盧 珊 張 磊 蘇 瑩 侯陳建 王美麗 劉秀萍，△

（1復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系 上海 200030；2復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院病理科 上海 200032；3復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院病理科 上海 201100）

胃癌（gastric carcinoma，GC）是消化系統(tǒng)惡性腫瘤［1］。盡管治療方面有進展，并且其發(fā)病率有所下降［2］，但在中國惡性腫瘤總體發(fā)病率和死亡率排行中，它均居于第二位［3］，5年生存率約為20%。胃癌的高死亡率除了與發(fā)病癥狀隱匿有關(guān)外，主要歸因于晚期病例的高復(fù)發(fā)率和遠處轉(zhuǎn)移［4］。有研究顯示，癌組織的浸潤與轉(zhuǎn)移是胃癌復(fù)發(fā)的重要臨床指征，胃癌浸潤與轉(zhuǎn)移情況及患者預(yù)后緊密相關(guān)［5-6］。因此，胃癌進展的潛在機制研究十分重要。

黏著斑蛋白Vinculin是細胞黏附的主要調(diào)節(jié)劑［7］，可將含肌動蛋白的微絲錨定在質(zhì)膜上，并使細胞附著在基質(zhì)上。自從Vinculin被鑒定以來，已經(jīng)取得很多研究進展，其功能被逐漸了解。Vinculin結(jié)構(gòu)保守，可參與多種化學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。對其在細胞黏附、收縮變形、細胞遷移中的作用的研究發(fā)現(xiàn)，Vinculin對于傳遞機械力和協(xié)調(diào)機械信號事件非常重要。腫瘤轉(zhuǎn)移需要細胞侵襲結(jié)締組織，這實質(zhì)上是一種機械作用，涉及黏附、形狀改變、運動和力產(chǎn)生。而解除對Vinculin的調(diào)控，則會導(dǎo)致細胞黏附、收縮、運動和生長的改變［8］，提示Vinculin可能影響著腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和侵襲。

有報道認為，Vinculin在肺癌組織中的蛋白水平顯著少于癌旁，且Vinculin表達與TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)［9］。在不同腫瘤中，Vinculin的蛋白水平并不一致。有報道發(fā)現(xiàn)Vinculin在前列腺癌、胰腺癌、腎癌等腫瘤中表達升高［10-12］，而在鱗狀細胞癌、神經(jīng)內(nèi)分泌瘤、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達降低［13-14］。這些不一致的研究結(jié)果可能與實驗所用的不同細胞有關(guān)，也可能因為Vinculin在不同類型的癌中有不同的表達特點。Vinculin是癌癥的增強還是抑制因子目前尚無定論。

Vinculin在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用的研究較少。因此，我們擬檢測Vinculin蛋白在臨床樣本中的表達情況。前期收集了110位患者的胃癌標(biāo)本，結(jié)合隨訪信息等臨床資料，使用免疫組織化學(xué)技術(shù)進行了檢測，并統(tǒng)計分析Vinculin在標(biāo)本中的表達量及其與主要臨床指征（包括但不限于：腫瘤大小、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等）的相關(guān)性，通過對Vinculin蛋白水平的監(jiān)測，為胃癌臨床診療提供幫助。

材料和方法

病理資料應(yīng)用同位素標(biāo)記相對與絕對定量蛋白組學(xué)（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）技術(shù)檢測的組織樣本6例，為2009年5月—2010年6月在復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院行手術(shù)切除全胃5例和近端胃1例標(biāo)本。手術(shù)標(biāo)本離體半小時內(nèi)，在不影響后續(xù)診療的前提下切取小塊腫瘤組織或距離腫瘤組織邊緣10 cm以上的正常黏膜組織，立即低溫冷凍保存；經(jīng)病理證實，均為低分化腺癌（T 4N2～3M 0，Ⅲc），術(shù)后均行常規(guī)方案輔助化療，依據(jù)2年內(nèi)是否發(fā)生復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移，將病例分為復(fù)發(fā)組（無疾病進展時間3～14個月）3例與未復(fù)發(fā)組3例，以復(fù)發(fā)組遠離瘤巢區(qū)正常黏膜組織為正常對照組。收集1990年2月—1998年7月110例胃腺癌根治術(shù)患者的臨床病理資料。患者術(shù)前均未接受放、化療。入院患者均簽署了標(biāo)本研究的知情同意書。所有病例均經(jīng)兩名資深病理醫(yī)師再次復(fù)片確診胃腺癌。收集的臨床病理資料包括：患者年齡、性別、腫瘤部位及腫瘤大小、分化情況、脈管及神經(jīng)束侵犯和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等。pTNM分期依據(jù)第8版美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer，AJCC）p TNM分期標(biāo)準(zhǔn)。

新鮮組織標(biāo)本iTRAQ蛋白質(zhì)譜檢測根據(jù)既往文獻報道和操作規(guī)范［15］。（1）提取并標(biāo)記組織蛋白，丙酮沉淀樣品蛋白，還原劑還原樣品蛋白，半胱氨酸封閉樣品蛋白，用trypsin酶解蛋白樣品；iTRAQ試劑分別標(biāo)記樣品酶解物——118標(biāo)記復(fù)發(fā)組、119標(biāo)記未復(fù)發(fā)組和121標(biāo)記正常黏膜組，充分混合混勻。（2）第一維強陽離子交換（strong cation exchange，SCX）層析法分餾樣品，添加緩沖液A，震蕩混勻；以20 AD HPLC系統(tǒng)的SCX層析法分餾蛋白多肽，樣品混合液添加到聚亞硫乙基柱（2.1 mm×100 mm，5μm，200?），通過含有梯度為0、5%、10%、20%、40%、80%緩沖液B的緩沖液A，以200μL/min的流速分離蛋白多肽60 min，檢測樣品在214 nm和280 nm的吸光度值（D），共搜集得到25個SCX餾分。緩沖液A：10 mmol/L KH2PO4，25%乙腈，pH=2.6；緩沖液B：10 mmol/L KH2PO4，5%乙腈，1 mol/L KCl，p H=2.6；Diluent：25%acetonitrile，p H=2.6。（3）第二維反相液質(zhì)聯(lián)用RPLC-MS/MS，上一級搜集到的餾分溶液，4℃下20 000×g真空離心風(fēng)干30 min，復(fù)溶于50μL HPLC緩沖液A，上樣入ZORBAX 300SB-C18反 相 柱（5μm，300?，0.1 mm×150 mm），以0.3μL/min的流速通過5%～80%梯度的HPLC緩沖液B（95%ACN，0.1%蟻酸）90 min，通過聯(lián)合20AD HPLC系統(tǒng)的QSTAR XL方法分析流通數(shù)據(jù)，由一級質(zhì)譜（m/z：400～1 800）聯(lián)合二級質(zhì)譜（m/z：100～2 000），獲得掃描數(shù)據(jù)。其中根據(jù)一級質(zhì)譜（MS）的圖像，選擇4個峰值最高的片段，即前驅(qū)離子（precursors），進行二級掃描，獲得串聯(lián)二級質(zhì)譜（MS/MS）的信息。每個SCX餾分進行串聯(lián)分析/重復(fù)鑒定2次。MS數(shù)據(jù)通 過 ProteinPilot軟 件（v 4.2）在International Protein Index（IPI）數(shù)據(jù)庫（v 3.45）中檢索并鑒定多肽。（4）質(zhì)譜校正并設(shè)定相應(yīng)的參數(shù)。（5）由Paragon Algorithm檢索多肽信息，確定候選蛋白，并經(jīng)由軟件自帶的Pro Group Algorithm運算法則作進一步的驗證。（6）差異蛋白的篩選：在前述候選蛋白的基礎(chǔ)上，符合以下標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)被認為有組間差異變化，用于進一步的分析研究，即①Unused ProtSore＞1.3，至少1條肽鏈具有95%CI；②蛋白相對表達量閾值設(shè)為≥1.25或≤0.8；③P＜0.05。

石蠟包埋組織免疫組織化學(xué)染色采用免疫組化增強標(biāo)記聚合物系統(tǒng)（Enhance Labelled Polymer System，ELPS）法檢測110例胃癌標(biāo)本中Vinculin的表達。具體操作步驟嚴(yán)格遵照試劑盒說明書進行，組織切片常規(guī)脫蠟、水化，PBS緩沖液沖洗，一、二抗孵育，DAB顯色，蘇木精襯染及乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。一抗Vinculin抗體購自德國Sigma公司，鼠抗，1∶200；HRP偶聯(lián)二抗、DAB均購自丹麥Dako公司。Vinculin表達定位在細胞胞質(zhì)，陽性對照為平滑肌組織，陰性對照為淋巴細胞。分別評估染色的強度（staining intensity，SI）和陽性細胞百分率（positive proportion，PP），SI由無著色、淺黃色、棕黃色、黃褐色分別記為0～3分，PP由5%、25%、50%、75%截斷值分別記為0～4分，免疫反應(yīng)積分（immunoreactive score，IRS）=SI×PP，得分≥3分者判為陽性；得分＜3分者判為陰性。

隨訪患者均通過電話或者復(fù)查隨訪。無病生存期（disease free survival，DFS）指從患者手術(shù)之日起到出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死于食管癌的時間或死亡患者記錄最后一次隨訪的時間?？偵嫫冢╫verall survival，OS）定義為手術(shù)后到患者死亡的時間或最后1次隨訪的時間。隨訪截至2000年1月。

統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析，以Spearman’s correlation和Pearson Chi-Square檢驗來檢測Vinculin蛋白表達水平與主要臨床病理指征之間的關(guān)聯(lián)。由Kaplan-Meier生存曲線分析Vinculin蛋白表達水平與總體生存期的聯(lián)系。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

iTRAQ技術(shù)臨床標(biāo)本蛋白質(zhì)譜檢測結(jié)果iTRAQ技術(shù)聯(lián)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（2D LCMS/MS），符合數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求，按照95%的置信區(qū)間下Protein-Threshold＞1.3的標(biāo)準(zhǔn)，鑒別出3 566條多肽，歸納識別出570種蛋白質(zhì)。結(jié)合iTRAQ技術(shù)中ParagonTM Algorithm運算法則的結(jié)果和文獻參考，篩選具有組間差異性表達的蛋白，胃癌復(fù)發(fā)組相對于正常胃黏膜組差異表達的蛋白有13種，其中2種（Keratin/type I cytoskeletal 19、Matrin-3）表達上升、11種（Neuroblast differentiationassociated protein AHNAK、Filamin-A、Hemoglobin subunit、Vinculin、ATP synthase subunit alpha，mitochondrial等）表達下降；胃癌未復(fù)發(fā)組相對于正常胃黏膜組差異表達的蛋白有8種，其中5種表達上升、3種表達下降，但多數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。其中，相對正常黏膜組，Vinculin蛋白在胃癌復(fù)發(fā)組表達水平降低（118：121倍值為0.787，P=0.004），而在胃癌非復(fù)發(fā)組的表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.058）。

胃癌臨床標(biāo)本中Vinculin蛋白質(zhì)的表達情況在110例人胃癌組織標(biāo)本中，Vinculin陽性46例（41.8%）、陰性64例（58.2%）（圖1）。

圖1 胃癌組織中Vinculin表達的代表性IHC染色結(jié)果（200×）Fig 1 Representative IHC staining of Vinculin expression in GC tissue（200×）

胃癌石蠟組織標(biāo)本中Vinculin蛋白質(zhì)的表達與總生存率的相關(guān)性具有完整隨訪資料86例，隨訪1～92個 月，患 者1、3、5年 總 體 生 存 率 分 別 為88.4%、77.9%和69.7%；Vinculin陽性和陰性患者的中位總生存期（overall survival，OS）分別為36個月和28個月。Kaplan-Meier生存分析顯示，Vinculin陰性患者的總生存率低于Vinculin陽性患者（P=0.011，圖2）。

圖2 Vinculin陽性與陰性患者總體生存率分析Fig 2 Kaplan-Meier survival analysis of GC grouped by positiveor negative expression of Vinculin

胃癌臨床標(biāo)本中Vinculin蛋白質(zhì)的表達與臨床病理特征的關(guān)系統(tǒng)計結(jié)果顯示，Vinculin的低表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.018）、腫瘤TNM分期（P=0.022）、血管侵襲（P=0.002）具有顯著的相關(guān)性（表1、表2）。

表1 110例人胃癌組織標(biāo)本的臨床病理特征Tab 1 Clinicopathological characteristicsof 110 human gastric cancer tissue specimens

表2 Vinculin蛋白質(zhì)的表達與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 The relationship between Vinculin expression and clinicopathological features ［n（%）］

討 論

Vinculin是在黏著斑中發(fā)現(xiàn)的一種分布于胞質(zhì)的蛋白，參與細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）與肌動蛋白細胞骨架的連接過程。近些年，Vinculin的下調(diào)陸續(xù)在幾個高度轉(zhuǎn)移性癌細胞中被發(fā)現(xiàn)［13，16-18］。但是目前尚未發(fā)現(xiàn)對Vinculin在胃癌中表達的報道，Vinculin對胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的作用以及對胃癌復(fù)發(fā)的影響尚不明確。

本課題運用iTRAQ技術(shù)在臨床胃癌復(fù)發(fā)組、未復(fù)發(fā)組和正常胃黏膜組進行蛋白質(zhì)質(zhì)譜掃描。在鑒別出的570種蛋白中，挑選出有組間差異表達的蛋白質(zhì)，與正常胃黏膜組相比，黏著斑蛋白Vinculin在胃癌復(fù)發(fā)組表達顯著下調(diào)，而在胃癌未復(fù)發(fā)組表達差異不顯著。提示Vinculin蛋白可能在胃癌的復(fù)發(fā)中具有一定的功能和影響，但其在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的生物學(xué)作用還有待進一步探索。

為進一步分析篩選出的差異表達蛋白質(zhì)的功能聚類，我們對差異蛋白作GO（Gene Ontology）分析。運用Gene Ontology-AmiGO 2提供的在線分析工具PANTHER Classification System，對差異蛋白做功能聚類分析：發(fā)現(xiàn)蛋白分子功能集中在結(jié)合肌動蛋白、酶催化活性調(diào)節(jié)、細胞結(jié)構(gòu)分子活性等；

主要參與到細胞黏附、細胞骨架結(jié)構(gòu)重排、代謝過程等生物學(xué)進程。

接著對這些蛋白作KEGG（京都基因與基因組百科全書）Pathway分析。KEGG是基因組破譯方面的數(shù)據(jù)庫，使用計算機技術(shù)利用基因信息對更高層次和更復(fù)雜細胞活動和生物體行為作出計算推測。可能由于篩選出的蛋白量較少，未能得到Pathway的聚簇。

在110例石蠟包埋的胃癌臨床標(biāo)本組織中，我們采用免疫組織化學(xué)技術(shù)，檢測了Vinculin的蛋白表達水平，并根據(jù)免疫組化結(jié)果，分析了Vinculin與臨床病理參數(shù)以及患者生存率的關(guān)系。根據(jù)免疫組織化學(xué)染色評分結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)，Vinculin的缺失表達與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、血管侵襲均具有顯著的相關(guān)性，提示胃癌惡性程度越高，Vinculin表達越低。生存曲線分析結(jié)果提示，Vinculin缺失表達與胃癌患者較短的生存期有關(guān)聯(lián)，提示Vinculin蛋白是胃癌患者生存預(yù)后具有意義的分子指標(biāo)。

細胞-細胞黏附的喪失對于癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移的發(fā)展是重要的［18］，既往研究［19］顯示，黏著斑蛋白缺損與細胞黏附減少和細胞運動增加有關(guān)，表明其可能在轉(zhuǎn)移性生長中起作用。Yang等［20］在結(jié)直腸癌中發(fā)現(xiàn)黏著斑蛋白表達下降與腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移風(fēng)險增加之間存在關(guān)聯(lián)。本研究結(jié)果顯示，Vinculin缺失表達與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移正相關(guān)，Vinculin表達減少，將會使胃癌細胞黏附減少，運動性增加，導(dǎo)致癌細胞的分離和向基底膜的侵襲。

我們通過iTRAQ蛋白質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)Vinculin在胃癌復(fù)發(fā)相關(guān)因素中具有差異性表達；在臨床標(biāo)本驗證中發(fā)現(xiàn)Vinculin的缺失表達與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移顯著正相關(guān)，通過臨床胃癌組織標(biāo)本的檢測，我們初步確認了Vinculin蛋白的缺失表達與胃癌腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有顯著相關(guān)性，并提示患者預(yù)后不良。但目前研究樣本量較少，也受到諸如臨床標(biāo)本選擇、樣本類型和數(shù)量等因素的影響，其內(nèi)在機制尚待進一步探究。在以后的研究中，可增加樣本量，并深入探究Vinculin表達水平對胃癌細胞的生物學(xué)行為（增殖能力、克隆形成能力、體外侵襲轉(zhuǎn)移能力等）的影響及其發(fā)揮生物學(xué)作用的相關(guān)分子機制。

我們的研究表明，Vinculin的低表達與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期、血管侵襲顯著正相關(guān)。Vinculin表達情況或可作為胃癌患者生存的預(yù)測因子。

作者貢獻聲明盧珊 文獻調(diào)研與整理，論文撰寫和修改。張磊 論文構(gòu)思與修改，數(shù)據(jù)采集，實驗實施。蘇瑩，侯陳建，王美麗 論文修訂。劉秀萍 監(jiān)督指導(dǎo)。

利益沖突聲明所有作者均聲明不存在利益沖突。