陳鑫，徐鴻毅，3，張?chǎng)危囧|，4，張昌軍，4*

(1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，十堰 442000；2.湖北省生殖醫(yī)學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心，十堰 442000；3.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研究院，十堰 442000；4.湖北醫(yī)藥學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，十堰 442000)

胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT)是指在移植前對(duì)胚胎染色體進(jìn)行檢測(cè)，以排除攜帶遺傳性疾病或染色體異常的胚胎，從而提高胚胎種植率、臨床妊娠率和活產(chǎn)率。根據(jù)檢測(cè)目標(biāo)的不同，PGT分為胚胎植入前非整倍體篩查(PGT-A)、單基因疾病遺傳學(xué)檢測(cè)(PGT-M)和染色體結(jié)構(gòu)重排檢測(cè)(PGT-SR)[1]。隨著胚胎遺傳分析技術(shù)的不斷發(fā)展，一系列諸如囊胚活檢、比較基因組雜交以及高通量測(cè)序等高新技術(shù)的應(yīng)用，PGT-M和PGT-SR已逐漸成為對(duì)攜帶單基因病和染色體結(jié)構(gòu)重排等遺傳易感性疾病的夫婦進(jìn)行產(chǎn)前阻斷的有效方法[2-3]。

在IVF助孕周期中，有研究表明獲卵數(shù)與累積活產(chǎn)率之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，是影響助孕結(jié)局的重要因素[4-5]。雖然這種關(guān)系不是線性的，但是在一定范圍內(nèi)，隨著獲卵數(shù)的增加，患者的累積活產(chǎn)率逐漸上升，因此獲卵數(shù)可作為預(yù)測(cè)臨床妊娠率的指標(biāo)之一[6-7]。有研究結(jié)果顯示，PGT助孕周期中卵母細(xì)胞數(shù)量與活檢胚胎數(shù)量和可移植的胚胎數(shù)量顯著相關(guān)，一定范圍內(nèi)增加獲卵數(shù)可以增加患者每周期可活檢的胚胎數(shù)，但同時(shí)會(huì)增加卵巢過度刺激的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

IVF助孕周期中適度進(jìn)行促排卵，既可以獲得足夠數(shù)量的優(yōu)質(zhì)卵母細(xì)胞，同時(shí)又可以降低卵巢過度刺激的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，是目前國(guó)內(nèi)外同行關(guān)注的焦點(diǎn)[9-10]。有關(guān)獲卵數(shù)或可用胚胎數(shù)與活產(chǎn)率的研究大多是關(guān)于常規(guī)IVF助孕新鮮移植周期活產(chǎn)率的研究，而PGT-M和PGT-SR助孕周期中卵母細(xì)胞數(shù)量和可移植囊胚數(shù)量與累積活產(chǎn)率的相關(guān)性研究仍然鮮見。本研究通過回顧性分析PGT-M和PGT-SR助孕周期中不同獲卵數(shù)和可移植囊胚數(shù)量與每個(gè)周期累積活產(chǎn)率的相關(guān)性等，來探討PGT助孕周期理想的獲卵數(shù)范圍，指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定個(gè)體化的促排卵方案，使患者一次取卵的獲益最大化。

材料與方法

一、研究對(duì)象

以2016年1月至2020年12月因單基因疾病或染色體結(jié)構(gòu)重排在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心接受PGT助孕患者的臨床資料為對(duì)象進(jìn)行回顧性分析。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)夫妻雙方至少一人經(jīng)外周血染色體核型分析診斷為染色體結(jié)構(gòu)異常攜帶者；(2)夫妻一方攜帶顯性致病基因、夫妻雙方都攜帶隱性基因，或者有特定遺傳疾病家族史；(3)女方年齡20～40歲；(4)女方無子宮及卵巢病變。(5)符合2018年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識(shí)》中PGT-M/SR可應(yīng)用于單基因遺傳病和染色體異常的適應(yīng)證[11]。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)卵巢儲(chǔ)備功能下降；(2)子宮內(nèi)膜異位癥；(3)多囊卵巢綜合征；(4)雙側(cè)輸卵管積水。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過，經(jīng)過充分的臨床評(píng)估以及遺傳咨詢后，在夫婦雙方自愿選擇治療方式的原則下簽署ICSI和PGT的相關(guān)知情同意書。

二、研究方法

1.臨床促排卵：根據(jù)女方經(jīng)陰道B超下雙側(cè)卵巢的竇卵泡計(jì)數(shù)和各項(xiàng)檢查報(bào)告評(píng)估卵巢功能并制定合適的促排卵方案。促排卵期間B超下動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)卵泡生長(zhǎng)情況以及血清激素水平，當(dāng)主導(dǎo)卵泡平均直徑達(dá)到20 mm時(shí)，給予人絨毛膜促性腺激素(HCG，2 000 U/支，珠海麗珠制藥)1支及促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑(GnRH-a，達(dá)必佳，0.1 mg/支，輝凌，德國(guó))扳機(jī)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟。扳機(jī)用藥后34～38 h在經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下行卵泡穿刺取卵手術(shù)。

2.受精與胚胎培養(yǎng)：為了避免顆粒細(xì)胞及男方精子干擾胚胎檢測(cè)結(jié)果，所有的卵母細(xì)胞均行卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)授精，受精16～18 h后觀察原核情況，見到原核確定為受精，見到兩個(gè)原核確定為正常受精。授精后第3天參照“人類體外受精-胚胎移植實(shí)驗(yàn)室操作專家共識(shí)”[12]對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)級(jí)，Ⅰ～Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ～Ⅲ級(jí)胚胎均為可用胚胎，IV級(jí)胚胎為廢棄胚胎。全部的可用胚胎行囊胚培養(yǎng)到第5天或第6天。

3.囊胚活檢與PGT檢測(cè)：采用Gardner囊胚分級(jí)法對(duì)第5或第6天的囊胚進(jìn)行評(píng)分分級(jí)[13]，選擇評(píng)分3BB及以上的囊胚進(jìn)行活檢。在遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)處的透明帶進(jìn)行激光打孔后，取3～5個(gè)囊胚滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，活檢完的囊胚玻璃化冷凍保存。PGT檢測(cè)在湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心完成，采用二代測(cè)序技術(shù)(NGS)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)活檢的外滋養(yǎng)層細(xì)胞先進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，再進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物文庫構(gòu)建，生物信息分析，對(duì)胚胎染色體是否存在異常進(jìn)行診斷[14]。對(duì)單基因遺傳病患者采用目標(biāo)序列捕獲測(cè)序，篩選出致病基因突變位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)單體型信息，同時(shí)對(duì)受檢胚胎的SNP和突變點(diǎn)信息進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)染色體異常和單基因病的同時(shí)檢測(cè)[15]。由具備PGT遺傳咨詢資質(zhì)的人員根據(jù)檢測(cè)結(jié)果確定胚胎是否可移植，若PGT檢測(cè)結(jié)果為可移植胚胎，則進(jìn)行復(fù)蘇后移植，若為不可移植胚胎，則經(jīng)患者夫婦知情同意簽字確認(rèn)后丟棄。

4.內(nèi)膜準(zhǔn)備與胚胎移植：凍融胚胎移植(FET)周期采用降調(diào)節(jié)聯(lián)合激素替代方案進(jìn)行內(nèi)膜準(zhǔn)備。于月經(jīng)第3天檢測(cè)性激素水平，如果性激素水平與月經(jīng)周期相符，則給予肌注醋酸曲普瑞林(達(dá)菲林，輝凌制藥，德國(guó))3.75 mg，35 d后通過超聲觀察子宮內(nèi)膜情況，達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)后開始給予戊酸雌二醇(補(bǔ)佳樂，拜耳，德國(guó))口服4 mg/d，連續(xù)服用5 d后調(diào)整為6 mg/d。第10天開始定期B超監(jiān)測(cè)子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)情況，根據(jù)內(nèi)膜厚度及形態(tài)及時(shí)調(diào)整戊酸雌二醇劑量。當(dāng)子宮內(nèi)膜厚度≥7 mm時(shí)，肌肉注射黃體酮注射液(浙江仙琚制藥)80 mg行內(nèi)膜轉(zhuǎn)化，5 d后行單囊胚解凍移植。胚胎移植后14 d測(cè)血β-HCG，若β-HCG>50 U/L則定義為HCG陽性。移植后30 d行陰道超聲檢查，若宮腔內(nèi)可見妊娠囊，則定義為臨床妊娠。由專職人員負(fù)責(zé)隨訪孕期各項(xiàng)指標(biāo)、產(chǎn)前診斷結(jié)果和新生兒分娩情況等，隨訪率100%。

5.收集資料及主要觀察指標(biāo)：收集患者的一般臨床資料，包括女方年齡、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、不孕年限，抗苗勒管激素(AMH)水平、基礎(chǔ)竇卵泡數(shù)(AFC)；促排卵中基礎(chǔ)激素水平、HCG日激素水平以及胚胎情況等各項(xiàng)指標(biāo)。主要的觀察指標(biāo)包括：胚胎種植率、臨床妊娠率、早期流產(chǎn)率、累積活產(chǎn)率等。本研究中累積活產(chǎn)率的計(jì)算參照2018年中國(guó)專家共識(shí)進(jìn)行[16]，以單個(gè)取卵周期累積活產(chǎn)率進(jìn)行計(jì)算。

胚胎種植率=孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/FET周期數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=確診臨床妊娠12周以前的流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；累積活產(chǎn)率=FET成功分娩周期數(shù)/取卵周期數(shù)×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、患者一般情況及實(shí)驗(yàn)室結(jié)果

本研究共納入307(268對(duì)夫婦)個(gè)周期，其中54個(gè)(17.59%)為單基因病檢測(cè)(PGT-M)周期，253個(gè)(82.41%)為染色體重排檢測(cè)(PGT-SR)周期。39對(duì)夫婦由于第1個(gè)取卵周期無可用胚胎接受了第2或第3個(gè)取卵周期。女性平均年齡為(30.14±4.16)歲，平均獲卵數(shù)為(9.47±3.59)個(gè)，每個(gè)周期平均可活檢囊胚數(shù)為(2.86±1.68)個(gè)(表1)。

表1 PGT-M/SR周期患者一般情況及實(shí)驗(yàn)室結(jié)局[(-±s)，%]

二、胚胎復(fù)蘇后移植妊娠結(jié)局情況

本研究共有192個(gè)移植周期，其中127例(66.14%)胚胎成功著床，112例(58.33%)獲得臨床妊娠，8例(7.14%)在妊娠早期發(fā)生流產(chǎn)，4例(3.57%)異位妊娠，93例(53.14%)獲得活產(chǎn)，1例(0.89%)因先天性畸形終止妊娠。共175個(gè)周期進(jìn)行了完整的FET，累積活產(chǎn)率為53.14%(表2)。

表2 PGT-M/SR周期患者胚胎復(fù)蘇后移植妊娠結(jié)局情況(%)

三、獲卵數(shù)及可活檢囊胚數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚概率的關(guān)系

校正女方年齡、BMI、AMH及AFC后對(duì)患者獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚的概率進(jìn)行曲線擬合分析，結(jié)果顯示：獲卵數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚的概率顯著相關(guān)[RR=1.108，95%CI(0.976，1.227)，P=0.000]，隨著獲卵數(shù)的增多，可移植囊胚率逐漸增加(圖1A)；同樣，每周期可供活檢的囊胚數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚的概率顯著相關(guān)[RR=1.155，95%CI(0.994，1.242)，P=0.000]，隨著取卵周期可活檢囊胚數(shù)的增加，有可移植囊胚率逐漸增加(圖1B)。

A：獲卵數(shù)；B：活檢囊胚數(shù)；●示均值，○示相應(yīng)值的95%CI。圖1 每周期獲卵數(shù)和可活檢囊胚數(shù)與至少有一個(gè)可移植囊胚概率的關(guān)系

四、獲卵數(shù)及可移植囊胚數(shù)與累積活產(chǎn)率的關(guān)系

校正女方年齡、BMI、AMH及AFC后，分析患者獲卵數(shù)及可移植囊胚數(shù)與累積活產(chǎn)率之間的關(guān)系進(jìn)行曲線擬合分析，結(jié)果顯示：女方獲卵數(shù)(圖2A)和可移植囊胚數(shù)(圖2B)對(duì)累積活產(chǎn)率有顯著影響。隨著獲卵數(shù)的增加，累積活產(chǎn)率逐漸增加，最高可達(dá)83.33%，當(dāng)獲卵數(shù)≥10個(gè)時(shí)，累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)；隨著患者每周期獲得可移植囊胚數(shù)的增加，累積活產(chǎn)率逐漸增加，可移植囊胚數(shù)量≥5枚時(shí)，累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)。

A：獲卵數(shù)；B：可移植囊胚數(shù)；●示均值，○示相應(yīng)值的95%CI。圖2 每周期獲卵數(shù)及可移植囊胚數(shù)與累積活產(chǎn)率的關(guān)系

五、獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)、可移植囊胚數(shù)及累積活產(chǎn)率之間的相關(guān)性

將年齡作為協(xié)變量，使用泊松回歸分析每取卵周期獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)量、可移植囊胚數(shù)及累積活產(chǎn)率之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示：在PGT-M/PGT-SR助孕周期中獲卵數(shù)[OR=1.041，95%CI(0.883，1.211)，P=0.014]、可活檢囊胚數(shù)[OR=1.167，95%CI(1.062，1.291)，P=0.012]和可移植囊胚數(shù)[OR=1.276，95%CI(1.111，1.409)，P=0.042]均與累積活產(chǎn)率顯著相關(guān)(表3)。

表3 獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)、可移植囊胚數(shù)及累積活產(chǎn)率之間的相關(guān)性

討 論

IVF妊娠結(jié)局受多種因素的影響，如卵母細(xì)胞數(shù)量，可用胚胎的數(shù)量，子宮內(nèi)膜的容受性等，其中獲卵數(shù)和胚胎質(zhì)量是影響妊娠結(jié)局的重要因素[16-17]。獲卵數(shù)偏低時(shí)，患者可利用胚胎數(shù)減少，導(dǎo)致周期取消率增加和累積妊娠率降低[18]。每周期取卵過多時(shí)會(huì)導(dǎo)致卵巢過度刺激綜合征(OHSS)的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，延長(zhǎng)治療周期時(shí)間，同時(shí)會(huì)增加患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。有研究表明，在獲卵數(shù)≥15個(gè)的患者中，中重度OHSS的發(fā)生率約為正常人群的6.8倍，過多的獲卵數(shù)在增加OHSS風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)卵母細(xì)胞利用率下降的現(xiàn)象，即可移植胚胎的數(shù)量并沒有顯著增多，患者的臨床妊娠率沒有顯著提高[19-20]。

關(guān)于IVF助孕周期中最佳獲卵數(shù)的探索，既往多項(xiàng)研究結(jié)果顯示在新鮮胚胎移植周期和FET周期中，獲卵數(shù)與累積活產(chǎn)結(jié)局之間有著顯著的相關(guān)性，獲卵數(shù)在適當(dāng)范圍內(nèi)時(shí)可以獲得理想的臨床結(jié)局。Sunkara等[21]通過對(duì)40多萬個(gè)IVF周期助孕結(jié)局進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示獲卵數(shù)為0～15個(gè)時(shí)，患者累積活產(chǎn)率隨獲卵數(shù)增加而逐漸升高，而當(dāng)獲卵數(shù)>15個(gè)時(shí)，活產(chǎn)率呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)；在該預(yù)測(cè)模型中，年齡每增加1歲，則可活檢囊胚數(shù)和可移植囊胚數(shù)分別減少3.5%和5.6%；獲卵數(shù)是可活檢囊胚數(shù)和可移植胚胎數(shù)的良好預(yù)測(cè)因素，也與累積活產(chǎn)率顯著相關(guān)，卵母細(xì)胞數(shù)量增加1個(gè)，累積活產(chǎn)率增加6.0%。本研究在PGT-M/SR全組分析中發(fā)現(xiàn)每周期獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)及可移植囊胚數(shù)有顯著的相關(guān)性。在校正女方年齡、BMI、AMH及AFC后，對(duì)患者獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚進(jìn)行曲線擬合分析結(jié)果顯示，獲卵數(shù)與至少有1個(gè)可移植囊胚的概率關(guān)系顯著，隨著獲卵數(shù)的增多，可移植囊胚率逐漸增加；當(dāng)獲卵數(shù)>15時(shí)，接近100%有可移植囊胚。Vandervorst等[22]研究證實(shí)獲卵數(shù)與可活檢胚胎數(shù)及累積活產(chǎn)率呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示在PGT-M/SR助孕周期中每周期獲卵數(shù)與累積活產(chǎn)率顯著相關(guān)，每個(gè)取卵周期中獲卵數(shù)增加1個(gè)，累積活產(chǎn)率增加4.1%，與之前研究相似。同時(shí)在本研究中，可活檢囊胚數(shù)對(duì)可移植囊胚數(shù)有顯著影響，即每增加1個(gè)可活檢囊胚，至少有1個(gè)可移植囊胚的可能性增加15.5%，而每增加1個(gè)可移植囊胚，活產(chǎn)增加27.6%。進(jìn)一步對(duì)PGT-M/SR進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示每取卵周期獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)及可移植囊胚數(shù)之間均存在顯著的相關(guān)性；可移植囊胚數(shù)與累積活產(chǎn)率之間存在顯著的相關(guān)性，每周期增加1個(gè)可移植囊胚，累積活產(chǎn)率可以增加15%以上。因此，可活檢囊胚數(shù)及可移植囊胚數(shù)量對(duì)PGT-M/SR助孕結(jié)局具有重要的影響。本研究中，囊胚活檢、凍融移植后的累積活產(chǎn)率為53.14%，高于最新的歐洲生殖協(xié)會(huì)PGT指南報(bào)道的25%[23]?；町a(chǎn)率較高可歸因于納入本研究中的患者僅為需要進(jìn)行PGT-M和PGT-SR檢測(cè)的患者，而排除了因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等需要進(jìn)行PGT-A檢測(cè)的患者，而這一部分患者即使在胚胎檢測(cè)正常的情況下，也可能存在其他原因?qū)е碌呐咛o法著床或者流產(chǎn)的情況。

隨著年齡的增長(zhǎng)，卵巢儲(chǔ)備功能下降是育齡女性選擇輔助生殖助孕的重要原因之一。當(dāng)這些卵巢儲(chǔ)備功能下降的女性需要PGT-M/SR助孕時(shí)，經(jīng)常會(huì)被告知卵巢對(duì)促排卵藥物的反應(yīng)性差、周期取消的風(fēng)險(xiǎn)高[24]。通過本研究結(jié)果分析，根據(jù)促排卵周期的卵母細(xì)胞數(shù)和囊胚數(shù)可預(yù)測(cè)累積活產(chǎn)概率。湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，當(dāng)獲得10個(gè)卵母細(xì)胞時(shí)，至少有1個(gè)可移植囊胚的概率為62%；當(dāng)患者有3個(gè)可移植囊胚時(shí)，累積活產(chǎn)率約為57%(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，對(duì)于卵巢儲(chǔ)備功能減退的夫婦，可以進(jìn)行多次促排卵周期以獲得更多的卵母細(xì)胞、囊胚，并最終獲得可移植囊胚進(jìn)行移植。

本研究表明，PGT-M和PGT-SR助孕周期中，F(xiàn)ET累積活產(chǎn)率與每取卵周期的獲卵數(shù)、可活檢囊胚數(shù)和可移植囊胚數(shù)顯著相關(guān)。累積活產(chǎn)率隨獲卵數(shù)及可活檢囊胚數(shù)的增加而逐漸上升；當(dāng)每取卵周期獲卵數(shù)≥10個(gè)或者可移植囊胚數(shù)≥5個(gè)時(shí)，患者的累積活產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，不再增加。鑒于大多數(shù)PGT中心采用了囊胚活檢+凍融囊胚移植的方案，而FET周期可以有效地降低OHSS風(fēng)險(xiǎn)，因此采用更積極有效的卵巢刺激方法，把握卵巢刺激的強(qiáng)度，從多方面對(duì)獲卵數(shù)進(jìn)行調(diào)控，在有效性、安全性的前提下使可移植囊胚數(shù)量最大化，可以有效地提高患者的抱嬰回家率。