅度不大,發(fā)酵周期明顯縮短,發(fā)酵后期細胞活性及產(chǎn)物合成速率很低[3]。有報道表明,次黃嘌呤可以誘導節(jié)桿菌合成大量黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)[4]。XOD可以將次黃嘌呤分解為尿酸,降低次黃嘌呤對產(chǎn)物的轉化率,并伴隨活性氧(reactive oxygen species,ROS)的大量產(chǎn)生。菌體處于高濃度ROS條件下,會導致細胞組分受損,代謝活性下降,影響產(chǎn)物的合成[5]。因此,抑制XOD活性,有利于提高次黃嘌呤轉化率,提高細胞代謝活性,進而促進cAMP發(fā)酵合成。

目前,臨床上用于抑制XOD的藥物主要包括別嘌呤醇、非布司他等[6]。研究表明,黃酮類[7]和多酚類[8]物質對XOD活性也具有較好的抑制效果。陳雨涔等[9]進行體外酶活性抑制實驗,槲皮素含量達到15.11 mg/kg時,XOD活性抑制率達到90%。李雪巖等[10]通過灌胃100 mg/kg木犀草素,使高尿酸壞血癥小鼠體內(nèi)XOD活性抑制率達到70%以上。李昕卓等[11]通過添加橙皮苷、山奈酚、高良姜素等多酚類物質,有效抑制了XOD活性,其中橙皮苷和高良姜素效果最為顯著。

本研究針對補救途徑發(fā)酵生產(chǎn)cAMP過程中,產(chǎn)物濃度和次黃嘌呤轉化率低下的問題,通過添加XOD抑制劑,減少次黃嘌呤無效利用及ROS合成,使更多的次黃嘌呤用于產(chǎn)物合成,提高cAMP產(chǎn)量和次黃嘌呤轉化率,為利用補救途徑進行嘌呤核苷酸類物質的高效合成提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

節(jié)桿菌Arthrobactersp.CCTCC 2013431,中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 儀器

LDZX-75KBS高壓滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;BIOTECH-7BG機械攪拌式發(fā)酵罐,上海保興生物設備有限公司;UV—2800紫外分光光度計,上海舜宇恒平科學公司;VCX-150超聲波細胞破碎儀,美國SONICS公司;3K30離心機,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司;1260infinity II高效液相色譜儀,安捷倫科技(中國)有限公司;F-180熒光分光光度計,天津港東科技股份有限公司;1510-04319C酶標儀,賽默飛世爾科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖10,牛肉膏10,蛋白胨10,尿素4,NaCl 3,酵母膏10,pH 7.2,121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖50,蛋白胨5,尿素10,KH2PO410,K2HPO410,生物素0.3,CoCl20.01,次黃嘌呤2,NaF 0.1,pH 7.4,121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。

1.2.2 培養(yǎng)方法

搖瓶培養(yǎng)：250 mL搖瓶中裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。接入培養(yǎng)24 h的種子液,接種量10%(體積分數(shù),下同),搖床培養(yǎng)72 h,溫度30 ℃,轉速220 r/min。

發(fā)酵罐培養(yǎng)：7 L機械攪拌式發(fā)酵罐裝載5 L發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。初始pH 7.4,接種量10%,培養(yǎng)溫度30 ℃,初始攪拌轉速400 r/min,通風量0.1 vvm,視溶氧變化調(diào)節(jié)轉速和通風量。

1.2.3 XOD抑制劑添加方法

搖瓶實驗:分別添加槲皮素、木犀草素、葛根素、橙皮苷及別嘌呤醇等抑制劑,每種抑制劑設置6、12、18、24和30 mg/L 5個添加量,每個條件3個平行試驗,確定最佳抑制劑及其添加量。設置0、6、12、18、24、30和36 h等7個不同時間,均添加12 mg/L槲皮素,每個條件3個平行試驗。以上黃酮類物質難溶于水,加入少量NaOH配制成0.9 g/L的堿性母液,根據(jù)濃度要求向培養(yǎng)基中添加相應體積母液。

發(fā)酵罐實驗:對照批次,發(fā)酵18 h補加1 g/L(發(fā)酵液,下同)次黃嘌呤,36 h補加1 g/L次黃嘌呤;添加槲皮素批次,發(fā)酵18 h添加12 mg/L槲皮素和1 g/L次黃嘌呤,36 h補加1 g/L次黃嘌呤。槲皮素與次黃嘌呤均難溶于水,加入少量NaOH溶解后,根據(jù)實驗條件要求添加。

1.2.4 分析方法

1.2.4.1 葡萄糖測定

采用DNS法測定。發(fā)酵液于10 000 r/min離心5 min,上清液稀釋50倍后,以1∶2體積比與DNS溶液混合,沸水浴反應5 min,迅速冷卻后稀釋至原濃度的1/5測定540 nm下吸光度,根據(jù)標準曲線計算葡萄糖濃度。

1.2.4.2 菌體濃度測定

將發(fā)酵液稀釋至原濃度的1/20后,用600 nm波長下吸光度表示菌體濃度。

1.2.4.3 關鍵酶活性測定

XOD、6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)以及過氧化氫酶(catalase,CAT)使用試劑盒(Solarbio)進行測定,酶活性單位均以U/mg蛋白表示。5 mL發(fā)酵液4 ℃離心10 min收集菌體,加入1 mL細胞破碎液,冰浴條件下超聲破碎5 min,功率40%,超聲3 s,間隔6 s,經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液測定酶活性,具體操作步驟見試劑盒說明書。

腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase,AC)和腺苷琥珀酸合成酶(succino-AMP synthetase,sAMPase)測定：細胞破碎方法同上,酶活性單位：U/mg蛋白。反應體系及具體操作參考文獻[12]。

1.2.4.4 細胞活性測定

使用Alamar Blue細菌活性檢測試劑盒測定,發(fā)酵液離心收獲菌體,磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered solution,PBS)洗滌懸浮,配制為OD600=1.0的細胞懸液,加入Alamar Blue,37 ℃培養(yǎng)60 min后測定熒光強度,激發(fā)波長540 nm,發(fā)射波長590 nm,具體操作方法見說明書。

1.2.4.5 尿酸含量測定

采用試劑盒(Solarbio)進行測定。發(fā)酵液10 000 r/min離心5 min,保留上清液用于尿酸測定,具體操作步驟見說明書,單位mg/L。

1.2.4.6 cAMP和次黃嘌呤含量測定

高效液相色譜法測定。發(fā)酵液12 000 r/min離心5 min,取2 mL上清液經(jīng)0.45 μm孔徑水相膜過濾后待測。色譜條件：Lichrospher C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫30 ℃。水相：體積分數(shù)0.6%磷酸溶液用三乙胺調(diào)至pH 6.6,V(水相)∶V(甲醇)=70∶30,進樣量2 μL,流速0.8 mL/min,檢測波長254 nm,詳見文獻[13]。

1.2.4.7 ROS和丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量測定

ROS采用化學熒光法測定。發(fā)酵液低溫離心收獲菌體,PBS洗滌3次,配制為OD600=1.0的細胞懸液,加入2,7-二氯熒光雙乙酸鹽探針,搖床中37 ℃、200 r/min反應40 min,12 000 r/min離心5 min收集菌體,PBS洗滌3次去除多余探針,重新懸浮后測定熒光強度,激發(fā)波長485 nm,發(fā)射波長525 nm。

MDA采用巴比妥酸法進行測定。發(fā)酵液離心收獲菌體,破碎方法同1.2.4.3,具體方法參見文獻[14]。蛋白濃度采用考馬斯亮藍染色法測定[12]。

1.2.4.8 次黃嘌呤轉化率和cAMP合成速率測定

次黃嘌呤轉化率和cAMP合成速率計算如公式(1)(2)所示：

(1)

(2)

式中：YP/HX,cAMP對次黃嘌呤的轉化率,g/g;RP,cAMP合成速率,g/(L·h);t,發(fā)酵時間,h;c(P)和c(HX)分別表示cAMP和次黃嘌呤的質量濃度,g/L;參數(shù)取3次測定值的平均值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel分析數(shù)據(jù),Origin 2019軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 不同XOD抑制劑對cAMP發(fā)酵生產(chǎn)的影響

利用補救途徑發(fā)酵生產(chǎn)cAMP時,XOD大量生成,將部分次黃嘌呤分解為尿酸,同時伴隨ROS的產(chǎn)生,導致次黃嘌呤轉化率低下和cAMP產(chǎn)量難以提高。在250 mL搖瓶中,進行了添加不同XOD抑制劑的cAMP發(fā)酵試驗,結果如表1所示。通過添加不同的XOD抑制劑,cAMP產(chǎn)量均得到一定程度的提升,其中槲皮素和木犀草素作用效果較為明顯。在單獨添加6 mg/L木犀草素和12 mg/L槲皮素條件下,cAMP質量濃度分別達到3.20和3.42 g/L,與對照(不添加抑制劑)相比,分別提高80.80%和93.22%,cAMP產(chǎn)量得到極顯著提高(P<0.01)。

表1 不同XOD抑制劑對cAMP發(fā)酵產(chǎn)量的影響 單位:g/L

確定槲皮素為最佳XOD抑制劑,并在搖瓶中進行了不同時間添加12 mg/L槲皮素的cAMP發(fā)酵實驗。如圖1所示,cAMP產(chǎn)量呈現(xiàn)先升后降的趨勢,在18 h達到3.37 g/L的最大值。因此,確定18 h添加12 mg/L槲皮素為發(fā)酵罐實驗條件。

圖1 槲皮素添加時間對cAMP發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig.1 Effects of quercetin addition time on cAMP fermentation in shake flasks

2.2 槲皮素提高次黃嘌呤轉化率和cAMP發(fā)酵性能

在7 L發(fā)酵罐上進行添加12 mg/L槲皮素的cAMP發(fā)酵實驗,對能夠反映發(fā)酵性能的主要參數(shù)進行測定和計算,結果如圖2所示。添加槲皮素批次的cAMP產(chǎn)量達到5.33 g/L,比對照提高了33.92%,產(chǎn)物合成得到顯著提高。兩批次中cAMP合成速率均呈現(xiàn)先升后降的變化規(guī)律,在發(fā)酵18～50 h,添加槲皮素批次的合成速率相比于對照具有顯著的提高,36 h提高幅度達到46.53%(圖2-c)。然而,由于槲皮素的添加,分別作為碳源和前體的葡萄糖與次黃嘌呤的消耗量卻都有一定程度的減少,尤其是次黃嘌呤消耗量比對照減少了0.57 g/L,表明利用補救途徑發(fā)酵合成cAMP時,槲皮素促進了葡萄糖和次黃嘌呤向產(chǎn)物的轉化。圖2-d是次黃嘌呤轉化率的計算結果,與對照相比,18 h添加槲皮素后,次黃嘌呤轉化率得到明顯提高,36 h轉化率達到3.03 g/g,提高了29.92%,表明槲皮素顯著提高了次黃嘌呤的轉化率,使更多次黃嘌呤通過補救途徑用于cAMP合成,其他代謝途徑受到抑制,減少了次黃嘌呤的浪費。

a-600 nm下吸光度及葡萄糖濃度;b-cAMP及次黃嘌呤濃度;c-cAMP合成速率;d-次黃嘌呤轉化率圖2 槲皮素對cAMP發(fā)酵整體性能的影響Fig.2 Effects of quercetin on cAMP fermentation performance conducted in a 7 L bioreacter

尾氣中CO2含量與細胞呼吸代謝直接相關,反映了細胞呼吸代謝的強弱。如圖3所示,兩批次中CO2含量和細胞活性均呈現(xiàn)先升后降的趨勢,發(fā)酵18 h后,與對照相比,添加槲皮素批次的CO2含量與細胞活性均得到顯著提高,表明槲皮素能夠一定程度上提高菌體活性和呼吸代謝水平,有利于cAMP的高效合成。

a-細胞活性;b-CO2含量圖3 槲皮素對細胞活性及尾氣中CO2含量的影響Fig.3 Effects of quercetin on cells viability and CO2 contents

2.3 槲皮素對cAMP合成途徑中關鍵酶活性的影響

XOD能夠分解次黃嘌呤形成尿酸并釋放ROS,造成次黃嘌呤損失,降低轉化率,還會影響細胞代謝活性[15]。如圖4-a所示,槲皮素有效抑制了XOD活性,發(fā)酵50 h時XOD活性僅為對照的29.15%,這就解釋了添加槲皮素批次中次黃嘌呤轉化率、細胞活性及CO2含量等提高的原因。G6PDH是磷酸戊糖途徑中的關鍵酶,酶活性強弱直接反映戊糖磷酸途徑的代謝強度。如圖4-b,與對照相比,槲皮素顯著提高了G6PDH活性,36 h時G6PDH活性提高17.68%,更多的碳流分配到磷酸戊糖途徑,為產(chǎn)物合成提供物質基礎。sAMPase和AC是cAMP合成的關鍵酶,直接影響cAMP合成。測定結果表明,與對照相比,添加槲皮素批次的sAMPase和AC活性均得到顯著提高,36 h分別達到4.07和4.60 U/mg,比對照分別提高43.81%和33.89%。這表明槲皮素有效抑制了XOD的活性,減少了次黃嘌呤的無效損耗,同時使更多碳流進入磷酸戊糖途徑,進而有效促進cAMP合成。

2.4 槲皮素對代謝副產(chǎn)物尿酸合成的影響

發(fā)酵液中尿酸含量變化反映了次黃嘌呤經(jīng)XOD分解的情況。對添加槲皮素批次發(fā)酵液中尿酸含量進行測定。如圖5所示,18 h添加槲皮素后,尿酸合成速率明顯下降,積累量明顯低于對照批次,終濃度僅為對照的63.75%。表明槲皮素抑制XOD活性,減少了次黃嘌呤的分解,大幅降低副產(chǎn)物尿酸合成,進而提高了次黃嘌呤的轉化率。

a-XOD活性;b-G6PDH活性;c-sAMPase活性;d-AC活性圖4 槲皮素對cAMP合成相關途徑中關鍵酶活性的影響Fig.4 Effect of quercetin on activities of key enzymes presented in cAMP biosynthesis pathways 注：*表示與對照相比差異極顯著(P<0.01)(下同)

圖5 槲皮素對發(fā)酵液中尿酸含量的影響Fig.5 Effect of quercetin on uric acid contents in fermentation broth

2.5 槲皮素對細胞內(nèi)ROS和MDA水平的影響

XOD分解次黃嘌呤過程中,伴隨ROS大量產(chǎn)生。ROS積累會對細胞組分造成損傷,導致蛋白質構象發(fā)生改變,細胞膜脂質過氧化,引起細胞代謝功能障礙甚至死亡[16]。MDA含量反映了細胞膜過氧化程度。ROS和MDA的測定結果如圖6所示。整個發(fā)酵周期內(nèi),添加槲皮素批次的ROS和MDA含量均明顯低于對照批次,36 h ROS的熒光強度和MDA含量分別為對照批次的63.92%和76.38%。表明槲皮素抑制了XOD活性,減少了ROS生成和細胞成分損傷,提高了細胞代謝活性,促進了產(chǎn)物合成。

a-ROS熒光強度;b-MDA含量圖6 槲皮素對ROS、MDA含量的影響Fig.6 Effect of quercetin on intracellular ROS and MDA contents

2.6 槲皮素對抗氧化酶活性的影響

氧化脅迫條件下,微生物會大量生成SOD與CAT,消除過量ROS,維持胞內(nèi)氧化還原平衡[17]。對添加槲皮素批次的SOD及CAT進行測定,結果如圖7所示。添加槲皮素批次的SOD和CAT活性明顯低于對照批次,36 h時2種酶活性分別為對照的84.75%和75.10%。這表明槲皮素有效減少了胞內(nèi)ROS的合成與積累,降低了氧化脅迫水平,僅需要較少的抗氧化酶即可維持氧化還原平衡。

a-SOD活性;b-CAT活性圖7 槲皮素對SOD和CAT活性的影響Fig.7 Effect of quercetin on intracellular SOD and CAT activities

3 結論

通過添加12 mg/L槲皮素,cAMP產(chǎn)量達到5.33 g/L,與對照相比提高了33.92%,同時次黃嘌呤轉化率也得到明顯提升,發(fā)酵性能得到顯著提高。關鍵酶活性分析結果表明,槲皮素有效抑制XOD的活性,減少了次黃嘌呤的分解,G6PDH、sAMPase與AC活性均得到顯著提高,更多碳流分配到磷酸戊糖途徑用于產(chǎn)物合成,副產(chǎn)物尿酸含量的顯著減少也表明次黃嘌呤的分解得到有效抑制。ROS、MDA以及抗氧化酶活性的測定結果表明,槲皮素抑制XOD的活性,顯著降低了ROS含量,緩解氧化脅迫對細胞組分造成的損傷,同時增強細胞活性,使cAMP產(chǎn)量得到顯著提升。