張建喜，姚玲平，陳活林，劉劍萍

(1.浙江創(chuàng)新生物有限公司，浙江 紹興 312000；2.浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 新昌 312500)

0 引言

維生素D為固醇類衍生物，具抗佝僂病作用，又稱抗佝僂病維生素。目前認(rèn)為維生素D也是一種類固醇激素，維生素D家族成員中最重要的成員是維生素D2(麥角鈣化醇)和維生素D3(膽鈣化醇)[1]。維生素D均為不同的維生素D原經(jīng)紫外照射后的衍生物，植物不含維生素D，但維生素D原在動、植物體內(nèi)都存在。維生素D是一種脂溶性維生素，有五種化合物，對健康關(guān)系較密切的是維生素D2和維生素D3。它存在于部分天然食物中；人體皮下儲存有從膽固醇生成的7-脫氫膽固醇，受紫外線的照射后，可轉(zhuǎn)變?yōu)榫S生素D3，適當(dāng)?shù)娜展庠∽阋詽M足人體對維生素D的需要[2]。鈣鎂維生素D咀嚼片以碳酸鈣、維生素D3、氧化鎂為主要成分，每片含標(biāo)志性成分維生素D34.2 μg，產(chǎn)品規(guī)格為1.35 g/片，可補(bǔ)充維生素D，促進(jìn)鈣吸收有助于骨骼和牙齒的健康，有助于骨骼形成[3]。產(chǎn)品中維生素D3含量較低，目前對于保健食品中維生素D3含量測定方法多為食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)方法，但測定過程過于繁瑣，檢測周期長，且測定結(jié)果較難重現(xiàn)。參考文獻(xiàn)資料中維生素D測定方法研究內(nèi)容[4-6]，本文通過實(shí)驗(yàn)研究建立了較為簡便的HPLC法測定鈣鎂維生素D咀嚼片中維生素D3含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；METTLER-TOLEDO XS205DU型電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；戊醇、正己烷(默克，色譜純)；其余試劑均為分析純；維生素D3對照品(批號：100061-201809)為中國藥品食品檢定研究院提供；鈣鎂維生素D咀嚼片樣品為自制(批號為MD200401、MD200402、MD200403)。

1.2 色譜條件

硅膠色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為戊醇：正己烷(3∶997)；紫外檢測器，檢測波長為254 nm；流速為2.0 mL/min；進(jìn)樣量為100 μL；柱溫30 ℃。

1.3 溶液配制

樣品溶液：取片劑研碎，稱取5.0 g，精密稱定，置于100 mL帶塞子的錐形瓶中，加入二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加熱10 min，不斷振搖，冷卻后，精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層過濾后用于液相測定。

對照貯備溶液：稱取維生素D3對照品約20 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲苯不加熱溶解，并稀釋至刻度。精密吸取上述溶液1.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，作為對照貯備溶液。

對照溶液：精密吸取對照貯備溶液1.0 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度。將溶液轉(zhuǎn)入到100 mL帶塞子的錐形瓶中，加入二甲亞砜-水(體積比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層過濾后用于液相測定。

1.4 檢測方法

取對照溶液與樣品溶液各100 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按外標(biāo)法計算樣品中維生素D3的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑篩選

產(chǎn)品配方中維生素D3以維生素D3微粒的形式存在，其微粒以維生素D3與β-環(huán)狀糊精為原料，經(jīng)溶解、回流、冷卻、離心、干燥等工藝制成。片劑配方中還使用到碳酸鈣、氧化鎂為主要原料，山梨糖醇、麥芽糊精、乳粉、乳糖、硬脂酸鎂、羥丙基甲基纖維素、二氧化硅等為輔料，經(jīng)制粒、混合、壓片、包裝等工藝加工制成鈣鎂維生素D咀嚼片。使用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.82檢測維生素D3，皂化后萃取過程中乳化嚴(yán)重，無法完成試驗(yàn)。結(jié)合產(chǎn)品配方特點(diǎn)，考慮維生素D3的提取尤為關(guān)鍵。

β-環(huán)狀糊精是淀粉經(jīng)酸解環(huán)化生成的產(chǎn)物，為新型分子包裹材料，溶于水，難溶于甲醇、乙醇、丙酮。維生素D3為脂溶性維生素，在水中不溶，在正己烷、乙醚等非極性溶劑中易溶解。產(chǎn)品配方中其他物料均在正己烷中不溶，部分輔料可在水及二甲亞砜溶劑中溶解，結(jié)合產(chǎn)品配方，使用水作為破壁溶劑，50 ℃水浴中加熱振搖，冷卻后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，乳化嚴(yán)重，無法分層。

水中加入甲醇及二甲亞砜，可以減少乳化現(xiàn)象，改用二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)作為破壁溶劑，50 ℃水浴中加熱振搖，冷卻后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，乳化減弱，但分層時間較長。

優(yōu)化破壁提取過程，改用二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)作為破壁溶劑，加入甲醇，50 ℃水浴中加熱振搖，冷卻后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，乳化減弱，分層時間減少。

2.2 對照溶液及樣品溶液濃度確定

稱取維生素D3對照品約20 mg，精密稱定，置25 mL棕色容量瓶中，加甲苯不加熱溶解，并稀釋至刻度，作為貯備溶液，精密移取貯備溶液，用正己烷定量稀釋。在安捷倫1260液相色譜儀進(jìn)樣，記錄色譜圖。維生素D3濃度為0.6 μg/mL時，峰面積為80，能滿足定量需求。

鈣鎂維生素D咀嚼片功效成分維生素D3含量為4.2 μg/片，產(chǎn)品規(guī)格1.35 g/片，折算后樣品量稱取5 g溶解破壁后，用25 mL正己烷提取，樣品溶液與對照溶液中維生素D3濃度相近。

2.3 二甲基亞砜水混合溶液量的選擇

取鈣鎂維生素D咀嚼片研碎后，稱取粉末5.0 g，加入一定量體積的二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)，在50 ℃水浴中加熱振搖10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層過濾后進(jìn)樣測定，考察溶解破壁溶劑量對維生素D3測定結(jié)果的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 二甲基亞砜水混合溶液量的選擇數(shù)據(jù)表

2.4 溶解破壁溫度的選擇

取鈣鎂維生素D咀嚼片研碎后，稱取粉末5.0 g，加入25 mL二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)，在不同溫度水浴中加熱振搖10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層過濾后進(jìn)樣測定，考察溶解破壁溫度對維生素D3測定結(jié)果的影響，結(jié)果如表2所示。

表2 溶解破壁溫度選擇數(shù)據(jù)表

2.5 加入正己烷后攪拌時間的選擇

取鈣鎂維生素D咀嚼片研碎后，稱取粉末5.0 g，加入25 mL二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)，在不同溫度水浴中加熱振搖10 min，然后加入甲醇10 mL，加入正己烷25 mL，800 r/min攪拌不同時間，靜置分層，取上層正己烷層過濾后進(jìn)樣測定，考察攪拌時間對維生素D3測定結(jié)果的影響，結(jié)果如表3所示。

表3 攪拌時間選擇數(shù)據(jù)表

2.6 專屬性試驗(yàn)

取不含維生素D3空白輔料5.0 g按照鈣鎂維生素D咀嚼片處理方法，置于100 mL帶塞子的錐形瓶中，加入二甲亞砜與水(體積比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加熱10 min，不斷振搖，冷卻后，精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層制成空白輔料溶液。再取二甲亞砜與水混合溶液(體積比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加熱10 min，不斷振搖，冷卻后精密加入正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層制成空白溶液。分別取空白輔料溶液、空白溶液、對照溶液與樣品溶液，進(jìn)樣并記錄色譜圖，空白溶液及空白輔料溶液無干擾，空白溶液圖譜如圖1所示，空白輔料溶液圖譜如圖2所示，對照溶液圖譜如圖3所示，樣品溶液圖譜如圖4所示。

圖1 空白溶液圖譜

圖2 空白輔料溶液圖譜

圖3 對照溶液圖譜

圖4 鈣鎂維生素D咀嚼片樣品溶液圖譜

2.7 精密度試驗(yàn)

取同一對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，結(jié)果維生素D3峰面積為86.14、85.95、86.38、86.40、86.56、87.30，RSD為0.6%，表明儀器精密度良好。取同一批樣品，依法平行操作制備6份供試品溶液，分別測定，結(jié)果維生素D3含量分別為5.86 μg/片、5.85 μg/片、5.89 μg/片、5.91 μg/片、5.94 μg/片、6.00 μg/片，平均值為5.91 μg/片，RSD為1.0%。不同分析員在不同時間使用不同儀器對同一批樣品進(jìn)行測定，5.54 μg/片、5.61 μg/片、5.59 μg/片、5.62 μg/片、5.37 μg/片、5.62 μg/片，平均值為5.56 μg/片，RSD為1.8%。不同人員及儀器測定結(jié)果差值為其平均值的6%，結(jié)果一致，表明方法精密度良好。

2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制和線性關(guān)系的考察

精密稱取維生素D3對照品約20 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用甲苯溶解稀釋到刻度，移取1.0 mL該溶液到50 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋到刻度，作為線性貯備溶液。分別移取線性貯備溶液0.5 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL到25 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋到刻度，將溶液轉(zhuǎn)入到100 mL帶塞子的錐形瓶中，精密加入二甲亞砜-水(體積比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層，配制成維生素D3濃度為0.2～0.8 μg/mL的線性溶液，分別進(jìn)樣并記錄色譜圖，以維生素D3濃度為橫坐標(biāo)，維生素D3峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，得到線性方程為y=135.54x-2.245 6，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 9，結(jié)果表明維生素D3在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果如表4所示。

表4 線性數(shù)據(jù)表

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

稱取5.0 g不含維生素D3的空白輔料，精密稱定，置于100 mL帶塞子的錐形瓶中，加入二甲亞砜與水(體積比3∶1)的混合溶液25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加熱10 min，不斷振搖，冷卻，作為本底溶液。精密稱取維生素D3對照品約20 mg置于25 mL棕色容量瓶中，用甲苯溶解稀釋到刻度，移取1.0 mL該溶液到50 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋到刻度，作為貯備溶液。分別移取貯備溶液0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL到25 mL棕色容量瓶中，用正己烷稀釋到刻度，配制成50%、100%、200%的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在本底溶液中加入配制好的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，800 r/min攪拌20 min，靜置分層，取上層正己烷層，制成對照溶液濃度水平50%、100%、200%的維生素D3回收率測定溶液，依法處理并測定，計算加樣回收率，結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表5 加樣回收率數(shù)據(jù)表(n=3)

2.10 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

配制對照品溶液和供試品溶液，分別在避光的條件下室溫放置48 h后進(jìn)樣檢測，放置后與0 h檢測結(jié)果相比，對照品溶液峰面積基本一致，供試品溶液測定結(jié)果為5.76 μg/片，基本一致，表明溶液在室溫避光的條件下48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.11 耐用性試驗(yàn)

分別改變測試條件，如改變流動相的比例、柱溫、流速及更換儀器色譜柱，依法測定，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)條件下測定結(jié)果一致，表明本方法具有良好的耐用性，結(jié)果如表6所示。

表6 耐用性數(shù)據(jù)表

2.12 樣品含量測定

取鈣鎂維生素D咀嚼片樣品，分別在本實(shí)驗(yàn)、通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司(SGS)依法測定，結(jié)果如表7所示，均符合規(guī)定。

表7 鈣鎂維生素D咀嚼片樣品測定維生素D3結(jié)果

2.13 討論

本品中維生素D3以β-環(huán)狀糊精包埋微粒的形式存在，實(shí)驗(yàn)過程中需先用二甲亞砜水溶液(體積比3∶1)在50℃水浴中溶解破壁，使維生素D3游離出來，且需加入甲醇減少乳化，然后用正己烷提取，為消除實(shí)驗(yàn)過程中可能產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，供試品與對照品的前處理過程完全一致，均為經(jīng)正己烷溶液提取，HPLC檢測，以峰面積，按照外標(biāo)法計算樣品中維生素D3含量，操作簡便，由于產(chǎn)品中維生素D3含量較低(約3 μg/g)，中國藥典對應(yīng)含量準(zhǔn)確度要求80%～115%，精密度要求RSD≤6%，該方法能符合藥典要求，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)語

方法學(xué)驗(yàn)證表明，樣品研碎后，取粉末用二甲亞砜與水的混合溶液(體積比3∶1)25 mL，加入甲醇10 mL，置于50 ℃水浴中加熱10 min，不斷振搖，破壁溶解，使其中的維生素D3游離出來，然后用正己烷25.0 mL，800 r/min攪拌20 min，提取溶液中的維生素D3，靜置分層后，取上層正己烷層過濾，用于測定鈣鎂維生素D咀嚼片中維生素D3含量，該方法具有良好的專屬性、精密度、線性和準(zhǔn)確度，方法較為簡便，準(zhǔn)確可靠，并經(jīng)過通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司(SGS)復(fù)核，適用于鈣鎂維生素D咀嚼片中維生素D3含量檢測。