徐曉靜,余筱敏,李俊惺,劉景良,王茜,常景玲

（1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽110866）

添加次黃嘌呤對環(huán)磷酸腺苷發(fā)酵產(chǎn)苷的影響

徐曉靜1,2,余筱敏3,李俊惺1,2,劉景良1,2,王茜1,2,常景玲1,2

（1.現(xiàn)代生物育種河南省協(xié)同創(chuàng)新中心,河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,遼寧沈陽110866）

研究了由次黃嘌呤發(fā)酵制造cAMP時發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤質(zhì)量濃度及次黃嘌呤添加方式對cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷的影響.結(jié)果表明：發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤采用一次性添加和分兩批添加,經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng),次黃嘌呤質(zhì)量濃度在0.018 g/L時cAMP產(chǎn)苷最高達6.86 g/L,在此條件下,次黃嘌呤分量兩次添加cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷最高可達7.23 g/L.過量的次黃嘌呤對菌種生長有抑制作用,發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤只有在最適的質(zhì)量濃度下才能有效地提高cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷水平,且采用次黃嘌呤分批添加更有利于cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷.

環(huán)磷酸腺苷；次黃嘌呤；發(fā)酵；產(chǎn)苷

環(huán)磷酸腺苷（cAMP）是細胞內(nèi)參與調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝和生物學(xué)功能的重要物質(zhì),是生命信息傳遞的“第二信使”[1].在體內(nèi)可以促進心肌細胞的存活,增強心肌細胞抗損傷、抗缺血和缺氧能力,改善心功能.在臨床上主要用于治療心功能不全、心絞痛和心肌梗死.它是人體內(nèi)廣泛存在的一種具有生理活性的重要物質(zhì),由三磷酸腺苷在腺苷環(huán)化酶催化下生成,能調(diào)節(jié)細胞的多種功能活動.作為激素的第二信使,在細胞內(nèi)發(fā)揮激素調(diào)節(jié)生理機能和物質(zhì)代謝作用,能改變細胞膜的功能.此外,對糖、脂肪代謝、核酸、蛋白質(zhì)的合成調(diào)節(jié)等起著重要的作用[2-3].以發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP,是目前眾多生產(chǎn)方法中最環(huán)保、最高效的方法[4].生產(chǎn)cAMP的方法可分為發(fā)酵法和酶法.發(fā)酵法可進一步分為補救合成途經(jīng)和從頭合成途經(jīng),補救合成途經(jīng)是目前cAMP產(chǎn)率最高的方法[5-6].本文通過補救合成途經(jīng)由次黃嘌呤制造cAMP,重點研究了發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤濃度對cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌種：節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）A.sp01,河南科技學(xué)院生命科技學(xué)院發(fā)酵工程實驗室保存菌株.

儀器：LXJ-IIC/B高速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）、LDZX-50KBS高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SW-CJ-2FD雙人垂直凈化工作臺（蘇凈集團安泰公司制造）、ZWF-2112搖床（上海智城分析儀器制造有限公司）、UV-5800紫外分光光度計（上海元析科技儀器有限公司）.

試劑：cAMP標準品,葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、氯化鈉、尿素、酵母膏、生物素、次黃嘌呤、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈷、硫酸鎂、氟化鈉、瓊脂、鹽酸、氫氧化鈉均為化學(xué)純.

斜面培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基含葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、NaCl 0.3 g、尿素0.4 g、酵母膏1 g、瓊脂2 g,用蒸餾水補至100 mL,調(diào)pH至7.0,121℃、高壓蒸汽滅菌30 min.

種子培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基含葡萄糖1 g、蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、NaCl 0.3 g、尿素0.4 g、酵母膏1 g,用蒸餾水補至100 mL,調(diào)pH至7.2,121℃、高壓蒸汽滅菌30 min.

發(fā)酵培養(yǎng)基：每100 mL培養(yǎng)基含葡萄糖5 g,蛋白胨0.5 g,氯化鈷0.001 g,生物素0.03 g,硫酸鎂0.5 g,尿素1 g,磷酸二氫鉀1 g,氟化鈉0.01 g,磷酸氫二鉀1 g,次黃嘌呤0.2 g,用蒸餾水補至100 mL,調(diào)pH至7.5,121℃、高壓蒸汽滅菌30 min.

1.2 試驗方法

1.2.1 菌體的活化配制斜面種子培養(yǎng)基,121℃,30 min滅菌.在超凈工作臺接菌種于斜面培養(yǎng)基上,于恒溫培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)24 h.可多次進行活化,至菌種活性穩(wěn)定.

1.2.2 種子培養(yǎng)配制搖瓶種子培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中裝30 mL培養(yǎng)基,121℃,30 min滅菌.將上述活化的斜面菌株在超凈工作臺上接種,30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)24 h.

1.2.3 搖瓶發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基,250 mL錐形瓶裝30 mL培養(yǎng)基,121℃,30 min滅菌.按接種量15%將搖瓶種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、190 r/min培養(yǎng)72 h.

1.2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤對cAMP產(chǎn)苷的影響配制含次黃嘌呤的發(fā)酵培養(yǎng)基,次黃嘌呤的質(zhì)量濃度分別為0、0.006、0.008、0.010、0.012、0.014、0.016、0.018、0.020、0.022、0.024 g/L,250 mL錐形瓶裝30 mL培養(yǎng)基,121℃、30 min滅菌.按接種量15%將搖瓶種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基中,30℃、190 r/min培養(yǎng)72 h[8].

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳次黃嘌呤質(zhì)量濃度驗證性實驗根據(jù)上述試驗結(jié)果確定發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳次黃嘌呤質(zhì)量濃度,在最佳質(zhì)量濃度條件下,連續(xù)做7批驗證性發(fā)酵,考查cAMP的產(chǎn)苷水平.

1.2.6 發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤添加方式對cAMP產(chǎn)苷的影響發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤質(zhì)量濃度在最佳的條件下,采取將次黃嘌呤一次性添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中和分兩次添加,即初始發(fā)酵培養(yǎng)基添加1/2次黃嘌呤量,發(fā)酵36 h時再添加1/2次黃嘌呤量.30℃、190 r/min培養(yǎng)72 h.

1.2.7 發(fā)酵液中cAMP含量的測定采用紫外分光光度計法測定cAMP的質(zhì)量濃度[7].精確配制質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g/L的標準品溶液,在波長260 nm條件下,測定標準品溶液的吸光度,制作標準曲線.將發(fā)酵液于離心機中,3 000 r/min離心15 min,取上清液于紫外分光光度計上260 nm波長測定發(fā)酵液中cAMP的質(zhì)量濃度.

2 結(jié)果與分析

2.1 cAMP標準曲線

精確配制質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 g/L的cAMP標準品溶液,其標準曲線見圖1.

圖1 cAMP標準曲線Fig.1 The standard curve line ofcAMP

2.2 不同次黃嘌呤質(zhì)量濃度對cAMP產(chǎn)苷的影響

發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度次黃嘌呤時的cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷結(jié)果見表1.

表1 不同次黃嘌呤質(zhì)量濃度發(fā)酵cAMP產(chǎn)苷結(jié)果Tab.1 The results ofcAMP production with different concentrations ofhypoxanthine

2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳次黃嘌呤質(zhì)量濃度驗證性實驗結(jié)果

配制次黃嘌呤底物質(zhì)量濃度為0.018 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基,連續(xù)做7批搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),cAMP的產(chǎn)量見表2.

表2 七批次含0.018 g/L次黃嘌呤發(fā)酵的驗證實驗結(jié)果Tab.2 The results ofcAMP production for seven fermentation batches with 0.018 g/Lhypoxanthine addition

2.4 發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤添加方式對cAMP產(chǎn)苷的影響結(jié)果

采取將次黃嘌呤一次性添加到發(fā)酵培養(yǎng)基中和分兩次添加,即初始發(fā)酵培養(yǎng)基添加1/2次黃嘌呤量,發(fā)酵36 h時再添加1/2次黃嘌呤量,發(fā)酵產(chǎn)苷見表3.

表3 次黃嘌呤添加方式對cAMP產(chǎn)苷的影響Tab.3 The effect ofhypoxanthine addingmode on cAMP production

3 結(jié)論

利用核苷酸生物合成補救途徑由次黃嘌呤發(fā)酵制造cAMP,發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤質(zhì)量濃度及次黃嘌呤的添加方式對cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷有顯著影響.過量的次黃嘌呤對菌種生長有抑制作用,發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤只有在最適的質(zhì)量濃度下才能有效地提高cAMP發(fā)酵產(chǎn)苷水平,同時發(fā)酵培養(yǎng)基中次黃嘌呤采用分批添加更有利于提高cAMP產(chǎn)苷率.

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（責(zé)任編輯：鄧天福）

Effect of hypoxanthine addition content and mode on cyclic adenosine monophosphate production

XU Xiaojing1,2,YU Xiaomin3,LI Junxing1,2,LIU Jingliang1,2,WANG Qian1,2,CHANG Jingling1,2
（1.Cllabortive lnnovation Center ofModern Biological BreedingofHenan Province,Xinxiang453003, China；2.Henan Institute ofScience and Technology,Xinxiang453003,China；3.School ofBiological Science and Technology,ShenyangAgriculture University,Shenyang110866,China）

The influence of hypoxanthine addition content and modes on cAMP production with nucleotide remedy pathway was investigated in this study.Hypoxanthine was added into fermentation medium with 11 different concentrations and 2 different modes（by one lot or two lots）.The results showed that cAMP production reached the maximum of 6.86 g/L when 0.018 g/L hypoxanthine was added by one lot,and cAMP production reached the maximum of 7.23 g/L with 0.018 g/L hypoxanthine addition by two lots.It has been proved that the growth of bacteria could be inhibited by excess hypoxanthine,and the cAMP fermentation production could be effectively improved only when hypoxanthine was added at the optimum concentration in fermentation medium.In addition,adding hypoxanthine by multiple lots would benefit cAMP fermentation more.

cyclic adenosine monophosphate；hypoxanthine；fermentation；cAMP production

TQ464.3

A

1008-7516（2016）03-0022-04

10.3969/j.issn.1008-7516.2016.03.005

2016-03-15

國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目（201410467001）

徐曉靜（1994―）,女,河南開封人,本科生.

常景玲（1963―）,女,河南新鄉(xiāng)人,教授.主要從事發(fā)酵制藥研究.